專利名稱：新的熒光假單胞菌突變菌株及其變體,它們的生產(chǎn)方法以及在藻酸鹽生產(chǎn)中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的熒光假單胞菌突變菌株及其變體，其能生產(chǎn)大量藻酸鹽。所述藻酸鹽不僅可大量生產(chǎn)，而且還可以具有確定含量的甘露糖醛酸鹽(mannuronate)和古洛糖醛酸鹽(guluronate)殘基，在藻酸鹽中可能存在確定水平的乙?；?，以及所需分子量的藻酸鹽。同時，也描述了調節(jié)藻酸鹽生產(chǎn)的高產(chǎn)量突變體。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)新的熒光假單胞菌突變菌株及其變體的方法，以及所得菌株在藻酸鹽生產(chǎn)中的應用。
現(xiàn)有技術的描述已知有數(shù)種微生物能夠生產(chǎn)藻酸鹽，研究最多的細菌是綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)。然而，當將其生產(chǎn)的藻酸鹽應用于營養(yǎng)物或藥物時，其應用受到了限制，因為它與哺乳動物或人的初級和次級感染有關。其它的菌種可能是安全的來源，但一般不能生產(chǎn)大量藻酸鹽或具有足夠高分子量的藻酸鹽，由于該原因不能被應用。已知非致病的假單胞菌種類如惡臭假單胞菌(P.putida)、門多薩假單胞菌(P.mendocina)以及熒光假單胞菌(P.fluorescens)產(chǎn)生相似于乙?；逅猁}的細胞外聚多糖，Govan J.R.W.等，J.of General Microbiology(1981)，125，p.217-220。并且，Conti，E.等，Microbiology(1994)，140，p.1125-1132描述了從熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌生產(chǎn)藻酸鹽。然而，還不知道這些菌株中的任何穩(wěn)定的藻酸鹽過量生產(chǎn)者。
Kelco Biospecialties Ltd.的美國專利No.4,490,467描述了應用新的門多薩假單胞菌(Pseudomonas Mendocina)菌株生產(chǎn)的多糖產(chǎn)物。該菌株生產(chǎn)高產(chǎn)量的所需多糖，并且在連續(xù)發(fā)酵中相對穩(wěn)定。所述菌株通過將一種野生型培養(yǎng)的門多薩假單胞菌與羧芐青霉素接觸來生產(chǎn)，并采用誘變劑將選擇的抗性黏液型克隆誘變。最穩(wěn)定的并因而最優(yōu)選的菌株以NCIB 11687保藏。高濃度的藻酸鹽濃度，大約20g/l，在采用最低限葡萄糖培養(yǎng)基的氮限制的連續(xù)培養(yǎng)中獲得。在培養(yǎng)中存在一種藻酸鹽裂解酶活性，并產(chǎn)生低分子量、低粘性聚合物，其流變性相似于印刷級藻酸鹽。裂解酶的降解可采用在培養(yǎng)基中加入蛋白水解酶來補救，Hacking A.J.等，(1983)J.Gen.Microbiol.，129，p.3473-3480。連續(xù)培養(yǎng)十代后出現(xiàn)了非粘液型變體，SenghaS.S.等，(1989)J.Gen.Microbiol.，135，p.795-804，p.799，第二段。Chitnis等(1990)J.Bacteriol.，135，p.2894-2900報導了一種機會病原體綠膿桿菌(P.aeruginosa)的差向異構酶陰性突變體。黏液型綠膿桿菌FDRl是化學誘變的突變體，其不能將古洛糖醛酸鹽(G)-殘基引入到藻酸鹽中，被獨立地分離。應用G-特異的藻酸鹽裂解酶和1H-核磁共振分析顯示，G-殘基不存在于由這些突變體分泌的藻酸鹽中。Goldberg和Ohman，1987，J.Bacteriol.，169，p.1593-1602在搖瓶中用FRDl生產(chǎn)出高達1.7g/l的藻酸鹽。如常，對于自發(fā)的藻酸鹽-產(chǎn)生者，非黏液型回復突變頻繁出現(xiàn)(Flynn和Ohman，1988，J.Bacteriol.，170，p.1452-1460)。
因此，市場上仍然需要生產(chǎn)可靠的藻酸鹽的合適的來源。特別地，需要穩(wěn)定的來源以生產(chǎn)大量高質量藻酸鹽，所述藻酸鹽具有規(guī)定的結構以及所學戶的分子量；并且尤其需要一種可用于生產(chǎn)大量具有生物活性的藻酸鹽的來源。此外，也需要生產(chǎn)純的甘露糖醛酸，其可進行體外差向異構作用，以獲得具有預定古洛糖醛酸鹽殘基(G)-含量的藻酸鹽。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的熒光假單胞菌突變菌株，它是穩(wěn)定的并產(chǎn)生大量藻酸鹽。本發(fā)明的一些實施方案是提供其變體，所述變體能產(chǎn)生就甘露糖醛酸鹽和古洛糖醛酸鹽殘基含量而言具有規(guī)定結構的藻酸鹽，可能存在確定水平的O-乙?；退璺肿恿康脑逅猁}分子。同時，還描述了具有經(jīng)過調節(jié)的藻酸鹽生產(chǎn)能力的高產(chǎn)量突變體以及它們的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的其它方面是生產(chǎn)新的熒光假單胞菌突變菌株(包括其突變體)的方法，以及所得突變體在生產(chǎn)藻酸鹽，尤其是生產(chǎn)藻酸鹽的培養(yǎng)基或大規(guī)模發(fā)酵罐，更特別是生產(chǎn)生物活性藻酸鹽或純甘露糖醛酸(mannuronan)中的應用。