專利名稱：用于發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇的高產(chǎn)率t淋巴細(xì)胞克隆技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域，進一步地，本發(fā)明涉及一種用于發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇的高產(chǎn)率T淋巴細(xì)胞克隆技術(shù)。
背景技術(shù)：
許多研究表明，可利用操作人體免疫系統(tǒng)來達到控制和治療癌癥的目的，比如利用機體的粘液免疫反應(yīng)，可針對各種生長因子受體和細(xì)胞表面標(biāo)志分子開發(fā)單克隆抗體，以達到治療癌癥的效果；另一方面，利用激活人體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，達到治療癌癥的方法已越來越得到重視。
人體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)是主要是通過T淋巴細(xì)胞(Tlymphocytes)來實現(xiàn)的。T淋巴細(xì)胞可分為CD8陽性的殺傷性T淋巴細(xì)胞(CD8+cytotoxic T lymphocyte，CTL或Tc)和CD4陽性的輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+T-helper lymphocytes)。CD8陽性的殺傷性T淋巴細(xì)胞(CD8+cytotoxic T lymphocyte，CTL或Tc)和CD4陽性的輔助性T淋巴細(xì)胞都識別人類白血球抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA；人類主要相容性復(fù)合體Major Histocompatibility Complex(MHC))表面溝的多肽抗原。這些抗原位于細(xì)胞表面。CD8陽性的T淋巴細(xì)胞可識別MHC I類HLA抗原的8-10個氨基酸長的多肽部分，這些多肽是細(xì)胞質(zhì)蛋白通過降解而產(chǎn)生的，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜呈獻在細(xì)胞表面的MHC I類HLA抗原。而CD4陽性的輔助性T淋巴細(xì)胞識別的多肽抗原是經(jīng)過不同的細(xì)胞通道細(xì)胞外蛋白經(jīng)過細(xì)胞胞吞進入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞體(endosome)被降解成短的多肽抗原，呈獻在細(xì)胞表面的MHC II類HLA抗原，CD4陽性的輔助性T淋巴細(xì)胞識別MHC II類HLA抗原和短的多肽抗原形成的復(fù)合體。T淋巴細(xì)胞識別抗原是通過同時識別多肽抗原和特異的HLA抗原形成的。
用于激起細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法包括被動(寄撫)轉(zhuǎn)移法，利用轉(zhuǎn)移具有腫瘤抗性的免疫細(xì)胞，和使用疫苗的主動免疫法，利用刺激病人的免疫系統(tǒng)來大量產(chǎn)生具有腫瘤抗性的免疫細(xì)胞。
寄撫轉(zhuǎn)移法始于八十年代的臨床研究，這些研究表明穿透固體腫瘤的淋巴細(xì)胞(簡稱腫瘤穿透細(xì)胞)可以從切除的腫瘤樣品的單細(xì)胞懸浮液中獲取并進行體外擴增，然后把這些體外擴增的細(xì)胞加上高劑量的IL-2重新注入黑色素瘤病人體內(nèi)，可以得到一定的臨床治療效果。但是早期研究僅使用CD8陽性的腫瘤穿透細(xì)胞因而療效有限。一項最近完成的研究同時使用了體外擴增的CD8陽性腫瘤穿透細(xì)胞和CD4陽性腫瘤穿透細(xì)胞?；旌鲜褂脙煞N細(xì)胞取得對黑色素瘤病人的顯著療效，這類研究明顯指出腫瘤穿透細(xì)胞所識別的腫瘤抗原的潛在用途。
主動免疫法則要求在體內(nèi)產(chǎn)生大量對腫瘤有高抗性的淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞必須不為一般腫瘤寬容機制所限制，而且對固體腫瘤有長期持續(xù)的免疫抗性。當(dāng)前主動免疫法主要依靠兩類正在研發(fā)中的腫瘤疫苗，基于細(xì)胞的疫苗或者基于腫瘤抗原的疫苗。
基于細(xì)胞的疫苗最初使用同源或異源的完整腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞提取物來免疫，但是一般在完整細(xì)胞上腫瘤抗原非常少量，嚴(yán)重限制了這種方法的效果。不同的方法正在被嘗試于增強整個腫瘤細(xì)胞的免疫性，基于細(xì)胞的疫苗現(xiàn)在包括完整腫瘤細(xì)胞(同源或異源)，基因修改過的腫瘤細(xì)胞(讓其表達細(xì)胞間激素或共激活分子基因)，腫瘤細(xì)胞提取物(裂解物，細(xì)胞膜和熱休克蛋白)以及腫瘤細(xì)胞和抗原表現(xiàn)細(xì)胞的融合體。
