專利名稱：熒光假單胞菌m18的基因插入突變菌株m18g的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種假單胞菌基因插入突變菌株的方法，尤其是一種熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
一般認(rèn)為，農(nóng)作物病害造成的減產(chǎn)幅度約占總收入的25-75％。目前，除了選用良種和科學(xué)的栽培措施外，生產(chǎn)上控制農(nóng)作物病害的主要手段是使用化學(xué)殺菌劑。大多殺菌劑對動物和人類有害，化學(xué)農(nóng)藥所造成的食物中毒時有發(fā)生，在可食部分的食物中殘留的毒物對人畜的潛在危害，已引起社會各方面的關(guān)注。長期積累在生態(tài)系統(tǒng)中的化學(xué)農(nóng)藥造成了環(huán)境的污染，對國民經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展極為不利。同時，在許多情況下，化學(xué)農(nóng)藥并不完全有效。因此，在發(fā)展環(huán)境相容的高效低毒的新一代化學(xué)農(nóng)藥的同時，進(jìn)一步開發(fā)微生物源農(nóng)藥顯得十分必要。
根據(jù)文獻(xiàn)報道(微生物學(xué)報，2003，43(3)315-323)，利用rpoD基因的擴(kuò)增技術(shù)，僅僅只能使野生型的M18菌株的吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量由52ppm提高約2倍達(dá)到102ppm。增幅不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)中的缺陷的基礎(chǔ)上，提供一種熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，通過基因工程技術(shù)，進(jìn)行定向突變，獲得一種基因工程菌株M18G，可將發(fā)酵效價提高到317ppm，提高了熒光假單胞菌(fluorescent Pseudomonas sp.)M18生物合成吩嗪-1-羧酸的能力。
本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的1、聚合酶鏈反應(yīng)根據(jù)大腸桿菌E.coli，銅綠假單胞菌P.aeruginosa和歐文氏菌E.carotovora等菌種中g(shù)acA基因的保守序列，設(shè)計了用于以熒光假單胞菌M18基因組為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的寡聚脫氧核苷酸兼并引物。引物序列為引物15’-GCCTTCTAGATGATWARGGTGYTRGTCGAYGACCA-3’，引物25’-GATTAACTCGAGYYAGVBGSYGGCATCRACCATG-3’，其中兼并堿基為Y＝C/T，W＝A/T，V＝A/C/G，R＝A/G，B＝G/C/T，S＝G/C。分別在兩引物的5’端添加XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)(下劃線部位)，以利于聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物克隆。PCR反應(yīng)的條件是(1)預(yù)變性95℃、6min；(2)擴(kuò)增反應(yīng)每一循環(huán)包括變性94℃、1min，退火50℃、2min，延伸72℃、3min，共計30個循環(huán)；(3)補(bǔ)充反應(yīng)72℃、10min。獲得了gacA基因的部分片斷。
2、以該gacA基因的部分片斷為探針，從M18的基因組柯斯文庫中篩選出陽性克隆。通過southern blotting從陽性克隆的柯斯質(zhì)粒的酶切片段中獲得含有g(shù)acA基因及兩側(cè)序列的1.9kb的片段并克隆于pBluescriptSK+中。
3、將編碼卡那霉素的抗性基因的序列長度為1.6kb片段，插入位于gacA序列中的BamHI位點(diǎn)，在載體pBluescriptSK+上完成該基因的定點(diǎn)插入突變。之后，把長度為3.5kb的插有卡那霉素的抗性基因的gacA片段，從pBluescriptSK+切下并克隆于自殺質(zhì)粒pME3087中。