所得藻酸鹽可用于不同的食品和如營養(yǎng)物、動物飼料、化妝品和藥物等工業(yè)生產(chǎn)，它們也能構成中間產(chǎn)物，適于由甘露糖醛酸-C5-差向異構酶(如由美國專利No.5,939,289描述的差向異構酶)形成進一步的改變。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物，其中，所述菌株生產(chǎn)大量藻酸鹽。在本發(fā)明的第一個方面，所述菌株每升培養(yǎng)基可生產(chǎn)至少10g藻酸鹽。在優(yōu)選的實施方案中，至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物每升培養(yǎng)基每40-55g碳源可生產(chǎn)至少10g藻酸鹽；更優(yōu)選每升培養(yǎng)基每50-55g碳源可生產(chǎn)至少10g藻酸鹽；最優(yōu)選至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物每升培養(yǎng)基每40g碳源可生產(chǎn)至少10g藻酸鹽。
本發(fā)明涉及的熒光假單胞菌的純的突變菌株及其變體的例子有以下突變菌株Pf201、Pf2012、Pf2013、Pf20118、Pf20137、Pf20118algIJΔ、Pf20118algFΔ、Pf20118AlgLH203R和Pf201MC。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物，其中，生產(chǎn)具有Pf201及其變體的藻酸鹽生產(chǎn)特性的菌株保留了所述特性。所述“藻酸鹽生產(chǎn)特性”可以是以下的一種或多種以每升培養(yǎng)基產(chǎn)生的藻酸鹽克數(shù)(g/l)和每克碳源產(chǎn)生的藻酸鹽克數(shù)(g/g碳源)的方式生產(chǎn)，藻酸鹽生產(chǎn)的平均分子量、乙?；潭群虶-含量。
在本發(fā)明的第二方面包含一種熒光假單胞菌的純的突變菌株，其中，所述突變體能夠生產(chǎn)大量藻酸鹽，僅由甘露糖醛酸鹽殘基組成。優(yōu)選的變體可選自以下變體菌株Pf2012、Pf2013、Pf20118和Pf20137。
在本發(fā)明的第三方面包含一種熒光假單胞菌的純的突變菌株，其中，所述突變體能夠生產(chǎn)大量藻酸鹽，具有規(guī)定的古洛糖醛酸鹽殘基(G)-含量，該含量在0和30之間。該實施方案可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)，通過用突變基因交換野生型algG基因，或改變algG基因，使之編碼具有比野生型酶更低的特異活性的甘露糖醛酸C-5-差向異構酶。
在本發(fā)明的第四方面，熒光假單胞菌的純的突變菌株能夠生產(chǎn)大量O-乙?；鶖?shù)目未減少或減少的藻酸鹽。該實施方案可通過刪除部分或全部的algI、algJ和/或algF基因來生產(chǎn)。突變變體菌株Pf20118algIJΔ和Pf20118algFΔ能夠生產(chǎn)大量O-乙?；鶖?shù)目未減少或減少的藻酸鹽，代表本發(fā)明的這個方面的優(yōu)選實施方案。
在本發(fā)明的第五方面，熒光假單胞菌的純的突變菌株能夠生產(chǎn)大量具有所需分子量的藻酸鹽，藻酸鹽的分子量優(yōu)選在50,000和3,000,000道爾頓之間。該實施方案可通過用具有比野生型裂解酶更低的特異活性的編碼藻酸鹽裂解酶的突變基因交換野生型algL。純的突變變體菌株Pf20118AlgLH203R代表所述突變體的優(yōu)選的實施方案，其能夠生產(chǎn)大量具有所需分子量的藻酸鹽。
在本發(fā)明的第六方面，熒光假單胞菌的純的突變菌株能夠生產(chǎn)大量藻酸鹽，包含一種藻酸鹽生物合成操縱子，其由一種與天然存在的啟動子不同的誘導型啟動子調節(jié)，以及包含任選地一種或多種效應基因。所述誘導型啟動子優(yōu)選Pm啟動子，效應基因是xylS。在一種優(yōu)選的實施方案中，所述突變菌株是Pf201MC。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的新的熒光假單胞菌突變菌株的方法，其中(a)將熒光假單胞菌野生菌株與一種誘變劑接觸，和(b)使步驟(a)中處理的細菌在一種或多種抗生素存在下生長，和(c)通過選擇分離抗生素抗性的黏液型突變體；和(d)確定步驟(c)分離的黏液型突變體的藻酸鹽生產(chǎn)特性。
步驟(a)的誘變劑優(yōu)選亞硝基胍，并且在步驟(b)中應用的抗生素是β-內酰胺和/或氨基糖苷抗生素，優(yōu)選所述抗生素是羧芐青霉素?？股乜梢?00-1000μg/ml培養(yǎng)基的范圍存在，更優(yōu)選的是900μg/ml培養(yǎng)基的量。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種生產(chǎn)熒光假單胞菌突變菌株的方法，所述熒光假單胞菌突變菌株能夠生產(chǎn)大量藻酸鹽，該藻酸鹽的生物合成操縱子由一種與天然存在的啟動子不同的誘導型啟動子調節(jié)，以及任選地一種或多種效應基因。其中(i)通過同源重組，熒光假單胞菌野生菌株的藻酸鹽生物合成操縱子被一種誘導型啟動子更換，和(ii)通過同源重組、轉位子誘變或通過質粒的方式，將任選的效應基因引入到(i)的細菌中，和(iii)使突變體生長，然后通過選擇進行分離，和(iv)確定(iii)中分離的突變體的藻酸鹽生產(chǎn)特性。
在本發(fā)明的方法的一種實施方案中，誘導型啟動子是來自P.putida Tol-質粒的Pm，或變異的Pm啟動子，如在實施例9中所列舉的。
