專利名稱：樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種人樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基和試劑盒。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞(Dendritc Cell，DC)是正常人體內(nèi)存在的一種具有強(qiáng)大的抗原提呈功能的一類特殊的細(xì)胞，被喻為機(jī)體的“天然佐劑”，能夠直接攝取、加工和呈遞抗原，刺激體內(nèi)的初始型T細(xì)胞活化，是機(jī)體免疫應(yīng)答的“啟動(dòng)者”。此外DC還可以通過直接或間接方式促進(jìn)B細(xì)胞的增殖與活化，調(diào)控體液免疫應(yīng)答；刺激記憶T細(xì)胞活化從而誘導(dǎo)再次免疫應(yīng)答；與NK相互作用影響非特異性的、天然免疫應(yīng)答。因此，DC是機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)的“始作俑者”。DC處于免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能攝取和加工處理抗原并調(diào)動(dòng)機(jī)體主動(dòng)特異性免疫反應(yīng)。
人體的免疫(immune)系統(tǒng)有三大免疫功能，即免疫防御、免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視。通過免疫防御，人體清除病原微生物及其他抗原性異物；通過免疫自穩(wěn)，人體清除損傷或衰老的細(xì)胞；通過免疫監(jiān)視，人體清除發(fā)生突變或惡變的細(xì)胞。免疫系統(tǒng)的這三種功能對(duì)于維持人體的生理平衡和身體健康十分重要。在一定條件下，免疫功能失調(diào)會(huì)使人體進(jìn)入疾病狀態(tài)，如發(fā)生惡性腫瘤。
健康的人體是一個(gè)由細(xì)胞構(gòu)成的有序社會(huì)，執(zhí)行特定功能的細(xì)胞分布在特定的區(qū)域。正常情況下，在這個(gè)社會(huì)里，細(xì)胞的增生僅發(fā)生在機(jī)體需要的時(shí)候，如造血細(xì)胞的更新，胚胎發(fā)育，損傷修復(fù)，免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞克隆的擴(kuò)張等，細(xì)胞的增生受到嚴(yán)格而精細(xì)的調(diào)控，在滿足肌體的需要后停止。惡性腫瘤細(xì)胞是在有序細(xì)胞社會(huì)中由正常細(xì)胞演化成的不法細(xì)胞，它具備兩個(gè)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞構(gòu)成重大傷害的特征1、無限制增生；2、增生的細(xì)胞侵占屬于其它細(xì)胞的領(lǐng)地。惡性腫瘤細(xì)胞的增生發(fā)生在機(jī)體不需要過多細(xì)胞的時(shí)候，使正常的細(xì)胞無法執(zhí)行正常的生理功能，最終毀滅整個(gè)細(xì)胞社會(huì)。
現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究表明，人體惡性腫瘤的發(fā)生是人體細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)或功能狀態(tài)發(fā)生改變的結(jié)果。原癌基因(Proto-oncogene)是正常細(xì)胞中的正?；?，其編碼產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的正常分化和增生十分重要。原癌基因(Proto-oncogene)在一定條件下可轉(zhuǎn)化為癌基因(Oncogene)。癌基因的結(jié)構(gòu)異常和過度活化可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡變的腫瘤細(xì)胞。發(fā)生了惡變的腫瘤細(xì)胞可出現(xiàn)的可人體免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的新物質(zhì)，這些新物質(zhì)被稱為腫瘤抗原。
腫瘤抗原可被分為兩類腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原。腫瘤特異性抗原是指只存在于某種腫瘤細(xì)胞而不存在于正常細(xì)胞或其它腫瘤細(xì)胞表面的抗原。此類抗原可用動(dòng)物腫瘤移植排斥試驗(yàn)證明，故又稱腫瘤特異性移植抗原。這種抗原可作為免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的靶點(diǎn)，它激發(fā)的免疫反應(yīng)(免疫監(jiān)視功能)可使整個(gè)腫瘤細(xì)胞受到免疫細(xì)胞的攻擊而被殺滅。腫瘤相關(guān)抗原是指非某一種腫瘤細(xì)胞特有、在其它腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞上也存在的抗原。此類抗原的表達(dá)量在發(fā)生腫瘤時(shí)明顯增加。如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)。這種抗原也可作為免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的靶點(diǎn)，它激發(fā)的免疫反應(yīng)(免疫監(jiān)視功能)可使高度表達(dá)此抗原整個(gè)腫瘤細(xì)胞受到免疫細(xì)胞的攻擊而被殺滅。
人體的免疫監(jiān)視功能依賴于人體的具有腫瘤殺傷活性的免疫細(xì)胞，在這些免疫細(xì)胞中，T淋巴細(xì)胞是最重要的。根據(jù)表面標(biāo)志和功能可將人類T細(xì)胞分為兩類。第一類為CD4+T細(xì)胞，輔助T細(xì)胞-1(Th1)和輔助T細(xì)胞-2(Th2)。第二類為CD8+T細(xì)胞，即細(xì)胞毒T細(xì)胞(Tc或CTL)。