人類腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)使發(fā)展基于腫瘤抗原的疫苗成為可能。這類抗原可以大量使用或突變以增強免疫性，從而導(dǎo)致更強和更可以調(diào)控的腫瘤抗性，基于腫瘤抗原的疫苗包括提純的腫瘤抗原(天然或人工重組的)合成多肽，“裸露”DNA，人工重組的病毒和細(xì)菌。
用于克隆呈獻在MHC/HCA I類受體上的腫瘤抗原(該類抗原的抗原決定簇為CD8陽性的T淋巴細(xì)胞所識別)的技術(shù)已有相當(dāng)發(fā)展。許多這類抗原是通過用腫瘤細(xì)胞cDNA表達文庫，轉(zhuǎn)化表達適當(dāng)HLA分子的目標(biāo)細(xì)胞，然后用有腫瘤抗性的T淋巴細(xì)胞來找出合適的轉(zhuǎn)化子。另外，從腫瘤細(xì)胞表面洗脫的多肽(或從腫瘤細(xì)胞純化出的HLA分子上洗脫的多肽)可被脈沖到抗原表現(xiàn)細(xì)胞上并測試對有特異抗腫瘤的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性，把這些多肽純化并測序可以最后發(fā)現(xiàn)其腫瘤抗原基因。第三種技術(shù)常被稱為“逆反免疫法”，該技術(shù)已被成功用于證實在腫瘤細(xì)胞中超量或獨特表達的蛋白是否腫瘤抗原。另外，體外敏感化技術(shù)也被用于生產(chǎn)對特定候選抗原有抗性的T淋巴細(xì)胞，如果這些T淋巴細(xì)胞能有專門特異性地識別完整的腫瘤細(xì)胞，該候選蛋白則可以認(rèn)為是一個腫瘤抗原。第四種技術(shù)一般稱為SEREX(重組cDNA表達文庫的血樣分析技術(shù))。該技術(shù)是基于對一個特定蛋白產(chǎn)生抗體必需輔助T淋巴細(xì)胞的前提之上。腫瘤病人身上的血清被稀釋后用于檢測在原核生物(如細(xì)菌等)中表達的腫瘤cDNA文庫，這種SEREX方法一般用于發(fā)現(xiàn)可以抗體識別的基因。
相對比之下，克隆為MHC/HLA II類受體所呈獻的腫瘤抗原(一般為CD4陽性T淋巴細(xì)胞識別)的技術(shù)則因技術(shù)上的困難而發(fā)展有限。技術(shù)困難源于這類腫瘤抗原不是來自細(xì)胞外環(huán)境就是細(xì)胞內(nèi)源蛋白被運輸?shù)教貏e的MHC二類受體的裝卸部門，然后被加工后與MHC二類受體粘接上再運到細(xì)胞表面。最近一項基于生化蛋白提純和質(zhì)譜測序的技術(shù)被研發(fā)出來。該技術(shù)被成功用于發(fā)現(xiàn)被同源CD4陽性腫瘤穿透淋巴細(xì)胞識別的表達在1558黑色素瘤細(xì)胞系上的獨特腫瘤抗原。這個方法可能會對克隆別的高度表達的，可以被抗原呈獻細(xì)胞有效地從外環(huán)境攝取而且呈獻給CD4陽性T淋巴細(xì)胞的蛋白抗原也有用。另一項最近發(fā)展的方法則是使用一個lI-cDNA翻譯融合的文庫。這個方法是基于遺傳決定，使用293細(xì)胞系。該細(xì)胞系被基因修飾后表達不變鏈(lI)DMA、DMB以及其它MHC二類受體加工及表現(xiàn)的重要組成部分基因。該方法也有可能為廣泛應(yīng)用于克隆MHC II類抗原。
現(xiàn)有方法在技術(shù)上困難嚴(yán)重限制了其在中國人群腫瘤療治中的應(yīng)用?，F(xiàn)有的腫瘤穿透細(xì)胞的技術(shù)以及基于腫瘤穿透細(xì)胞的技術(shù)適用于黑色素瘤，而黑色素瘤在中國人群中并不普遍。其它癌癥如肺癌、鼻咽癌及肝癌對中國人群的健康是一個更大的威脅，然而現(xiàn)有腫瘤穿透技術(shù)卻無法用于這些癌癥，主要因為以下兩個原因1、在絕大部分現(xiàn)用方法中，一旦腫瘤切除后，腫瘤穿透細(xì)胞一般通過有限稀釋克隆法獲得。該方法靠抗CD3單克隆抗體(OKT-3)，在哺養(yǎng)細(xì)胞(FEEDER CELL，例如被照射殺死的異源環(huán)周血液單核細(xì)胞)的存在下刺激T淋巴細(xì)胞生長，這個方法被成功用于擴增大量的集體T淋巴細(xì)胞和從黑色素瘤病人身上克隆T淋巴細(xì)胞。但是靠OKT-3介接的T淋巴細(xì)胞擴增和克隆技術(shù)常導(dǎo)致其失去對黑色素瘤以外腫瘤的特異免疫性。同樣的問題也存在于“逆反免疫法”得到的T淋巴細(xì)胞及體外多肽刺激所得的T淋巴細(xì)胞?，F(xiàn)在流行的一種假說認(rèn)為，在體內(nèi)對腫瘤有特異抗性的前體T淋巴細(xì)胞上的T淋巴細(xì)胞受體和CD3的復(fù)合構(gòu)架已被腫瘤細(xì)胞重復(fù)刺激，而這些腫瘤細(xì)胞本身并非職業(yè)的抗原表現(xiàn)細(xì)胞并且缺少共激活因子，例如CD80和CD86。因此，在體內(nèi)TCR/CD3信號傳導(dǎo)途徑已被用竭，而現(xiàn)有的有限稀釋克隆法則是依靠重復(fù)OKT-3來刺激已用竭的TCR/CD3信號傳導(dǎo)途徑。另外，普遍使用的逆反免疫法靠體外和多肽脈沖過的環(huán)周血液單核細(xì)胞共同培養(yǎng)以獲得T淋巴細(xì)胞，也是靠TCR/CD3途徑傳導(dǎo)信號，結(jié)果，現(xiàn)有的依靠OKT-3的T淋巴細(xì)胞擴增和克隆技術(shù)很可能導(dǎo)致對腫瘤有特異抗性的T淋巴細(xì)胞的主動引導(dǎo)性死亡。