4、運(yùn)用同源重組技術(shù)，構(gòu)建M18的突變菌株M18G。采用固相濾膜三親雜交方法，供體菌為帶pME3087G的大腸桿菌ED8767，體積為100ul，受菌體為野生型M18，體積100μl及攜帶輔助質(zhì)粒pME497輔助菌HB101，體積100ul，混合均勻，4℃，12000r/min離心2min，去上清，新鮮培養(yǎng)基淋洗二次，再懸浮于100ul新鮮培養(yǎng)基。取5ul點(diǎn)樣于無菌濾膜上，培養(yǎng)18小時后刮取菌體，置于1ml培養(yǎng)液中，懸浮混勻，稀釋涂布于含50μg/ml卡那霉素、20μg/ml利復(fù)平的抗性平板，37℃培養(yǎng)，12-24h后出現(xiàn)共整和接合子。隨機(jī)挑選幾個接合子震蕩培養(yǎng)后稀釋涂平板，然后點(diǎn)平板篩選，對照平板抗性為卡那霉素、利復(fù)平，篩選平板抗性為卡那霉素、利復(fù)平和四環(huán)素，經(jīng)二次交換的陽性克隆，從而獲得突變株M18G。
5、吩嗪-1-羧酸的提取和定量測定。取發(fā)酵菌液180μl，加20μl 6N鹽酸酸化之，震蕩裂解細(xì)胞。加入3倍體積的氯仿， 再震蕩平衡5min。12000r/min離心5min。棄去上面細(xì)菌碎片。取下面的5μ進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC測定吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量。檢測的條件為檢測波長258nm，保留時間為1.7min；流動相為70％甲醇，流速1ml/min，C18反相柱。
本發(fā)明具有顯著的的特點(diǎn)和實質(zhì)性進(jìn)步，紋枯病菌是一種常見的植物病原真菌，造成侵染的農(nóng)作物減產(chǎn)。吩嗪-1-羧酸能夠高效抑制紋枯病菌的生長，保護(hù)作物免受侵染。突變株M18G不論是在King’B還是在改進(jìn)PPM培養(yǎng)基中，其吩嗪-1-羧酸的合成能力都顯著地增加。通過生物發(fā)酵工程技術(shù)，該菌株可用于開發(fā)高效，低毒的新型生物農(nóng)藥。具有較為廣闊的應(yīng)用前景。


圖1、突變菌株M18G和野生菌株M18在改進(jìn)PPM培養(yǎng)基下合成吩嗪-1-羧酸曲線圖?！?、◆分別代表突變菌株M18G和野生菌株M18。
圖2、突變菌株M18G和野生菌株M18在King’B培養(yǎng)基下合成吩嗪-1-羧酸曲線圖?！?、◆分別代表突變菌株M18G和野生菌株M18。
具體實施例方式
以下結(jié)合本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步描述實施例1、在改進(jìn)PPM培養(yǎng)基發(fā)酵條件下，與野生菌株M18相比，突變菌株M18G合成吩嗪-1-羧酸的能力提高2倍。將突變菌株M18G和野生菌株M18分別接種于含有150ml PPM培養(yǎng)基的三角燒瓶中，三角燒瓶的容積為500ml，置于28℃、220r/min條件下的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，每隔8小時取樣分析，3次重復(fù)，取其平均值。經(jīng)72小時發(fā)酵后，HPLC測定結(jié)果顯示M18G生物合成PCA的量可達(dá)到121.5ppm，M18生物合成的PCA的量僅為60.6ppm，見圖1。
2、在King’B培養(yǎng)基發(fā)酵條件下，與野生菌株M18相比，突變菌株M18G合成PCA的能力提高近30倍。將突變菌株M18G和野生菌株M18分別接種與盛有150ml PPM培養(yǎng)基的三角燒瓶中，三角燒瓶的容積為500ml，置于28℃、220r/min，搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，每隔8小時取樣分析，3次重復(fù)，取其平均值。經(jīng)72小時發(fā)酵后，HPLC測定結(jié)果顯示M18G生物合成PCA的量可達(dá)到317ppm，野生型M18生物合成的吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量僅為13.2ppm，見圖2。
權(quán)利要求