在本發(fā)明的其它方面，包含一種生產(chǎn)權利要求8所述熒光假單胞菌突變菌株的方法，其中(a)將編碼C-5差向異構酶的野生型algG基因克隆入一種質?；蛐⌒娃D位子，并通過化學誘變或通過PCR進行誘變，(b)構建一種熒光假單胞菌的藻酸鹽生產(chǎn)菌株的衍生物，其缺少algG基因(ΔalgG-菌株)，和(c)步驟(a)的誘變的algG的文庫被轉移到熒光假單胞菌的ΔalgG-菌株，并鑒定和測定所述包含質?；蜣D位子的菌株的藻酸鹽生產(chǎn)和差向異構酶活性，和(d)通過步驟(c)的測定，鑒定出包含質粒或轉位子的菌株，其包含編碼差向異構酶的突變algG，可提供古洛糖醛酸鹽殘基含量在0和30％之間的藻酸鹽，和(e)將突變的algG基因克隆入基因-置換載體，和(f)然后將步驟(e)的基因置換載體轉移到熒光假單胞菌的藻酸鹽生產(chǎn)菌株，以用突變的algG基因置換其algG基因，并使它能夠表達突變基因。
本發(fā)明的另一個方面涉及進一步的生產(chǎn)權利要求8的熒光假單胞菌突變菌株的方法，其中a)通過位點-特異的誘變，在基因水平上將一種或多種通過誘變和其后的篩選鑒定為對于差向異構作用重要的氨基酸和與突變型和野生型AlgG-蛋白中產(chǎn)生的氨基酸都不同的氨基酸交換，和b)將突變基因克隆入基因置換載體，并將該載體轉移入熒光假單胞菌的生產(chǎn)藻酸鹽的菌株中，其取代了野生型algG基因，并能夠被表達。
在本發(fā)明的其它方面，如這里所述，提供了至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物的應用，以及應用生產(chǎn)的藻酸鹽制備食品或工業(yè)產(chǎn)品，如藥物、化妝品、動物飼料或營養(yǎng)品，或作為一種用于體外C-5-差向異構作用的中間產(chǎn)物。
本發(fā)明的突變菌株Pf201、Pf2012、Pf2013、Pf20118、Pf20137、Pf20118algFΔ、Pf20118algIJΔ、Pf20118AlgLH203R和Pf201MC已被保藏在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)中，日期為2002年7月16日，保藏編號分別如下41137、41138、41139、41140、41141、41142、41143、41144和41145。所述保藏根據(jù)布達佩斯條約執(zhí)行。
定義本發(fā)明的新的突變菌株及其變體，生產(chǎn)大量藻酸鹽，這里使用的“大量”是指每升至少10g藻酸鹽。每升培養(yǎng)基10g藻酸鹽的量優(yōu)選獲自每升培養(yǎng)基40-55g碳源，更優(yōu)選獲自每升培養(yǎng)基50-55g碳源，或最優(yōu)選獲自每升培養(yǎng)基40g碳源。藻酸鹽產(chǎn)量可達到35g藻酸鹽每升，但是更常見的是達到所用碳源重量的約20％-50％的量。
合適的“碳源”可選自但不限于單糖、二糖、寡糖、多糖、乙醇、有機酸，比如果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉、乳清、糖蜜、糖漿或乳酸(乳酸鹽)，也包括其它如標準的教科書中闡述的碳源，如可使用《系統(tǒng)細菌學Bergeys手冊》(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)，編者為Noel R.和JohnG.Holt，1984，巴爾的摩，美國。應理解，碳源不必被轉化成它們相應的磷酸丙糖，在它們可被突變菌株利用于藻酸鹽生產(chǎn)之前通過Entner-Doudoroff途徑利用通常將產(chǎn)生最高的產(chǎn)量，Banerjee等，J.Bacteriol.，1983，p.238-245。優(yōu)選通過本發(fā)明的熒光假單胞菌突變菌株生產(chǎn)多于每升培養(yǎng)基10g藻酸鹽，在如果40g果糖或甘油每升培養(yǎng)基被用作碳源的前提下獲得。大規(guī)模的藻酸鹽生產(chǎn)可在任何本領域熟練人員已知的合適的工具中進行，但優(yōu)選在發(fā)酵罐中進行。發(fā)酵是分批的、饋料批次的或連續(xù)的，可能伴隨著加入碳源和其它合適的成分。發(fā)酵的溫度在5-35℃的區(qū)間上。該區(qū)間的低位可在某些情況下被選擇，但優(yōu)選的發(fā)酵在20℃到30℃的溫度下進行。
培養(yǎng)基、氧氣、pH、發(fā)酵時間、攪拌和其它可能的發(fā)酵條件的選擇是本領域的常規(guī)知識，應理解，大量兩種或多種條件的組合可產(chǎn)生同樣高的藻酸鹽產(chǎn)量，本發(fā)明不限于這些條件的特異組合。
在本發(fā)明中，突變菌株及其變體是“穩(wěn)定的”，就是說，當它們生長超過60代時，它們不會回復到不能生產(chǎn)藻酸鹽的菌株。突變體生長在搖瓶中的PIA-培養(yǎng)基中，在如“材料和方法”中闡述的標準培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，除了每24個小時將培養(yǎng)基用新鮮的PIA-培養(yǎng)基取代之外(連續(xù)培養(yǎng))。
這里的“突變菌株”包含熒光假單胞菌Pf201的突變菌株，以及變體突變菌株，它們都能大量生產(chǎn)藻酸鹽。在優(yōu)選的實施方案中，“突變菌株”是指熒光假單胞菌Pf201的突變菌株，它們都能生產(chǎn)大量藻酸鹽。變體可以是Pf201突變菌株的進一步誘變和/或進一步遺傳改造的結果，或是野生型熒光假單胞菌菌株的遺傳改造或誘變的結果。所述變體將生產(chǎn)大量具有某種規(guī)定的結構的藻酸鹽。同樣，包含任何這里規(guī)定的突變的組合的變體也被覆蓋在這里的表述中。
本發(fā)明生產(chǎn)的藻酸鹽將具有“所需的分子量”。優(yōu)選地，藻酸鹽的分子量(Mw.)范圍為50,000至3,000,000道爾頓；更優(yōu)選地，范圍在200,000至2,000,000道爾頓；最優(yōu)選地，生產(chǎn)高于300,000道爾頓的藻酸鹽。