2、由于現(xiàn)今有限稀釋法中的技術(shù)性限制，迄今為止尚無有效的高產(chǎn)率(high-throughput)方法來大規(guī)模發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原。該類方法對于尋找最有效的抗原以作為未來的疫苗尤其有用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞來尋找有腫瘤特異性的、被HLA類受體呈獻而且為CD4陽性淋巴細(xì)胞或CD8陽性淋巴細(xì)胞識別的抗原決定簇的方法，該方法包括以下步驟a.從病人身上獲得腫瘤樣品并制成單細(xì)胞懸浮液；b.從單細(xì)胞懸浮液提取CD4陽性淋巴細(xì)胞或CD8陽性淋巴細(xì)胞，并用有限稀釋制備單個克隆而且擴增這些克隆；c.把擴增的T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，并檢析上清液中的特殊的細(xì)胞間激素，從而找出有腫瘤反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞克??；d.從病人腫瘤切樣的一部分中提取mRNA、構(gòu)建cDNA文庫，并用于轉(zhuǎn)化靶標(biāo)細(xì)胞；
e.將腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞與靶標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化子共同培養(yǎng)并檢析上清液中的特殊的細(xì)胞間激素，最終找出腫瘤特異性抗原基因；f.從腫瘤特異性抗原基因上找出腫瘤特異性抗原決定簇。
進一步地，在本發(fā)明的實施方式中，上述用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系、或BHK細(xì)胞系、或Cos細(xì)胞系。
在本發(fā)明中，上述靶標(biāo)細(xì)胞上表達的HLA受體是包括但不局限于中國人群特異性的，例如HLA-A24、或HLA-A2、或HLA-DP5、或HLA-DR4。
在本發(fā)明中，用于擴增T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液包含interleukine-2、PHA-L和抗CD28的抗體。
在本發(fā)明中，腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是通過檢析在上清液中的GM-CSF或IFN-g來發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種用在細(xì)胞免疫療法使用的治療疫苗或免疫原以及從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，來篩選細(xì)胞免疫療法對特定種族的病人的潛在療效的方法，包括以下步驟a.從病人身上獲得腫瘤樣品并制成單細(xì)胞懸浮液；b.從單細(xì)胞懸浮液提取CD4陽性淋巴細(xì)胞或CD8陽性淋巴細(xì)胞，并用有限稀釋制備單個克隆而且擴增這些克??；c.把擴增的T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，并檢析上清液中的特殊的細(xì)胞間激素，從而找出有腫瘤反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞克??；d.把擴增的T淋巴細(xì)胞和在細(xì)胞免疫療法中使用的治療疫苗或免疫原共同培養(yǎng)以找出對治療疫苗或免疫原有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；e.通過對比從步驟c和步驟d得數(shù)據(jù)，可以定出對治療疫苗或免疫原有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞的相對頻率。
進一步地，在本發(fā)明的實施方式中，上述用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系，或BHK細(xì)胞系，或Cos細(xì)胞系。
在本發(fā)明中，上述靶標(biāo)細(xì)胞上表達的HLA受體是包括但不局限于中國人群特異性的，如HLA-A24、或HLA-A、或HLA-DP5、或HLA-DR4。
在本發(fā)明中，上述用于擴增T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液包含interleukine-2、PHA-L和抗CD28的抗體。