若要激發(fā)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，腫瘤抗原必須在抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)內(nèi)被加工成小的肽段(腫瘤抗原肽)?？乖蔬f細(xì)胞是指能夠攝取、加工處理抗原，并將處理過的抗原呈遞給T、B淋巴細(xì)胞的一類免疫細(xì)胞。APC主要包括單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和病毒感染的靶細(xì)胞等。
APC對(duì)外源性抗原和內(nèi)源性抗原的提呈的途徑不同。APC對(duì)外源性抗原的加工處理和提呈的過程是(1)外源性抗原經(jīng)吞噬或吞飲作用，被APC攝入胞內(nèi)形成吞噬體，后者與溶酶體融合形成吞噬溶酶體；(2)抗原在吞噬溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境中被蛋白水解酶降解為小分子多肽，其中具有免疫原性的稱為抗原肽；(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的MHC II類分子進(jìn)入高爾基體后，由分泌小泡攜帶，通過與吞噬溶酶體融合，使抗原肽與小泡內(nèi)MHC II類分子結(jié)合形成抗原肽-MHC II類分子復(fù)合物；(4)該復(fù)合物表達(dá)于APC表面，可被相應(yīng)CD4+輔助性T細(xì)胞識(shí)別結(jié)合。
APC對(duì)內(nèi)源性抗原(內(nèi)源性抗原是指細(xì)胞自身合成的抗原，如腫瘤抗原和病毒蛋白抗原等)的加工處理和提呈的過程是內(nèi)源性抗原是指細(xì)胞自身合成的抗原，如腫瘤抗原和病毒蛋白抗原等。內(nèi)源性抗原加工處理和呈遞過程如下(1)內(nèi)源性抗原在細(xì)胞內(nèi)生成后，可被存在于胞質(zhì)中的蛋白酶體，即小分子聚合多肽體(LMP)降解成小分子多肽；(2)小分子多肽與熱休克蛋白70/90在胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合后，經(jīng)抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，通過加工修飾成為具有免疫原性的抗原肽；(3)抗原肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的MHC I類分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC I類分子復(fù)合物；(4)后者轉(zhuǎn)入高爾基體，再通過分泌小泡將其運(yùn)送到APC表面，供相應(yīng)CD8+T細(xì)胞識(shí)別結(jié)合。
T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答分為兩類，一類由CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo)，另一類由CD8+Tc細(xì)胞介導(dǎo)。
在由CD4+Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的過程中，CD4+Th細(xì)胞通過表面TCR-CD3復(fù)合物受體分子與APC表面相應(yīng)抗原肽-MHC II類分子復(fù)合物特異性識(shí)別、結(jié)合產(chǎn)生第一激活信號(hào)，CD4+Th細(xì)胞和APC表面的粘附分子互相作用產(chǎn)生第二激活信號(hào)。在上述兩個(gè)信號(hào)的作用下，CD4+Th細(xì)胞激活并表達(dá)IL-2、IL-4、IL-12的受體。與此同時(shí)，和CD4+Th細(xì)胞作用的APC合成分泌IL-1、IL-12等細(xì)胞因子。在以IL-12為主的細(xì)胞因子的作用下，CD4+Th細(xì)胞增殖分化為CD4+Th1細(xì)胞。
CD4+Th1細(xì)胞釋放IL-2、TNF、IFN-γ等細(xì)胞因子。IL-2刺激CD4+Th細(xì)胞增殖分化，活化NK細(xì)胞和CD8+Tc細(xì)胞。NK細(xì)胞是一類在腫瘤發(fā)生早期起作用的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，不需預(yù)先致敏就能殺傷腫瘤細(xì)胞。TNF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞使之表達(dá)粘附分子(ICAM-1等)，分泌IL-8和MCP-1。在粘附分子及趨化因子的作用下，血液中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞移行、粘附、外滲，在腫瘤答過程中，在靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)內(nèi)合成的多肽抗原在靶細(xì)胞內(nèi)加工后與自身MHC I類分子結(jié)合并運(yùn)送到靶細(xì)胞的表面。Tc細(xì)胞通過表面TCR-CD3復(fù)合受體識(shí)別并結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原肽-MHC I類分子復(fù)合物，產(chǎn)生Tc細(xì)胞的第一激活信號(hào)。在腫瘤細(xì)胞表面常缺乏協(xié)同刺激分子，不能刺激CD8+Tc細(xì)胞產(chǎn)生第二活化信號(hào)。在這種情況下，第一活化信號(hào)可使CD8+Tc細(xì)胞表達(dá)IL-2和γ-IFN受體。該種CD8+Tc細(xì)胞接受活化CD4+T細(xì)胞分泌的IL-2和γ-IFN作用后被激活，表達(dá)IL-12等細(xì)胞因子的受體。如果靶細(xì)胞(如APC)表面表達(dá)協(xié)同刺激分子(B7，ICAM-1，LFA-3)，則可與CD8+Tc細(xì)胞表面相應(yīng)受體(CD28，LFA-1，LFA-2)結(jié)合二產(chǎn)生CD8+Tc細(xì)胞激活的第二信號(hào)，使其表達(dá)IL-12等細(xì)胞因子的受體。上述活化的CD8+Tc細(xì)胞在接受細(xì)胞巨噬細(xì)胞分泌的IL-12和γ-IFN等細(xì)胞因子的作用后，可進(jìn)一步增殖分化為效應(yīng)性Tc細(xì)胞。效應(yīng)性Tc細(xì)胞識(shí)別、結(jié)合表達(dá)特異性抗原物質(zhì)的靶細(xì)胞將其裂解。