這里所表述的“生物學活性的藻酸鹽”是指對生物系統(tǒng)具有影響的藻酸鹽，即某些生物活性藻酸鹽分子結構已知可誘導某種細胞系統(tǒng)的生物反應。這些生物藻酸鹽具有低含量的古洛糖醛酸鹽(古洛糖醛酸鹽)殘基，總糖醛酸含量為0-30％，并且優(yōu)選古洛糖醛酸鹽含量在1％和15％之間，更優(yōu)選在1％和10％以內。
附圖簡述

圖1自殺載體pHE55和pMG48的限制性核酸內切酶圖譜，參見表1。僅顯示了特有的限制酶位點。
圖2在發(fā)酵中，熒光假單胞菌NCIMB 10525突變菌株的生長和藻酸鹽生產(chǎn)。
圖3由熒光假單胞菌突變菌株Pf201和Pf20118產(chǎn)生的藻酸鹽的1H-NMR-光譜。來自其它差向異構酶陰性突變體(表3)的甘露糖醛酸的1H-NMR-光譜與Pf20118的光譜相同。
圖4顯示來自熒光假單胞菌的藻酸鹽生物合成操縱子和上游開放讀框。在圖譜線上，克隆的片段被標記為盒子。僅顯示用于克隆的限制位點。全長是18kb。
圖5質粒pMC1的限制性核酸內切酶圖譜。僅顯示獨特的限制酶。
材料和方法的全面描述用于細菌生長的起始材料和培養(yǎng)基應用于本發(fā)明的細菌菌株、噬菌體和質粒列舉在下表1中。大腸桿菌和熒光假單胞菌菌株通常生長在LB培養(yǎng)基中(10g/l胰化蛋白胨、5g/l酵母提取物以及5g/lNaCl)，或生長在LA-培養(yǎng)基上(它是包含15g/l瓊脂的LB-培養(yǎng)基)，分別在7℃和30℃培養(yǎng)。假單胞菌分離瓊脂(PIA，Difco)也被用于熒光假單胞菌的繁殖。用于λ噬菌體繁殖的大腸桿菌生長在添加麥芽糖(0.2％)和MgSO4(10mM)的LB-培養(yǎng)基中?？股禺斢迷诔Ｒ?guī)生長實驗中時，以以下濃度存在青霉素100-200μg/ml，卡那霉素40μg/ml，四環(huán)素12.5μg/ml(大腸桿菌)和30μg/ml(熒光假單胞菌)。
熒光假單胞菌藻酸鹽的生產(chǎn)培養(yǎng)基和生長條件培養(yǎng)基在搖瓶實驗中藻酸鹽的生產(chǎn)使用PIA-培養(yǎng)基進行，包含細菌蛋白胨(20g/l)、MgCl2(1.4g/l)、NaCl(5g/l)、K2SO4(10g/l)和87％甘油(20ml/l)，或在具有減少鹽的PIA-培養(yǎng)基(沒有K2SO4的PIA-培養(yǎng)基)中進行。除非另外說明，加入蛋白酶(Alkalase2.41(0.15ml/l)和Neutrase 0.51(0.15ml/l))以降低細胞外藻酸鹽裂解活性。Alkalase和Neutrase購自Novo Nordisk。
在發(fā)酵罐中藻酸鹽的生產(chǎn)在PM5-培養(yǎng)基中進行，該培養(yǎng)基中含有果糖(40g/l)、酵母提取物(12g/l)、(NH4)2SO4(0.6g/l)、Na2HPO4×2H2O(2g/l)、NaCl(11.7g/l)、MgSO4×7H2O(0.3g/l)和clerol FBA(防沫劑)(0.5g/l)。加入蛋白酶(Alkalase2.41(0.25ml/l)和Neutrase 0.51(0.25ml/l))以降低細胞外藻酸鹽裂解活性。
標準接種體的制備(以甘油作為防冷凍劑，與甘油冰凍培養(yǎng))從瓊脂板上將一個克隆(30℃培養(yǎng)2-3天，PIA-培養(yǎng)基)轉移到含有100ml LB-培養(yǎng)基的搖瓶(500ml，帶有擋板)中。將搖瓶置于定軌搖床(200rpm，振幅2.5cm)上在30℃培養(yǎng)16-20小時。需要保存時，在培養(yǎng)基中加入滅菌的甘油至濃度15％。將混合物轉移到滅菌的低溫瓶(Nunc)中，儲藏在-80℃。
制備用于搖瓶和發(fā)酵罐生產(chǎn)實驗的接種物將1ml標準接種物轉移到含有100ml LB-培養(yǎng)基的搖瓶(500ml，帶有擋板)中。將搖瓶在30℃在定軌搖床(200rpm，振幅2.5cm)上培養(yǎng)16-20小時。
在搖瓶中藻酸鹽的生產(chǎn)1-2體積％接種物(見上)轉移到含有100ml PIA-培養(yǎng)基或減少鹽的PIA-培養(yǎng)基的搖瓶(500ml，帶有擋板)中。搖瓶在25℃在定軌搖床(200rpm，振幅2.5cm)上培養(yǎng)48小時。
在發(fā)酵罐中藻酸鹽的生產(chǎn)2-3體積％來自搖瓶的接種物轉移到含有1.4升PM5-培養(yǎng)基的3-升發(fā)酵罐(Applicon)中。發(fā)酵在25℃下進行。從開始時pH調節(jié)到7.0-7.2。pH用NaOH(2M)控制在7.0，并且當pH到達該值時pH-控制被活化。最初的8小時，培養(yǎng)基的氣流為0.25升/升培養(yǎng)基(vvm)，然后逐步地升高到0.9-1.0vvm。溶解氧通過攪拌速度自動控制在20％飽和。
適用的標準技術質粒分離、DNA的酶處理和凝膠電泳通過“Sambrook和Russell，2000，分子克隆實驗手冊(Molecular CloningA Lavoratory Manual)(第三版)，冷泉港實驗室出版社”描述的方法進行。使用Qiaquick凝膠抽提試劑盒以及Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)分別用于從瓊脂糖凝膠中純化DNA以及酶反應。大腸桿菌的轉化如Chung等，1989，Proc Natl Acad Sci USA，86，p.2172-2175中描述的進行，應用熱-休克-可用的氯化銣細胞。用于克隆和等位基因鑒定的的PCR應用Expand HighFidelity PCR-系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)進行。模板被用于質粒DNA或1μl的過夜熒光假單胞菌培養(yǎng)。在第一次變性步驟中，反應混合物被加熱到96℃3分鐘，以確保細胞裂解和DNA的完全變性。應用QuickChange位點-直接誘變試劑盒(Stratagene)進行位點-特異的誘變。引物顯示在表2中，購自Medprobe或購自MWG-Biotech AG。引物中的核苷酸，不同于野生型序列中的那些被以加黑標明，限制酶位點被加以下劃線。應用Big-Dye試劑盒(Applied Biosystems)進行DNA測序。