在本發(fā)明中，上述腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種用體外擴增來產(chǎn)生對抗原或抗原決定簇有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞，包括CD4陽性淋巴細(xì)胞和CD8陽性淋巴細(xì)胞，來進行細(xì)胞寄撫轉(zhuǎn)移療法，或研制治療性疫苗以激活細(xì)胞免疫系統(tǒng)的方法，包括以下步驟a.一種用來培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的高產(chǎn)率模式，特別是用96孔、192孔、384孔或其他培養(yǎng)板以刺激T淋巴細(xì)胞的生長；或b.一種用來檢析T淋巴細(xì)胞活性的高產(chǎn)率模式，特別是用96孔、192孔、384孔或其他培養(yǎng)板檢析細(xì)胞間激素或細(xì)胞生死情況。
本發(fā)明是一項高產(chǎn)率的用于發(fā)現(xiàn)克隆MHC I型和MHC II型腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇的T淋巴細(xì)胞技術(shù)系統(tǒng)，這項發(fā)明可適用于多種腫瘤，包括黑色素瘤。這項發(fā)明用于發(fā)現(xiàn)新腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇，以便利用腫瘤穿透細(xì)胞的免疫方法來治療除黑色素瘤和腎癌之外的腫瘤。
現(xiàn)有的依靠OKT-3的T淋巴細(xì)胞擴增和克隆技術(shù)很可能導(dǎo)致對腫瘤有特異抗性的T淋巴細(xì)胞的主動引導(dǎo)性死亡，為了解決這個問題，從非黑色素瘤病人的腫瘤細(xì)胞中克隆T淋巴細(xì)胞，本發(fā)明人研制成功一種新的刺激淋巴細(xì)胞的生長素，該生長素不依靠TCR/CD3信號傳導(dǎo)途徑，而且可以替代OKT-3用于有限稀釋法和所得T淋巴細(xì)胞的快速擴增。該生長素混合液通過非TCR/CD3途徑傳導(dǎo)T淋巴細(xì)胞生長信號，因此，它不會導(dǎo)致從腫瘤穿透細(xì)胞中得到的對腫瘤有特異抗性的T淋巴細(xì)胞的主動引導(dǎo)性死亡。當(dāng)該混合液直接與OKT-3對比用于克隆腫瘤特異性CD4陽性T淋巴細(xì)胞和CD8陽性T淋巴細(xì)胞時，該混合液顯示了更高的克隆效率并獲得更多的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，此類效果在重復(fù)實驗中相當(dāng)一致。
基于這個新的T淋巴細(xì)胞生長素，本發(fā)明人發(fā)明了一種高產(chǎn)率T淋巴細(xì)胞克隆系統(tǒng)，用于有效地克隆腫瘤特異性的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，并且找出CD4陽性和CD8陽性T淋巴細(xì)胞特異性抗原。該系統(tǒng)可用于高產(chǎn)率地發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原和抗原決定簇，而且使用從病人身上獲得的腫瘤樣品和血細(xì)胞樣品，而不是絕大部分現(xiàn)有方法中必需的已在體外建系的細(xì)胞。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的有限稀釋法中的技術(shù)性限制。


圖1顯示了找出腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇的方法流程圖。
具體實施例方式
實施例1如圖示1所示，HITC技術(shù)的一個典型例子可以描述如下一.找出并擴增有腫瘤反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞1、切除腫瘤樣品從病人身上取得腫瘤切樣。
2、單細(xì)胞懸浮液腫瘤切樣的一部分經(jīng)由多種酶處理或由自動機械力量處理，使之成為單細(xì)胞懸浮液。
3、細(xì)胞分離用抗體覆被的磁性小珠分離CD4陽性和CD8陽性細(xì)胞，而剩余的細(xì)胞(主要是腫瘤細(xì)胞)則按附著細(xì)胞培養(yǎng)。
4、用STIMULEUKIN(新的生長素混合液)進行有限稀釋基于對T淋巴細(xì)胞克隆的需要，分離出的CD4陽性和CD8陽性T淋巴細(xì)胞被稀釋，然后點到有已被照射殺死的培養(yǎng)細(xì)胞覆蓋的96孔板上，每個孔只能有最多一個細(xì)胞，往每個孔內(nèi)加注STIMULEUKIN以擴增這些單細(xì)胞克隆。