一個(gè)Tc細(xì)胞可連續(xù)殺傷多個(gè)靶細(xì)胞。激活的Tc細(xì)胞表達(dá)的穿孔素蛋白、顆粒酶和Fas配體是Tc細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞重要介質(zhì)，前者使靶細(xì)胞發(fā)生滲透性裂解，后兩者啟動(dòng)靶細(xì)胞的程序性死亡。由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)CD8+的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是重要的腫瘤殺傷細(xì)胞，其殺傷機(jī)制有二一是通過其抗原受體識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的腫瘤抗原，并在CD4+的輔助性T淋巴細(xì)胞的輔助下活化后直接殺傷腫瘤細(xì)胞；二是活化的CD8+的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌γ-干擾素(IFN-γ)，腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子間接殺傷腫瘤細(xì)胞。
在國際上，已應(yīng)用回輸法進(jìn)行治療的腫瘤有非霍杰金淋巴瘤，黑色素瘤，前列腺癌及多發(fā)性骨髓瘤。
美國是研究樹突狀細(xì)胞治療惡性腫瘤最多、也是最領(lǐng)先的國家。美國西雅圖華盛頓大學(xué)的研究小組，對(duì)33位已發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者進(jìn)行了樹突狀細(xì)胞的治療的臨床II期實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是2位的腫瘤灶全部消失，6位的原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤灶明顯縮小。美國斯坦福大學(xué)的兩個(gè)科研小組，分別在多發(fā)性骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞患者的樹突狀細(xì)胞的治療方面作出了領(lǐng)先的工作。美國邁阿密大學(xué)的科研小組用宮頸癌特異性的多肽轉(zhuǎn)載的樹突狀細(xì)胞在體外誘生出了具有強(qiáng)效抗腫瘤活性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的克隆。
德國和其它國家研究現(xiàn)狀來自德國和瑞典的聯(lián)合小組對(duì)16例晚期黑色素瘤病人進(jìn)行了樹突狀細(xì)胞的治療，有5例取得一定的治療效果，其中2例患者表現(xiàn)為多個(gè)器官的黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶完全消退，另3例表現(xiàn)為部分消退。瑞士的蘇黎世醫(yī)科大學(xué)的科研小組在黑色素瘤病人的樹突狀細(xì)胞治療方面取得了進(jìn)展。奧地利的Innsbruck大學(xué)的研究小組，用轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌細(xì)胞裂解物裝載的樹突狀細(xì)胞在腎細(xì)胞癌患者誘導(dǎo)出了強(qiáng)烈的抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)。
樹突狀細(xì)胞應(yīng)用于抗感染免疫也取得了一定的療效，采用抗原致敏的樹突狀細(xì)胞回輸療法治療乙型肝炎、自身免疫性疾病等均在研究中。
我國近年來對(duì)樹突狀細(xì)胞的研究與開發(fā)應(yīng)用也日漸深入。采用樹突狀細(xì)胞瘤苗治療腫瘤已經(jīng)取得了一定的成果，國家藥品監(jiān)督管理局目前也正式批準(zhǔn)樹突狀細(xì)胞治療腫瘤進(jìn)入臨床I期研究，可以預(yù)見，樹突狀細(xì)胞治療腫瘤及感染性疾病將形成巨大的市場，具有顯著的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。
樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)是樹突狀細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床研究的關(guān)鍵步驟之一，目前盡管已經(jīng)形成了較為成熟的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法，例如目前已經(jīng)有多種方法可以獲得人樹突狀細(xì)胞。
一種常用的獲得樹突狀細(xì)胞的方法從CD34+干細(xì)胞中誘導(dǎo)DC分化骨髓、臍帶血中含有相對(duì)較多的CD34+細(xì)胞，在GM-CSF和TNF-α的微環(huán)境中誘導(dǎo)2周后，能夠分化為CD1a+CD83+HLA-DR+的成熟DC，并且具有擴(kuò)增作用，約10-30倍的起始細(xì)胞量。加入IL-4可以增加DC細(xì)胞的純度，但不能夠擴(kuò)增產(chǎn)量，但Flt-3、SCF、或IL-3能夠大大提高收獲的DC細(xì)胞量。在早期的培養(yǎng)過程中，有足夠數(shù)量的處于增殖期的DC用于基因轉(zhuǎn)染；但這種方法需要大量的細(xì)胞因子，花費(fèi)較高。
另一種方法是分離外周血中DC。由于DC不表達(dá)特異性抗體，可以通過各系細(xì)胞特異性抗體陰性選擇出DC(去除外周血單個(gè)核細(xì)胞中的T、B、NK及單核細(xì)胞)；或者通過成熟DC表達(dá)CD83、CMRF-44分子的特性分離活化的DC。此外由于DC的密度較低，也可以應(yīng)用甲基泛影葡胺梯度離心富集DC。從外周血中直接分離DC，簡單快速，可以不經(jīng)過體外長期培養(yǎng)的過程直接獲得，并且具有較強(qiáng)的同種刺激T細(xì)胞增殖的活性。
