專(zhuān)利名稱：人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面dec-205分子的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
治療性抗體藥物已成為生物制藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)。細(xì)胞融合篩選單克隆抗體技術(shù)自發(fā)明以來(lái)受到廣泛的應(yīng)用，目前已成為制備抗體的一種最基本也是最高效的方法。然而細(xì)胞融合的方法大多僅限于動(dòng)物，如大鼠、兔、羊等。通過(guò)免疫動(dòng)物獲得較豐富的抗原特異性的漿細(xì)胞，然后進(jìn)行脾細(xì)胞融合，篩選出分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞。這種方法所產(chǎn)生的抗體為非人源抗體，如果作為藥物應(yīng)用于人體會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的排斥反應(yīng)，因此必須進(jìn)行人源化改造。抗體人源化改造是指將抗體中非人源的氨基酸替換成人源的氨基酸。為了不改變抗體的結(jié)合特異性，通常保留抗體的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R。因此，常見(jiàn)的方法是⑶R-graft :即將抗體的CDR區(qū)移植到人源抗體的骨架區(qū)之中，這樣既保留抗體的結(jié)合特異性，又最低程度的減少非人源氨基酸，避免機(jī)體的針對(duì)抗體本身的免疫反應(yīng)?？贵w經(jīng)過(guò)CDR-graft之后親和力通常會(huì)下降，通過(guò)對(duì)抗體構(gòu)象關(guān)鍵的氨基酸改造可以恢復(fù)抗體的親和力。人源化成功的抗體應(yīng)該具備與鼠源親本抗體相當(dāng)?shù)挠H和力。DEC-205分子是表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞表面的一種模式識(shí)別分子，它能夠識(shí)別特定種類(lèi)的抗原物質(zhì)。機(jī)體免疫系統(tǒng)要消滅外源 物質(zhì)的入侵，必須依靠抗原呈遞細(xì)胞識(shí)別外源物質(zhì)，并將抗原加工呈遞給免疫反應(yīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)針對(duì)抗原的特異的免疫反應(yīng)。DEC-205分子能夠通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞將抗原分子吞噬到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行加工處理，然后和MHCI類(lèi)分子及MHCII類(lèi)分子結(jié)合呈遞至細(xì)胞表面。將抗原分子與DEC-205抗體偶聯(lián)，可以通過(guò)DEC-205抗體的靶向識(shí)別使得抗原分子能夠主動(dòng)的識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞，從而增加抗原遞呈細(xì)胞的遞呈效率，加強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)強(qiáng)度。在一些慢性感染性疾病中，如HBV，HIV等，機(jī)體的免疫功能低下，細(xì)胞免疫缺陷。通過(guò)將病毒特異性抗原與DEC-205抗體偶聯(lián)，能夠誘導(dǎo)出針對(duì)病毒的特異的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的清除。DEC-205抗體作為載體在慢性感染性疾病的預(yù)防與治療中發(fā)揮作用。目前針對(duì)癌癥的免疫治療中，以提高癌癥細(xì)胞特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)為主要策略。DEC-205抗體在其中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體，該抗體作為病原抗原的載體，能和抗原偶聯(lián)，促進(jìn)抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。為達(dá)到上述目的，通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體，該抗體的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R具有如下序列⑶Rl:序列表中SEQ ID NO 3 <DR2:序列表中SEQ ID NO4 ;以及⑶R3:序列表中SEQ ID NO 5 ;該抗體的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R具有如下序列:CDR1:序列表中SEQ ID NO 6 ;CDR2:序列表中SEQ ID NO 7 ;以及CDR3:序列表中SEQID NO 8。該抗體的重鏈具有如序列表中SEQ ID NO I所示的氨基酸序列，該抗體的輕鏈具有如序列表中SEQ ID NO 2所不的氣基酸序列。本發(fā)明所述的人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟
用RT-PCR的方法從人外周血擴(kuò)增出DEC-205基因，克隆到p⑶NA3.1表達(dá)載體上，在YB2/0細(xì)胞中表達(dá)；
利用細(xì)胞免疫大鼠，然后分離脾細(xì)胞，與雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，通過(guò)流式檢測(cè)的方法篩選出分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞克??；
用5’ RACE的方法從雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體基因，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，找出抗體的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R序列，經(jīng)過(guò)人源化改造，產(chǎn)生人源化的DEC-205分子的單克隆抗體。本發(fā)明還包括對(duì)上述抗體的氨基酸序列通過(guò)對(duì)氨基酸殘基的添加、刪除、修改形成的包含有本發(fā)明所述抗體的⑶R區(qū)序列并具有相同功能或改造及優(yōu)化的一切抗體，包括人源與非人源抗體、改造的單鏈(scFv)抗體；以及含有本發(fā)明所述的單個(gè)重鏈CDR區(qū)的其他抗體片段或含有本發(fā)明所述的單個(gè)輕鏈CDR區(qū)的其他抗體片段。本發(fā)明的人源化DEC-205抗體能夠識(shí)別人外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞，并引起樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)該抗體的內(nèi)吞 。