5、找出有腫瘤反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞克隆從第3步得來的腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)入新的96孔板內(nèi)，然后從第4步得來的T淋巴細(xì)胞則被轉(zhuǎn)加入這些有腫瘤細(xì)胞的孔內(nèi)。因為有腫瘤特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞會被腫瘤細(xì)胞所激活并分泌特殊的細(xì)胞間激素(GM-CSF或IFN-g)，分析各孔內(nèi)的細(xì)胞間激素可以最后發(fā)現(xiàn)有腫瘤反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆。用已有的試劑系統(tǒng)，如granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)ELISA kit，分析各孔內(nèi)上清液內(nèi)的細(xì)胞間激素。
6、擴增有腫瘤反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞這類細(xì)胞被放入大培養(yǎng)器中繼續(xù)擴增。
二.找出腫瘤特異性抗原
7、建立cDNA文庫從病人腫瘤切樣的一部分中提取mRNA并用于構(gòu)建cDNA文庫，表達載體的選擇可以決定這個文庫具體是用于找尋MHC I類或MHCII類受體特異性抗原。
8、轉(zhuǎn)化cDNA文庫一般是在細(xì)菌中培養(yǎng)生長，該文庫接著被擴增而且分為亞群，每一亞群包括一定數(shù)量的初源cDNA。從這些亞群中擴培的cDNA被用于轉(zhuǎn)化表達正確的HLA種類并已預(yù)先生長在96孔板上的293細(xì)胞。這樣，在每個孔里的轉(zhuǎn)化子會具有不超過最初亞群中數(shù)目的cDNA種類。
9、加入腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞從第6步得到并擴增的腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞被分加入有轉(zhuǎn)化子的96孔板中。
10、分析細(xì)胞間激素的釋放和找出有被激活的T淋巴細(xì)胞的孔因為有腫瘤反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞會被表現(xiàn)正確的抗原決定簇的293細(xì)胞所激活并釋放特異的細(xì)胞間激素，經(jīng)過分析所有孔中的特異細(xì)胞間激素可以找出被正確的腫瘤抗原基因所轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞。
11、亞克隆并重復(fù)T淋巴細(xì)胞檢測在第10步中找出的293細(xì)胞實際上是一群細(xì)胞，由一個亞群的初源cDNA轉(zhuǎn)化而得，該亞群再分小群并用于轉(zhuǎn)化同樣的293細(xì)胞，重復(fù)第9和10步。
12、克隆cDNA重復(fù)第11步直到獲得可以激活腫瘤反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞的單個克隆為止，從該細(xì)胞中克隆出cDNA，這就是腫瘤特異性抗原。
13、找出抗原決定簇使用同批腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，在現(xiàn)有技術(shù)中采用的多個方法均可用于找出特異的抗原決定簇。
在本申請中，一些本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)未作詳細(xì)描述。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述描述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，尋找有腫瘤特異性的、被HLA類受體呈獻的、為CD4陽性淋巴細(xì)胞或CD8陽性淋巴細(xì)胞識別的抗原決定簇的方法，該方法包括a.從病人身上獲得腫瘤樣品并制成單細(xì)胞懸浮液；b.從單細(xì)胞懸浮液提取CD4陽性淋巴細(xì)胞或CD8陽性淋巴細(xì)胞，用有限稀釋制備單個克隆，擴增這些克?。籧.把擴增的T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢析上清液中的特殊的細(xì)胞間激素，找出有腫瘤反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞克??；d.從病人腫瘤切樣的一部分中提取mRNA，構(gòu)建cDNA文庫，用于轉(zhuǎn)化靶標(biāo)細(xì)胞；e.將腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞與靶標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化子共同培養(yǎng)，檢析上清液中的特殊的細(xì)胞間激素，找出腫瘤特異性抗原基因；f.