也有人從外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)DC。從單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC分化成熟的各個(gè)時(shí)期目前了解比較清楚，容易控制。GM-CSF和IL-4可以誘導(dǎo)CD14+的單核細(xì)胞向DC分化，培養(yǎng)5-7天后即可獲得CD1a+CD83-的未成熟DC，具有較強(qiáng)的吞噬能力。加入TNFα、CD40L后可以促進(jìn)DC成熟。盡管在數(shù)量上單核細(xì)胞向DC分化沒有擴(kuò)增效應(yīng)，但外周血中含有大量的單核細(xì)胞并且可以通過其貼壁特性而分離，所以為多數(shù)臨床試驗(yàn)采用。此外用GM-CSF、G-CSF動(dòng)員后的外周血中單核細(xì)胞的比例更高，并且含有一定數(shù)量的前體細(xì)胞，能夠獲得增殖。但缺點(diǎn)是得率低，成熟所需時(shí)間長。
綜上所述，目前的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法較為復(fù)雜，采用的試劑較多，標(biāo)準(zhǔn)各不一致，培養(yǎng)時(shí)間較長，難以形成簡便的培養(yǎng)方法。因此，另外許多研究者很難在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出質(zhì)量均一的樹突狀細(xì)胞。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的高效、快速制備樹突狀細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效、快速制備樹突狀細(xì)胞的方法及其相關(guān)的培養(yǎng)基和試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物，它含有人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子，且人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(3±0.5)，且人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子占組合物總重量的0.1-90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.2)。
本發(fā)明還提供了一種樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子組合物，它含有人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70，且人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(8±2)，且人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70占組合物總重量的0.1-90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(8±1)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基，它含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長必需的碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)和水，以及本發(fā)明上述的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物，且人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml。
還提供了一種用于誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基，它含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長必需的碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)和水，以及本發(fā)明上述的樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子組合物，且人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，它含有容器和裝于容器中的本發(fā)明上述的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物或含該組合物的樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基。
還提供了一種樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，它含有容器和裝于容器中的本發(fā)明上述的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物或含該組合物的樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基。
在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中同時(shí)含有本發(fā)明的兩種誘導(dǎo)因子組合物或相應(yīng)的培養(yǎng)基。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中所含的培養(yǎng)基包括兩種誘導(dǎo)因子組合物和無血清樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備樹突狀細(xì)胞的方法，包括以下步驟(a)在37±1℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞2-4天，其中培養(yǎng)基中人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml，且人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(3±0.5)，獲得樹突狀細(xì)胞；(b)在37±1℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)步驟(a)中獲得的樹突狀細(xì)胞2-5天，其中培養(yǎng)基中人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml，且人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(8±2)，從而使樹突狀細(xì)胞成熟(c)分離成熟的樹突狀細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.2)；且所述的人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(8±1)。