用在熒光假單胞菌中的自殺載體的構建為了在熒光假單胞菌中獲得同源重組，構建兩種不同的自殺載體pHE55和pMG48，參見圖1。pHE55的構建描述在表1中。它是一種基于RK2的載體，缺少編碼TrfA的基因，其對于質粒的復制是必要的。它進一步還對青霉素和四環(huán)素具有抗性，可被用于選擇完整體。來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的編碼果聚糖蔗糖酶的sacB的表達已經(jīng)顯示對于許多生長在5％蔗糖上的革蘭氏陰性菌是致命的(Gay等，1985，J.Bacteriol.，164，p.918-921)。然而，在熒光假單胞菌的菌株NCIMB10525中，在蔗糖上生長非黏液型的和四環(huán)素抗性的轉化結合子導致透明的克隆，似乎該菌株應用蔗糖生成聚合體。SacB和蔗糖的選擇不能用于該菌株，以肯定地選擇雙交叉結果。pHE55在一些實驗中被用作自殺載體，其中藻酸鹽生產(chǎn)可被用作一種標記。
質粒pMG48被構建為一種選擇性重組載體。pHE55的sacB基因被編碼TrfA-LacZ融合蛋白的基因取代，如表1中所描述的。該蛋白顯示β-半乳糖苷酶活性，但是失去了TrfA的基本部分。應用包含XGal(5-溴-4-氯-3-吲哚酰β-D-吡喃半乳糖)的板，加入60μl的20mg/ml儲存液到每個用于篩選的瓊脂板上。β-半乳糖苷酶活性可進行藍/白篩選，選出完整體(藍色克隆)以及后來用于第二次重組事件的(白色克隆)。
同源重組包含感興趣的突變的DNA序列，點突變、插入或刪除的以及每邊上至少0.5kb的側翼DNA被克隆入自殺載體中，pHE55或pMG48。轉化了感興趣的質粒的大腸桿菌S17.1和待突變的熒光假單胞菌被培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中過夜。然后將它們培養(yǎng)在新鮮的LB培養(yǎng)基中，使用1％接種。在結合前，大腸桿菌生長2小時，熒光假單胞菌生長4小時。然后將1ml的每種培養(yǎng)物混合，在3000rpm離心15分鐘。移走大多數(shù)上清，將細胞重新懸浮在剩余液體中。包含細胞的小滴被轉移到LA-培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)過夜。細胞由滅菌刮刀轉移，重新懸浮在LB-培養(yǎng)基中，稀釋物被涂在假單胞菌分離瓊脂(PIA，Difco)上，當載體需要籃/白選擇時，瓊脂上帶有適當?shù)目股睾蚗-Gal。每種甘露糖醛酸生產(chǎn)菌株的非黏液型轉化結合子克隆被培養(yǎng)在2-6順序的液體過夜培養(yǎng)基中，其中缺少四環(huán)素，允許完整質粒的喪失。指數(shù)生長培養(yǎng)被稀釋104-109倍，涂布在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上，篩選不同的菌株。
通過NMR-光譜測量藻酸鹽的G-含量和O-乙?；潭劝l(fā)酵樣品稀釋在0.2M NaCl中，離心以移走細菌細胞。為了制備用于確定乙酰化程度的樣品，通過加入1體積的異丙醇(4℃)，將藻酸鹽從去除細胞的上清中沉淀，然后離心收集。然后將離心的藻酸鹽用70％乙醇洗滌2次，用96％乙醇洗滌一次，在進一步處理前重新溶解在蒸餾水中。為了制備用于確定G-含量的樣品，通過溫和的堿處理，將藻酸鹽從去除細胞的上清中脫去乙?；鏓rtesvag和Skjak-Brk，1999，生物技術方法10，碳水化合物生物技術草案，Bucke，pp.71-78，Humana出版社。通過加入HCl至pH2進行酸沉淀，脫去乙?；脑逅猁}被從去除細胞的上清中分離。沉淀的藻酸鹽離心收集，重新溶解在蒸餾水中，用堿中和。為了減少用于NMR分析的聚合體的粘性，將樣品用溫和的酸水解至最終平均聚合程度(DPn)約35，即聚合物鏈中有35個殘基，中和并冷凍干燥，Ertesvag和Skjak-Brk，1999，supra。應用Bruker 300-MHz光譜儀獲得NMR-光譜。將光譜匯總，古洛糖醛酸鹽殘基(FG)、甘露糖醛酸鹽阻滯殘基(FMM)和交互的阻滯殘基(FMG＝GM)，以及乙酰化程度根據(jù)Grasdalen，1983，Carbohydr.Res.，118，p.255-260和Skjak-Brk，Grasdalen和Larsen，1986，Carbohydr.Res.，154，p.239-250中所描述的進行計算。
測量藻酸鹽的自身粘性以及在發(fā)酵樣品中直接測量藻酸鹽含量如前所述，產(chǎn)生的藻酸鹽被分離、去乙?；?、酸沉淀、重新溶解和中和。在中和后的藻酸鹽溶液中加入異丙醇，再次沉淀藻酸鹽。沉淀的藻酸鹽用乙醇洗滌兩次(第一次70％乙醇，然后96％乙醇)，重新溶解在蒸餾水中，透析48小時。透析后的樣品冷凍干燥和稱重。藻酸鹽的自身粘性在可自動稀釋的Scott-Gerate裝置上確定，應用Ubbelodhe毛細管(Φ＝0.53mm)、20℃，并添加0.1M NaCl的鹽濃度。該方法的原理如Haug和Smidsrod，1962，Acta.Chem.Scand.，16，p1569-1578中所描述的。