從腫瘤特異性抗原基因上找出腫瘤特異性抗原決定簇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系、或BHK細(xì)胞系、或Cos細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶標(biāo)細(xì)胞上表達的HLA受體是包括但不局限于中國人群特異性的，是HLA-A24、或HLA-A2、或HLA-DP5、或HLA-DR4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于擴增T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液包含interleukine-2，PHA-L和抗CD28的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來確定。
6.一種用在細(xì)胞免疫療法使用的治療疫苗或免疫原以及從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，篩選細(xì)胞免疫療法對特定種族的病人的潛在療效的方法，該方法包括a.從病人身上獲得腫瘤樣品，制成單細(xì)胞懸浮液；b.從單細(xì)胞懸浮液中提取CD4陽性淋巴細(xì)胞或CD8陽性淋巴細(xì)胞，用有限稀釋制備單個克隆，擴增這些克?。籧.把擴增的T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢析上清液中的特殊的細(xì)胞間激素，找出有腫瘤反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞克隆；d.把擴增的T淋巴細(xì)胞和在細(xì)胞免疫療法中使用的治療疫苗或免疫原共同培養(yǎng)，找出對治療疫苗或免疫原有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；e.通過對比從步驟c和步驟d所得數(shù)據(jù)，定出對治療疫苗或免疫原有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞的相對頻率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系，或BHK細(xì)胞系、或Cos細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中靶標(biāo)細(xì)胞上表達的HLA受體是包括但不局限于中國人群特異性的，是HLA-A24、或HLA-A、或HLA-DP5、或HLA-DR4。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中用于擴增T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液包含interleukine-2、PHA-L和抗CD28的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞是通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來確定的。
11.一種用體外擴增來產(chǎn)生對抗原或抗原決定簇有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞，進行細(xì)胞寄撫轉(zhuǎn)移療法，或研制治療性疫苗以激活細(xì)胞免疫系統(tǒng)的方法，該方法包括a.一種用來培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的高產(chǎn)率模式，選用96孔、192孔、384孔或更多孔的培養(yǎng)板，刺激T淋巴細(xì)胞的生長；或b.一種用來檢析T淋巴細(xì)胞活性的高產(chǎn)率模式，選用96孔、192孔、384孔或更多孔的培養(yǎng)板，檢析細(xì)胞間激素或細(xì)胞生死情況。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞來尋找有腫瘤特異性的、被HLA類受體呈獻而且為CD4陽性淋巴細(xì)胞或CD8陽性淋巴細(xì)胞識別的抗原決定簇的方法；本發(fā)明還公開了一種用在細(xì)胞免疫療法使用的治療疫苗或免疫原以及從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，來篩選細(xì)胞免疫療法對特定種族的病人的潛在療效的方法；本發(fā)明還公開了一種用體外擴增來產(chǎn)生對抗原或抗原決定簇有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞，來進行細(xì)胞寄撫轉(zhuǎn)移療法，或研制治療性疫苗以激活細(xì)胞免疫系統(tǒng)的方法。
文檔編號C12N5/0783GK1609196SQ200310108038
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者范青青, 曾鋼 申請人:上海普泛生物科技有限公司