圖1是人IL-4的純化色譜圖。
圖2是人HSP70SDS-PAGE圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明經(jīng)過深入而廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，在特定比例的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，可以顯著提高樹突狀細(xì)胞的得率。此外，在特定比例的樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子組合下培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞，可以顯著縮短樹突狀細(xì)胞成熟所需的時(shí)間。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
制備成熟的樹突狀細(xì)胞分二個(gè)階段即形成階段和成熟階段。
用于形成的階段的特定因子組合是人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子。較佳地，人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(3±0.5)，，更佳地為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.2)。
在本發(fā)明中，即(1±0.2)∶(1±0.2)∶(3±0.5)的比例表示0.8-1.2∶0.8-1.2∶2.5-3.5，其他比例依此類推。
在一優(yōu)選例中，人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子構(gòu)成的混合物中，每毫克誘導(dǎo)因子中含hGM-CSF600微克、hIL-4為200微克、hSCF200微克。
用于成熟階段的特定因子組合是人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70。較佳地，人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(8±2)，更佳地為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(8±1)。
在一優(yōu)選例中，人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70構(gòu)成的混合物中，每毫克誘導(dǎo)因子中含hTNFα100微克，γ-干擾素100微克和hHSP70800微克用于本發(fā)明的上述六種因子可以購得，也可以用本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
除了上述六種因子，本發(fā)明的上述兩種誘導(dǎo)因子混合物中還可含有其他物質(zhì)，如水、防腐劑、抗氧化劑等添加劑。
本發(fā)明還提供了含有上述樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物和/或樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子組合物的培養(yǎng)基。
本發(fā)明還提供了含有上述樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物和/或樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子組合物，或相應(yīng)培養(yǎng)基的試劑盒。
一種優(yōu)選的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包括容器，以及分別位于各容器內(nèi)的人樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基、樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子、樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子、樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)袋、樹突狀細(xì)胞保存管、細(xì)胞運(yùn)輸盒。
一種優(yōu)選的人樹突狀細(xì)胞專用培養(yǎng)基是一種不含動(dòng)物蛋白的無血清培養(yǎng)基，其配方如表3所示。當(dāng)然，其他常用于樹突狀細(xì)胞的必需培養(yǎng)基也可用于本發(fā)明。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于，(a)顯著提高樹突狀細(xì)胞的得率。樹突狀細(xì)胞的得率比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法提高2-5倍；(b)顯著縮短樹突狀細(xì)胞的成熟的時(shí)間，成熟時(shí)間縮短為3-5天。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、人樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子的制備用作人樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子包括三種rhIL-4、hSCF、hGM-CSF，它們可以從諸如Simga等公司購得，也可以按常規(guī)方法制備。在本實(shí)施例中，為了獲得更純的IL-4，對(duì)含IL-4的大腸桿菌發(fā)酵液進(jìn)行了如下純化(1)重組人白細(xì)胞介素-4的純化將表達(dá)IL-4的大腸桿菌工程菌發(fā)酵培養(yǎng)后，收集菌體，稱重后按加入1∶20比例加入50mM Tris/HCl，pH＝8.0，1mM EDTA緩沖液，超聲破菌。