發(fā)酵樣品中藻酸鹽含量的酶測定藻酸鹽含量應用來自鮑魚的M-特異的裂解酶以及來自Klebsiella aerogenes的G-裂解酶測量，如stgaard，1992，19，Carbohydr.Polymers，p.51-59所描述的。
發(fā)酵樣品在0.2M NaCl中稀釋(2-20倍)，如前所述離心移走細菌細胞，脫去乙酰基。然后將去乙?；臉悠吩诰彌_液(Tris-HCl(50mM)、NaCl(0.25M)、pH7.5)中稀釋至終濃度0.005-0.05％藻酸鹽。LF10/60(FMC Biopolymer AS)或甘露糖醛酸，如這里所述生產(chǎn)和測量，被用作該測定的自訴標準。在測定中，1體積的樣品或標準以及0.06體積的藻酸鹽裂解酶溶液(約1u/ml)被加入到2體積的緩沖液(Tris-HCl(50mM)、NaCl(0.25M)、pH7.5)中，在25℃培養(yǎng)3小時。在培養(yǎng)之前和之后記錄在230nm的吸光率。培養(yǎng)前后A230nm吸光率值的不同被用于計算樣品中的藻酸鹽含量。應用該測定所得結果與前述直接測量所得藻酸鹽含量密切相關。
裂解酶活性的測定通過離心收集發(fā)酵的細菌細胞，重懸在緩沖液(Tris-HCl(50mM)、NaCl(0.25M)、pH7.5)中，至660nm處光密度3-10，并進行聲波處理。測量聲波處理后的提取物的裂解酶活性。來自鮑魚的M-裂解酶(如stgaard，1992，19，Carbohydr.Polymers，p.51-59所述)被用作標準。樣品中的裂解酶活性通過測量甘露糖醛酸的降解率來確定，應用Scott-Gerate Ubbelodhe(instrumentnr.53620/ll)。甘露糖醛酸(1mg/ml)溶解在緩沖液(Tris-HCl(12.5mM)、NaCl(62.5mM)、pH7.5)中。4ml的甘露糖醛酸底物溶液和0.4ml的稀釋的標準溶液、或樣品被加入到Ubbelodhe毛細管中。在1小時的時間周期中每2分鐘測量溶液通過Ubbelodhe毛細管的時間。分析在25℃下進行?；趤碜苑治龅臄?shù)據(jù)，計算甘露糖醛酸的降解率，與樣品中裂解酶的活性相關聯(lián)。應用鮑魚M-裂解酶作為標準(0005-0.05u/ml)，獲得一條標準曲線。1單位的裂解酶活性如Ertesvag等，J.Bacteriol.(1998)，180，p.3779-3784中所描述的來定義。
表1.應用的細菌菌株，質粒和噬菌體
表2應用的引物
*引物以5’-3’方向書寫。在原始序列中沒有顯示的核苷酸用加黑標記。引入的限制位點以下劃線表示本發(fā)明的實施例實施例1突變菌株Pf201的制備野生型熒光假單胞菌NCIMB 10525購自國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)。野生型不生產(chǎn)顯著量的藻酸鹽。為了分離過量生產(chǎn)藻酸鹽的突變體，將指數(shù)生長的熒光假單胞菌NCIMB 10525用亞硝基胍(NG)誘變。菌株生長在含有0.5％的酵母提取物的營養(yǎng)肉湯中(CM67，Oxoid)，在0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH5.5)中洗滌2次，然后用25μg/ml亞硝基胍(NG)處理細胞，在檸檬酸鹽緩沖液中30℃進行1小時。經(jīng)誘變的細胞用pH7.0的包含KH2PO4(13.6g/l)和NaOH(約2.32g/l)的0.1M磷酸緩沖液洗滌，接種(2％)到含有酵母提取物的營養(yǎng)肉湯中。細胞生長過夜，然后以1ml等分的NG-儲存液冰凍。
將培養(yǎng)的稀釋物涂布在包含羧芐青霉素(900μg/ml)的PIA-培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)。觀察到少量的黏液型突變體。通過包括觀察多于4×105個克隆的篩選，選出兩個最具黏液型的突變體，用于進一步在發(fā)酵研究中評估。更好的突變體Pf201在發(fā)酵中產(chǎn)生11-13g的藻酸鹽每升PM5-培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中每升包含40g果糖作為碳源，如圖2所顯示的。生長條件和培養(yǎng)基組合物可參考“材料和方法”。應用包含果糖的PM5-培養(yǎng)基，在標準的生長條件下，由Pf201突變體產(chǎn)生的藻酸鹽包含約30％G(古洛糖醛酸鹽殘基)，完全不存在G-阻滯，如可在圖3中所評估的?；讵毺氐脑逅猁}生產(chǎn)特性，Pf201菌株被選擇用于進一步的菌株開發(fā)。實施例1的熒光假單胞菌突變體Pf201保藏在NCIMB中，保藏編號為41137。
實施例2
藻酸鹽生物合成操縱子部分的克隆和測序在λDASH II(lambda Dash II)(購自Stratagene)中構建野生菌株NCIMB10525的基因文庫。如Ausubel等，1983，Current protocols in molecular biology(GreenePublishing Association，Inc和John Wiley&Sons Inc，紐約)中所描述的方法分離染色體DNA。然后通過將來自NCIMB 10525的部分Sau3AI-消化的染色體DNA插入BamHI-消化的λDash II構建基因文庫，用體外包裝的噬菌體感染大腸桿菌XL-1Blue MRA(P2)，根據(jù)廠家的說明進行(Stratagene BamHI/Gigapack III GoldExtract)。通過應用DIG DNA標記和檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)，標記DNA-探針并檢測雜交的λ-克隆，根據(jù)廠家的說明進行。來自包含algG的pBBg10的3.8MfeI-NcoI DNA片段側翼連接來自熒光假單胞菌的部分algE和algX，被標記和用于篩選熒光假單胞菌文庫。一種雜交噬菌體，稱為Pfλ1，應用該系統(tǒng)被檢測到，并且應用Lambda Midi試劑盒(QIAGEN)分離λDNA。插入物作為SalI消化的DNA片段被亞克隆入pGEM11中，產(chǎn)生4中亞克隆pMG24-27。亞克隆的末端測序以及與熒光假單胞菌的藻酸鹽生物合成操縱子比較顯示，Pfλ1包含藻酸鹽生物合成操縱子的下游部分，從algE的3’部分起(圖4)。
