一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應(yīng)用，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明是在載體蛋白溶液中加入6-氨基己酸與水溶性碳二亞胺后室溫下反應(yīng)，透析后得到修飾了連接臂的載體蛋白B。葉酸（N-{4-[(2-氨基-1,4-二氫-4-氧代-6-喋啶)甲氨基]苯甲酰基}-L-谷氨酸）溶解于二甲亞砜，加入二環(huán)己基碳二亞胺與羥基琥珀酰亞胺，反應(yīng)生成葉酸衍生物，再與載體蛋白B連接臂上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)，得到完全抗原。結(jié)果表明，用本發(fā)明的抗原免疫動(dòng)物得到的抗血清效價(jià)達(dá)81000，檢測(cè)限0.042ng/mL，半抑制濃度0.3ng/mL。產(chǎn)生的抗體特異性高、靈敏度高。本發(fā)明的抗原或抗體用于免疫親和柱的制備及建立酶聯(lián)免疫吸附分析方法和膠體金試紙快速檢測(cè)法，用于檢測(cè)葉酸殘留。
【專利說明】一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法及其應(yīng)用，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]葉酸(folic acid或folate)又名碟酰谷氨酸,B族維生素之一,是氨基酸、嘧唳和嘌呤代謝中單碳轉(zhuǎn)移的載體，對(duì)核蛋白的合成起輔酶作用；同時(shí)，葉酸也是許多細(xì)胞內(nèi)酶反應(yīng)的輔酶；葉酸的缺乏，會(huì)導(dǎo)致dTMP的合成受到限制，使DNA合成受阻，而產(chǎn)生巨幼細(xì)胞貧血。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，婦女孕前或妊娠早期缺乏葉酸是神經(jīng)管畸形發(fā)生的重要病因之一。葉酸與同型半胱氨酸代謝關(guān)系密切，對(duì)預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生具有重要的生物學(xué)意義。而且，也有研究表明，葉酸與許多癌癥的發(fā)生、預(yù)防以及治療相關(guān)。在我國，葉酸作為一種食品添加劑可以按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)合法添加至食品中。
【權(quán)利要求】
1.一種高特異性的葉酸完全抗原合成方法，其特征在于步驟為:在載體蛋白溶液中加入6-氨基己酸ε -ACA與水溶性碳二亞胺EDC，在室溫下反應(yīng)，透析后得到修飾了連接臂的載體蛋白B ;將葉酸Ν-{4-[ (2-氨基-1，4- 二氫-4-氧代-6-喋啶)甲氨基]苯甲?；鶀 -L-谷氨酸溶解于二甲亞砜DMSO中，加入二環(huán)己基碳二亞胺DCC與N-羥基丁二酰亞胺NHS,反應(yīng)生成葉酸衍生物，再加入載體蛋白B，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值7.4，與載體蛋白B上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)，透析，得到高特異性的葉酸完全抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高特異性的葉酸完全抗原合成方法，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白BSA或雞卵清白蛋白0VA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高特異性的葉酸完全抗原合成方法，其特征在于具體步驟如下: (1)修飾載體蛋白:取載體蛋白50mg溶解于5mLpH9.6碳酸鹽緩沖溶液中，再加入10mg 6-氨基己酸,30mg水溶性碳二亞胺；調(diào)節(jié)體系pH值于6~8，室溫下反應(yīng)4h ;用PBS緩沖液透析2天，期間換水4次，即得到修飾了連接臂的載體蛋白B ； (2)葉酸完全抗原的制備: 取25mg葉酸，加入2.5mL DMSO溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.4，再分別加入1mg N-羥基丁二酰亞胺NHS，23mg DCC，室溫下避光混勻，攪拌反應(yīng)4h，將步驟(1)制備的載體蛋白B 10mg加入反應(yīng)液中，調(diào)節(jié)PH值為8.5，在室溫25°C下避光反應(yīng)2h ;用PBS緩沖液透析2天，期間換水4次，即得到葉酸完全抗原。
4.權(quán)利要求1所述高特異性的葉酸完全抗原的應(yīng)用，其特征在于:通過葉酸完全抗原化合物免疫動(dòng)物得到多克隆抗體或單克隆抗體，并應(yīng)用于檢測(cè)葉酸中。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104031142SQ201410254563
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】馬偉, 胥傳來, 孔德昭, 匡華, 徐麗廣, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)