離心后收集沉淀，將收集的沉淀包涵體用含有2％Triton-X100的緩沖液洗滌兩遍，溶解于含5M鹽酸胍的50mM Tris/HCl，pH＝8.0，1mM EDTA緩沖液中。包涵體溶解2小時(shí)后離心去除沉淀，將上清液按1∶10(vol/vol)緩慢加入到50mM Tris/HCl，pH＝8.0，1mM EDTA，1mM PMSF，0.2M鹽酸胍，0.5M精氨酸，1mM GSH/0.5mMGSSG復(fù)性用緩沖液中，在室溫下復(fù)性24小時(shí)。去除沉淀后的上清液，采用Pellicon超濾膜胞(分子量5000Dal)，濃縮并轉(zhuǎn)換至緩沖液50mM Tris/HCl，PH＝8.0+0.10M NaCl。最后經(jīng)HitrapQ-Sepharose陰離子柱層析及Sour15 S陽離子柱層析純化，純化后獲得的重組人IL-4的純度大于98％，內(nèi)毒素含量＜1EU/mg。
Q-Sepharose陰離子柱層析層析柱HitrapQ-Sepharose FF柱5ml層析儀器Akta Explore100層析系統(tǒng)緩沖液A50mM Tris/HCl，PH＝8.0+0.10M NaCl樣品處理所有的樣品及緩沖液均預(yù)溫至4℃，層析在4℃進(jìn)行洗脫及組分收集采用緩沖液柱平衡后，直接上樣，收集直接收集未結(jié)合組分。
Source15S陽離子柱層析層析柱ReSourceS 1ml柱層析儀器Akta Explore100層析系統(tǒng)緩沖液A50mM PH＝4.5醋酸鈉緩沖液緩沖液A50mM PH＝4.5醋酸鈉緩沖液+1M NaCl樣品處理將上步收集的樣品加入4倍體積的50mM PH＝4.5醋酸鈉緩沖液稀釋后上樣洗脫上樣后采用含1M NaCl的50mM PH＝4.5醋酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集所需的組分。
純化的IL-4純化色譜結(jié)果如圖1所示。表明獲得了IL-4純品(純度大于99％)。
(2)人樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子的制備將如上制備的IL-4與購買的hSCF、hGM-CSF按以下重量比混合，再加入4％重組人白蛋白，凍干后備用。
表1人樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子的配方


實(shí)施例2、人樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子的制備用作人樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子包括三種γ-干擾素、人TNF-α、和人HSP70，它們可以從諸如Simga等公司購得，也可以按常規(guī)方法制備。在本實(shí)施例中，為了獲得更純的Hsp70和降低成本，對(duì)含Hsp70的大腸桿菌發(fā)酵液進(jìn)行了如下純化(1)重組人熱休克蛋白-70純化用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA作為模板。根據(jù)公開的Hsp70序列合成引物，通過PCR獲得Hsp70的編碼序列，然后將其插入表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的多克隆位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株。根據(jù)卡那霉素抗性(Kanr)篩選轉(zhuǎn)化子。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM，以誘導(dǎo)Hsp70的表達(dá)。
HSP70是一種親水性較強(qiáng)的酸性蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)后多以可溶性形式存在。通過高壓勻漿方法破菌后，高速冷凍離心收集上清。通過低濃度乙醇沉淀、DEAE陰離子交換、Phenyl-Sepharose疏水柱層析及S200凝膠過濾柱層析后，使最終制備的rhHSP70的純度達(dá)95％以上。
DEAE-Sepharose柱層析層析柱DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)，2.6×10cm層析儀器Akta Explore100層析系統(tǒng)樣品名稱及處理所有的樣品及緩沖液均預(yù)溫至4℃，層析在4℃進(jìn)行緩沖液A50mM Tris/HCl，pH＝8.0 1mM EDTA緩沖液B50mM Tris/HCl，pH＝8.0 1mM EDTA+1M NaCl洗脫方案流速4ml/min柱平衡10個(gè)柱體積，上樣后用20％B液洗脫含HSP70組分，再用100％B液洗脫雜質(zhì)后，用0.5N NaOH溶液洗層析柱5個(gè)柱體積。
Phenyl-Sepharose HP疏水柱層析層析柱Phenyl-Sepharose HP(Pharmacia)，2.6×10cm層析儀器Akta Explore100層析系統(tǒng)樣品名稱及處理在陰離子柱層析所得的組分中加入固體硫酸銨至終濃度為1.5M，靜置30min后離心去除沉淀，樣品及緩沖液均預(yù)溫至4℃，層析在4℃進(jìn)行緩沖液A50mM Tris/HCl，pH＝7.5 1mM EDTA+1.5M(NH4)2SO4緩沖液B50mM Tris/HCl，pH＝7.5 1mM EDTA洗脫方案流速4ml/min柱平衡10個(gè)柱體積，上樣后用A液洗至紫外吸收值到基線水平后，用0-100％B液在20個(gè)柱體積內(nèi)作線性梯度洗脫，收集含HSP70的組分，再用100％B洗脫5個(gè)柱體積，0.5M氫氧化鈉清洗層析柱。
Sephacryl S-200 HP柱層析層析柱Sephacryl S-200 HR(Pharmac ia)，2.6×100cm層析儀器Akta Explore100層析系統(tǒng)洗脫方案流速為1ml/min，收集所需的組分上樣量25ml疏水柱后收集的組分收集所需的組分。
純化的Hsp70的SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示。檢測結(jié)果表明獲得了HSP70純品(純度大于95％)。