pMG26和pMG27通過Quiagen Sequencing&Genomics來測序，獲得algGXLIJFA的全長序列。該基因構造似乎與以前報導的藻酸鹽生物合成簇相似，以前報導在May和Chakrabarty，1994，Trends Microbiol.，2，p.151-157，Rehm等，1996，J.Bacteriol.，178，p.5884-5889，Penaloza-Vazquez等，1997，J.Bacteriol.，179，p.4464-4472，Vazquez等，1999，Gene，232，p.217-222。序列已經(jīng)提交GenBank，其登錄號為AF527790。
實施例3差向異構酶陰性的變體菌株的制備實施例1中的突變菌株Pf201進行進一步的誘變，使用亞硝基胍，應用對實施例1的方法進行改變的方法。熒光假單胞菌NCIMB 10525的指數(shù)生長細胞用亞硝基胍(NG)誘變細菌細胞用等體積的Tris/馬來酸(TM)緩沖液(pH6.0，包含NH4SO4(1.0g/l)、CaCl2*2H2O(4.4mg/l)、KNO3(6.1mg/l)、馬來酸(5.8g/l)、Tris(羥甲基)-氨基甲烷(6.05g/l)、FeSO4*7H2O(0.25mg/l)和MgSO4*7H2O(0.1g/l))洗滌2次。細胞在80％原始培養(yǎng)體積的TM-緩沖液中重懸，在30℃與NG(50μg/ml)接觸1小時。經(jīng)誘變的細胞用0.1M磷酸緩沖液(pH7.0，包含KH2PO4(13.6g.l)和NaOH(約2.31g/l))洗滌，然后接種(2％接種物)到LB-培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。應用一種非誘變的等分培養(yǎng)物作為對照，計算出誘變過程的死亡率大約90％。在誘變后，培養(yǎng)物在LB培養(yǎng)基中生長過夜，細胞的稀釋物被涂布在LA培養(yǎng)基上，其還包含來自產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)的G-裂解酶(約0.1u/盤)，如Chitnis等，1990，J.Bacteriol.，172，p.2894-2900所描述的。G-裂解酶僅分裂藻酸鹽中G-M(古洛糖醛酸鹽-甘露糖醛酸鹽殘基)和G-G(古洛糖醛酸鹽-古洛糖醛酸鹽殘基)鍵，Haugen等，1990，Carbohydr.Res.，198，p.101-109。
在這種選擇板上，粘液樣突變體的出現(xiàn)頻率約為7500個中出現(xiàn)1個。一種黏液型突變體被分離并被命名為Pf20118。Pf20118在標準生長條件下生長在發(fā)酵罐中，應用PM5培養(yǎng)基，參見“材料和方法”。產(chǎn)生的聚合物用1H-NMR光譜儀分析。分析的結果顯示，該突變體產(chǎn)生純的甘露糖醛酸，參見圖3。用Pf20118進行了一些發(fā)酵，應用標準的生長條件和PM5-培養(yǎng)基。體積產(chǎn)量的范圍為每升14-16g甘露糖醛酸，從每升含40g果糖的培養(yǎng)基中獲得，進行約35小時的發(fā)酵。獲自Pf201的熒光假單胞菌突變體Pf20118在發(fā)酵罐中被進行了多于70次不同的發(fā)酵實驗，沒有一次顯示甘露糖醛酸生產(chǎn)特性的不穩(wěn)定。Pf201和Pf20118都已經(jīng)生長了60代，沒有出現(xiàn)非粘液樣克隆。盡管似乎很可能Pf20118在甘露糖醛酸C-5-差向異構酶基因algG中具有缺陷，不能排除該突變影響了其它蛋白，這些蛋白可能對于差向異構作用是必要的。引起甘露糖醛酸生產(chǎn)顯型的突變的初步的定位通過基因取代進行，用野生型algG取代每個突變體的algG等位基因。一種編碼野生型algG和algX下游的最初135bp的基因取代載體pMG31被構建，如表1。該質粒被連接到Pf20118中，如“材料和方法”中所述，應用包含四環(huán)素的PIA作為培養(yǎng)基。pMG31重組入algG，由于藻酸鹽生物合成操縱子的破壞，出現(xiàn)非粘液樣克隆。非粘液樣轉化結合子克隆在2-6連續(xù)的液體中培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)，其中不存在四環(huán)素，允許完整的質粒喪失。指數(shù)生長培養(yǎng)物被稀釋104-109倍，涂布在PIA瓊脂板上，篩選黏液型回復子。然后在包含G-裂解酶的L-瓊脂上將粘液樣克隆再劃線，檢測它們是否生產(chǎn)差向異構的藻酸鹽。發(fā)現(xiàn)一些非粘液樣回復子，證明該突變肯定在相應于pMG31的algGX’片段的DNA-片段中。algG基因通過PCR擴增，應用引物PfalgG3r和PfalgG4f，測序和突變的鑒定見表3。
三種其它差向異構酶陰性的突變衍生菌株根據(jù)前面提供的步驟制備，分別命名為Pf2012、Pf2013和Pf20137。它們在algG基因中都具有可識別的突變，在它們的AlgG基因產(chǎn)物中產(chǎn)生不同的氨基酸，如下面表3所提供的，該氨基酸的變化足以使蛋白失活。當在相同條件下生長時，突變體產(chǎn)生大約與Pf20118相同水平的純的甘露糖醛酸。突變體的差向異構酶的缺陷可通過與在pMG31中的野生型基因結合而被回復。