1.一種熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，其特征在于，具體方法的步驟如下(1)引物及聚合酶鏈反應(yīng)根據(jù)大腸桿菌E.coli，銅綠假單胞菌P.aeruginosa和歐文氏菌E.carotovora菌種中g(shù)acA基因的保守序列，設(shè)計兼并引物用于擴(kuò)增熒光假單胞菌M18基因組的gacA片段；(2)以該片段為探針，從M18的基因組柯斯質(zhì)粒文庫中篩出陽性克??；(3)運(yùn)用同源重組技術(shù)剔除技術(shù)和固相濾膜三親雜交方法，獲得M18菌株的gacA突變株M18G；(4)吩嗪-1-羧酸的提取和定量測定取發(fā)酵菌液180μl，加20μl 6N鹽酸酸化，震蕩裂解細(xì)胞，經(jīng)3倍體積的氯仿，震蕩平衡5min后，12000r/min離心5min，棄去上清夜和細(xì)菌碎片，取5μl下層液相，進(jìn)樣，經(jīng)HPLC測定吩嗪-1-羧酸的產(chǎn)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，其特征是，步驟(1)所述的引物具體指引物15’-GCCTTCTAGATGATWARGGTGYTRGTCGAYGACCA-3’，引物25’-GATTAACTCGAGYYAGVBGSYGGCATCRACCATG-3’，其中兼并堿基為Y＝C/T，W＝A/T，V＝A/C/G，R＝A/G，B＝G/C/T，S＝G/C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，其特征是，所述的引物分別在兩引物的5’添加XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)，以利于聚合酶鏈產(chǎn)物的克隆、測序和鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，其特征是，所述的PCR反應(yīng)條件為(1)預(yù)變性95℃、6min；(2)擴(kuò)增反應(yīng)每一循環(huán)包括變性94℃、1min，退火50℃、2min，延伸72℃、3min，共計30個循環(huán)；(3)補(bǔ)充反應(yīng)72℃、10min，據(jù)此，從M18的基因組中擴(kuò)增并獲得gacA基因的部分序列；擴(kuò)增的片段克隆于pBluescriptSK+中，相應(yīng)的質(zhì)粒為pBSG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，其特征是，從柯斯質(zhì)粒陽性克隆中，切取帶有g(shù)acA基因及兩側(cè)序列的1.9kb片段克隆于pBluescriptSK+中，將編碼卡那霉素抗性的基因插入位于該片段近中間的且在gacA基因中的BamHI位點(diǎn)，獲得gacA基因的體外突變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，其特征是，步驟(2)的進(jìn)一步限定為將插有卡那霉素抗性基因的片段從pBluescriptSK+中切出并克隆于自殺質(zhì)粒pME3087中形成pME3087G。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，其特征是，對步驟(4)的提取和測定的進(jìn)一步的界定為HPLC檢測條件為PCA檢測波長為258nm，保留時間為1.7min；流動相為70％甲醇，流速為2μl/min，C18反相柱。
全文摘要
一種熒光假單胞菌M18的基因插入突變菌株M18G的方法，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。具體方法的步驟如下根據(jù)大腸桿菌，銅綠假單胞菌和歐文氏菌菌種中g(shù)acA基因的保守序列，設(shè)計兼并引物用于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增熒光假單胞菌M18基因組的gacA片段；以該片段為探針，從M18的基因組柯斯質(zhì)粒文庫中篩出陽性克?。贿\(yùn)用同源重組剔除技術(shù)和固相濾膜三親雜交方法，獲得M18菌株的gacA突變株M18G；吩嗪－1－羧酸的提取和定量測定取發(fā)酵菌液180μl，加20μl6N鹽酸酸化，震蕩裂解細(xì)胞，經(jīng)3倍體積的氯仿，震蕩平衡5min后，12000r/min離心5min，棄去上清液和細(xì)菌碎片，取5μl下層液相，經(jīng)HPLC測定吩嗪－1－羧酸的產(chǎn)量。通過生物發(fā)酵工程技術(shù)，該菌株可用于開發(fā)生產(chǎn)高效，低毒的新型生物農(nóng)藥。
文檔編號C12Q1/68GK1539959SQ20031010830
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日
發(fā)明者許煜泉, 葛宜和 申請人:上海交通大學(xué)