(2)人樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子的制備將如上制備的Hsp70與購買的γ-干擾素、人TNF-α按以下重量比混合，再加入4％重組人白蛋白，凍干后備用。
表2人樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子的配方

實(shí)施例3、OVA抗原致敏的樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞約20ml，緩慢加入預(yù)加20ml淋巴細(xì)胞分離液的50ml Falcon離心管(細(xì)胞懸液體積與分離液體積相等)，后400×g室溫離心30分鐘，用平口巴氏滴管吸取界面細(xì)胞，加入到30ml RPMI1640培養(yǎng)基中，200×g離心10分鐘，洗滌3遍，收取細(xì)胞。
將經(jīng)離心洗滌的單個(gè)核細(xì)胞用含樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基配成4×106/ml的細(xì)胞懸液，種入樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)袋，將盛有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置37℃、5％二氧化碳，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁2小時(shí)。將培養(yǎng)袋取出，輕輕搖晃十?dāng)?shù)次，使非貼壁細(xì)胞懸起，棄去懸浮細(xì)胞，再緩慢往袋中加入10ml RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)洗去殘留非貼壁細(xì)胞。
往保留貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)袋中加入30ml 60ng/ml樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基(即三種樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子的總濃度為60ng/ml培養(yǎng)液，三種因子的配方見表1)，置5％二氧化碳，37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
培養(yǎng)至第3天，往培養(yǎng)袋中補(bǔ)充20ml含60ng/ml樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子的樹突狀細(xì)胞新鮮培養(yǎng)基(即三種樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子的總濃度為60ng/ml培養(yǎng)液，三種因子的配方見表2)，繼續(xù)培養(yǎng)1天。在培養(yǎng)的第4天，可見細(xì)胞變?yōu)槊虪睿⒕奂蓤F(tuán)，加入OVA抗原50μg/ml，培養(yǎng)6小時(shí)，用50ml注射器補(bǔ)充樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子15μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)1天，用50ml注射器在培養(yǎng)袋輕輕吹打培養(yǎng)袋底部，使部分半貼壁的樹突狀細(xì)胞懸起，將培養(yǎng)液吸入50ml離心管，200×g離心10分鐘，收取細(xì)胞，該細(xì)胞即為OVA抗原致敏的樹突狀細(xì)胞。
用于本實(shí)施例的無血清樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基的組成如表3所示。
表3無血清樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基的組成(g/L)


結(jié)果(a)在表1的各種人樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子配方下，本發(fā)明方法均能夠顯著提高樹突狀細(xì)胞的得率。最終樹突狀細(xì)胞的得率比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法提高2-5倍；(b)在表2的各種人樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子的配方下，本發(fā)明方法均能顯著縮短樹突狀細(xì)胞的成熟的時(shí)間，一般樹突狀細(xì)胞的分化成熟需要7天左右，采本發(fā)明方法可以縮短為3-5天(平均4天)。其重要機(jī)理在于采用伽馬干擾素與HSP70共同作用，可以減少樹突狀細(xì)胞抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而縮短樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)周期。
實(shí)施例4、OVA抗原致敏的樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)重復(fù)實(shí)施例3的步驟，不同點(diǎn)僅在于，培養(yǎng)過程中樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子總濃度由60ng/ml變?yōu)?0ng/ml或90ng/ml(配方1a)；或者樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子總濃度由60ng/ml變?yōu)?0ng/ml或90ng/ml(配方1b)。