本發(fā)明的人源化DEC-205抗體能夠作為抗原的載體，用于病毒感染性疾病和癌癥的預(yù)防性疫苗及免疫治療性抗體藥物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所述的人源化DEC-205抗體能夠主動(dòng)識(shí)別表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體分子DEC-205，并引起抗原遞呈細(xì)胞的內(nèi)吞效應(yīng)。以該抗體作為載體能夠特異性地并且高效地將抗原物質(zhì)運(yùn)輸至抗原遞呈細(xì)胞表面，并引起抗原遞呈細(xì)胞對(duì)該抗原的內(nèi)吞、加工、遞呈，從而增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞的遞呈效率，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。該抗體作為載體在免疫反應(yīng)底下為特點(diǎn)的各種疾病中具有潛在的應(yīng)用前景。


下面根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是流式細(xì)胞儀檢測(cè)DECl細(xì)胞系表達(dá)DEC-205分子，染色抗體MG38 (PE，BD公司)。;
圖2為大鼠血清中抗體檢測(cè)，采集免疫后大鼠血清，與DECl細(xì)胞孵育，加FITC標(biāo)記抗大鼠二抗檢測(cè)；
圖3為單克隆抗體172檢測(cè)，取172克隆號(hào)的細(xì)胞培養(yǎng)上清與DECl細(xì)胞孵育，加FITC標(biāo)記抗大鼠二抗檢測(cè)；
圖4為抗體表達(dá)；
圖5為抗體與人DC細(xì)胞結(jié)合；
圖6為DEC-205被人DC細(xì)胞吞噬，DEC-205抗體用FITC標(biāo)記，人DC細(xì)胞先標(biāo)記上APC-CDllc抗體，在加入DEC-205抗體，分別在37°C和4°C孵育，37°C條件下，綠色的抗體被DC細(xì)胞吞噬到胞內(nèi)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施例所述的人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體的制備過(guò)程包括以下步驟1.免疫抗原的制備
設(shè)計(jì)引物將DEC-205分子的N端SP、Fn、CR區(qū)及C端的跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)分別擴(kuò)增出來(lái)，用overlap PCR將兩個(gè)片段連接起來(lái)，插入到表達(dá)載體pCDNA3.1中。插入位點(diǎn)Xbal1、EcoRI。擴(kuò)增引物分別為
DECll TGCTCTAGAGCCACCATGAGGACAGGCTGG,
DEC12 : TATCCTCCCTCGGAGGGAGGCTTTAAGCAGATGCC,
DEC21 CTCCCTCCGAGGGAGGATACACAGCAATAGCTATC,
DEC22 :CTCCCTCCGAGGGAGGATACACAGCAATAGCTATC。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染YB2/0細(xì)胞系，G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系DEC1，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)結(jié)果。如圖1所示。2.收集DECl細(xì)胞免疫大鼠 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DECl細(xì)胞，用生理鹽水洗3遍，與免疫佐劑混合，充分乳化，用于免疫6-8周的lewis品系大鼠。大鼠免疫采取腹腔注射。免疫兩次，之間間隔三周，每次免疫用10~8細(xì)胞，用Iml生理鹽水混合加Iml完全免疫佐劑CFA乳化。在取大鼠做實(shí)驗(yàn)前一周加強(qiáng)免疫一次，用5 X 10~7細(xì)胞與不完全免疫佐劑IFA乳化。實(shí)驗(yàn)之前，采血檢測(cè)血清中抗體含量，如圖2所示。3.細(xì)胞融合及篩選單克隆
將大鼠處死并分離脾臟細(xì)胞。采用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞融合方法，將脾臟細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。用HAT選擇培養(yǎng)基懸浮起細(xì)胞，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板之中培養(yǎng)。培養(yǎng)8-10天，顯微鏡下觀察到有單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)出的細(xì)胞團(tuán)時(shí)，去細(xì)胞培養(yǎng)上清用流式檢測(cè)分泌抗體的克隆。流式檢測(cè)用細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育DECl細(xì)胞，加FITC標(biāo)記的抗大鼠二抗檢測(cè)。篩選出分泌抗體的細(xì)胞克隆做進(jìn)一步的擴(kuò)大培養(yǎng)。篩選出克隆號(hào)172的大鼠抗人DEC-205單克隆抗體，如圖3所示。4. 5’ RACE方法擴(kuò)增抗體基因
收集10~7細(xì)胞提取RNA，用oligo-T引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA純化后100°C加熱I分鐘，然后用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT transferase, promega),加IOuM dGTPs, 37°C反應(yīng)I小時(shí)，然后加熱至70°C，10分鐘滅活末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶。以此為模板擴(kuò)增抗體基因。擴(kuò)增抗體重鏈基因引物為Anchor和H,擴(kuò)增抗體輕鏈基因引物為Anchor和L。 Anchor CGTCGATGAGCTCTAGAATTCGCATGTGCAAGTCCGATGGTCCCCCCCCCCCCCCLAGGATGATGTCTTATGAACAAH TCACATTGAGCTTGCTGTA
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，將電泳膠中的條帶進(jìn)行膠回收，連接到T載體中進(jìn)行測(cè)序。
5.生物信息學(xué)分析抗體序列及人源化