結(jié)果在40ng/ml或90ng/ml的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子總濃度下，同樣顯著提高樹突狀細(xì)胞的得率，最終樹突狀細(xì)胞的得率比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法提高2倍和6倍；在在40ng/ml或90ng/ml的樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子總濃度下，同樣均能顯著縮短樹突狀細(xì)胞的成熟的時(shí)間，為5天或4天。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物，其特征在于，它含有人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，且人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(3±0.5)，且人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子占組合物總重量的0.1-90％。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.2)。
3.一種樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子組合物，其特征在于，它含有人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70，且人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(8±2)，且人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70占組合物總重量的0.1-90％。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(8±1)。
5.一種樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基，它含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長必需的碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)和水，其特征在于，它還含有權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物，且人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml。
6.一種樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基，它含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長必需的碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)和水，其特征在于，它還含有權(quán)利要求3所述的樹突狀細(xì)胞成熟誘導(dǎo)因子組合物，且人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml。
7.一種樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，其特征在于，它含有容器和裝于容器中的權(quán)利要求1所述的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物或權(quán)利要求5所述的樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基。
8.一種樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，其特征在于，它含有容器和裝于容器中的權(quán)利要求2所述的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)因子組合物或權(quán)利要求6所述的樹突狀細(xì)胞液態(tài)培養(yǎng)基。
9.一種制備樹突狀細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)在37±1℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞2-4天，其中培養(yǎng)基中人白細(xì)胞介素4、人干細(xì)胞刺激因子和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml，且人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(3±0.5)，獲得樹突狀細(xì)胞；(b)在37±1℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)步驟(a)中獲得的樹突狀細(xì)胞2-5天，其中培養(yǎng)基中人腫瘤壞死因子-α、人γ-干擾素和人熱休克蛋白70在培養(yǎng)基中的總濃度為40-90ng/ml，且人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.2)∶(1±0.2)∶(8±2)，從而使樹突狀細(xì)胞成熟(c)分離成熟的樹突狀細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的人白細(xì)胞介素4∶人干細(xì)胞刺激因子∶人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.2)；且所述的人腫瘤壞死因子-α∶人γ-干擾素∶人熱休克蛋白70的重量比為(1±0.1)∶(1±0.1)∶(8±1)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基和試劑盒。本發(fā)明方法用于樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)，具有操作方便，單核細(xì)胞誘導(dǎo)成樹突狀細(xì)胞比例高，長時(shí)間培養(yǎng)不易污染以及縮短樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)成熟時(shí)間等特點(diǎn)?？蓱?yīng)用于樹突狀細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用研究。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1609195SQ20031010799
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者高斌 申請(qǐng)人:高斌