擴(kuò)增出的抗體基因測(cè)序，經(jīng)過(guò)blast比對(duì)分析找出抗體的重鏈和輕鏈完整編碼區(qū)。然后經(jīng)過(guò)MGT網(wǎng)站分析，確定抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)V和恒定區(qū)C，以及互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1，⑶R2，⑶R3。通過(guò)比對(duì)分析找出與該大鼠可變區(qū)V同源性最高的人源抗體序列(NCBI No.)。以此抗體為骨架，將鼠源抗體的⑶R區(qū)移植構(gòu)成一個(gè)完整的抗體序列。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，做如下定點(diǎn)突變以恢復(fù)抗體的親和力。6.抗體表達(dá)
將人源化的抗體重鏈和輕鏈基因的可變區(qū)通過(guò)PCR引物擴(kuò)增出來(lái)，末端加上酶切位點(diǎn)，分別插入到抗體表達(dá)載體MH和MK中。將構(gòu)建好的表達(dá)載體進(jìn)行質(zhì)粒抽提，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。重鏈和輕鏈表達(dá)載體以摩爾比1:1混合，加入轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000混勻,力口入到培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中。每?jī)商焓占?xì)胞上清，換上新鮮培養(yǎng)液。收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)過(guò)超濾離心濃縮，proteinG柱純化出抗體。用蛋白膠檢測(cè)抗體的表達(dá)，用流式染色的方法檢測(cè)表達(dá)的抗體的親和性。如圖4所示。7.抗體功能驗(yàn)證
用流式染色的方法來(lái)檢測(cè)抗DEC-205抗體對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞DC的親和性。用Ficoll密度梯度離心從人的外周血分離出PBMC，磁珠分選出⑶14陽(yáng)性單核細(xì)胞，加細(xì)胞因子誘導(dǎo)成DC細(xì)胞。用DEC-205抗體與DC細(xì)胞孵育，加入FITC標(biāo)記二抗，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體對(duì)人DC細(xì)胞的親和性。結(jié)果見(jiàn)圖5所示。用SPR技術(shù)測(cè)定抗體的親和力
將抗人二抗偶聯(lián)到CM5芯片上，R U值達(dá)到。將抗體以六個(gè)濃度梯度1000nM、500nM、250nM、125nM、62. 5nM流過(guò)芯片表面，記錄信號(hào)。經(jīng)過(guò)軟件分析得出抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如表1:
表I DEC-205抗體的親和常數(shù)
權(quán)利要求
1.一種人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體，其特征在于，該抗體的重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R具有如下序列⑶Rl:序列表中SEQ ID NO 3，⑶R2:序列表中SEQ ID NO 4，以及⑶R3:序列表中SEQ ID NO 5 ;該抗體的輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有如下序列:CDR1:序列表中SEQ ID NO 6，CDR2:序列表中SEQ ID NO 7，以及CDR3:序列表中SEQ ID NO 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體，其特征在于該抗體的重鏈具有如序列表中SEQ ID NO I所示的氨基酸序列，該抗體的輕鏈具有如序列表中SEQ ID NO 2所不的氣基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 用RT-PCR的方法從人外周血擴(kuò)增出DEC-205基因，克隆到p⑶NA3.1表達(dá)載體上，在YB2/0細(xì)胞中表達(dá)； 利用細(xì)胞免疫大鼠，然后分離脾細(xì)胞，與雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，通過(guò)流式檢測(cè)的方法篩選出分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆；以及 用5’ RACE的方法從雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體基因，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，找出抗體的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R序列，經(jīng)過(guò)人源化改造，產(chǎn)生人源化的DEC-205分子的單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1或2所述的人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體在制備用于病毒感染性疾病和癌癥的預(yù)防性疫苗及免疫治療性抗體藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人源化的抗樹(shù)突狀細(xì)胞表面DEC-205分子的單克隆抗體，重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有如下序列CDR1:序列表中SEQIDNO3；CDR2:序列表中SEQIDNO4；以及CDR3:序列表中SEQIDNO5；輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR具有如下序列CDR1:序列表中SEQIDNO6；CDR2:序列表中SEQIDNO7；以及CDR3:序列表中SEQIDNO8。本發(fā)明的有益效果以該抗體作為載體能夠特異性地并且高效地將抗原物質(zhì)運(yùn)輸至抗原遞呈細(xì)胞表面，并引起抗原遞呈細(xì)胞對(duì)該抗原的內(nèi)吞、加工、遞呈，從而增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞的遞呈效率，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。該抗體作為載體在免疫反應(yīng)底下為特點(diǎn)的各種疾病中具有潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K16/28GK103044552SQ20121053499
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者何有文, 張頂, 袁曉輝, 陳彩鳳 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所