表3
表3中的突變菌株保藏在NCIMB中，Pf2012的NCIMB編號為41138，Pf2013的NCIMB編號為41139，Pf20118的NCIMB編號為41140，Pf20137的NCIMB編號為44141。
實施例4乙酰基轉移酶陰性以及修改的變體菌株Pf20118algFΔ和Pf20118algIJΔ的制備首先制作Pf20118algF刪除菌株，通過構建包含框內刪除algF部分的側序列的突變DNA-片段，然后將該片段與自殺載體pMG48相連，如表1所描述的。所得質粒，命名為pMG79，通過如“材料和方法”中所描述的結合方法，被轉移到熒光假單胞菌菌株Pf20118，該轉位結合子以在包含XGal和四環(huán)素的PIA-板上呈現(xiàn)藍色克隆而被選出。雙重組體以在包含XGal的PIA-板上呈現(xiàn)白色和黏液狀克隆被選出。這些候選菌株被進一步測試對四環(huán)素的敏感性。對24個白色、四環(huán)素敏感的候選菌株進行PCR檢測，應用表2中提供的引物對algF-1-Fw和algF-2-Rev，并且產(chǎn)物用凝膠電泳分析。22個候選菌株PCR-產(chǎn)物具有野生型algF-等位基因預期的長度(1.0kb)。然而，另外2個具有突變ΔalgF-等位基因預期的長度(0.7kb)。其中一個被命名為Pf20118algFΔ。
通過首先創(chuàng)建pMG27的衍生物(pMG49)，從pMG27上將包含261個algI的3’核苷酸和1140個algJ的5’核苷酸的1.4kb NruI-Hpal DNA-片段移走。該刪除結構編碼AlgI和AlgJ的框內融合，確保AlgF和AlgA可被正常翻譯。然后，將pMG49的3.4kb SacI-XbaI DNA-片段連接到經(jīng)相同的酶消化的自殺載體pHE55上，創(chuàng)建pMG50。通過結合大腸桿菌S17.1，該包含側翼刪除的序列的質粒被引入到Pf20118，在包含四環(huán)素的PIA-培養(yǎng)基上選擇非粘液樣轉化結合子。轉化結合子回復子在LA-培養(yǎng)基上以粘液樣四環(huán)素敏感克隆被鑒定。4個algIJΔ-突變體候選菌株通過PCR-擴增來檢測，檢測包含刪除區(qū)域的區(qū)域，應用引物對PfacetylFw和PfacetylRev(表2)，并且PCR-產(chǎn)物通過凝膠電泳分析。2個克隆包含野生型片段(1.8kb)，另2個克隆包含突變片段(0.4kb)。其中一個命名為Pf20118algIJΔ。Pf20118algFΔ和Pf20118algIJΔ在發(fā)酵罐中生長，采用PM5-培養(yǎng)基和標準生長條件，如“材料和方法”中所提供的，收集所得藻酸鹽，如前述方法測量。結果見下表4中。兩種突變體都生產(chǎn)甘露糖醛酸藻酸鹽，產(chǎn)量為每升培養(yǎng)基16-17g藻酸鹽。通過1H-NMR-光譜儀測定乙?；欠翊嬖冢纭安牧虾头椒ā彼枋龅摹f20118algFΔ不生產(chǎn)乙?；脑逅猁}，而Pf20118algIJΔ生產(chǎn)的藻酸鹽中包含少量O-乙酰基。
表4在發(fā)酵中，不同熒光假單胞菌菌株的藻酸鹽產(chǎn)量，古洛糖醛酸鹽殘基含量分數(shù)(FG)，乙?；潭?da)和自身粘度(η)
該發(fā)酵在3-1發(fā)酵罐中進行，應用PM5-培養(yǎng)基以及標準生長調節(jié)。分析如“材料和方法”中所述進行。
Pf20118algFΔ和Pf20118algIJΔ保藏在NCIMB中，保藏編號為41142和41143。
實施例5呈現(xiàn)低藻酸鹽裂解酶活性的修改的衍生突變菌株Pf20118AlgLH203R的制備根據(jù)現(xiàn)有知識，熒光假單胞菌菌只有一個藻酸鹽裂解酶(AlgL)，由基因algL編碼。因此，一種控制由該細菌生產(chǎn)的藻酸鹽的分子量的選擇是修改同時生產(chǎn)的AlgL基因產(chǎn)物。
在Pf20118的algL基因中，應用誘變引物對algLH203R1/algLH203R2創(chuàng)建His203Arg(H203R)突變。引物也包含靜止突變，創(chuàng)建AgeI-位點，用于等位基因鑒定。構建誘變質粒pMG70，如表1中所述，并通過結合進入到Pf20118染色體中，在含有四環(huán)素和XGal的PIA-培養(yǎng)基上選擇轉位結合子。轉位結合子生長在連續(xù)的不存在四環(huán)素的過夜培養(yǎng)基中，涂布在含有XGal的PIA-培養(yǎng)基上，分離AlgL突變。白色四環(huán)素敏感的突變候選菌株通過algL-等位基因的PCR-擴增篩選，應用引物PfalgL-BspHI-pMG26和PfalgLRevl(表2)，通過用AgeI消化PCR-片段來鑒定等位基因。選擇的突變菌株被命名為Pf20118AlgLH203R。
當變體菌株Pf20118AlgLH203R生長在含有減少鹽的PIA-培養(yǎng)基的搖瓶中時，它產(chǎn)生的甘露糖醛酸量大約與變體菌株Pf20118相同水平。同樣，生長在發(fā)酵罐中，這兩種變體菌株生產(chǎn)大約相同量的甘露糖醛酸(H203R生產(chǎn)每升12g甘露糖醛酸藻酸鹽)。在搖瓶中(使用減少鹽的PIA-培養(yǎng)基，不加入蛋白酶)，Pf20118(自身粘度為15dl/g)和Pf20118AlgLH203R(自身粘度為37dl/g)產(chǎn)生的甘露糖醛酸的自身粘度測量顯示，后者產(chǎn)生的甘露糖醛酸具有提高的分子量。Pf201產(chǎn)生的藻酸鹽具有的自身粘度類似Pf20118(14dl/g)。
在搖瓶發(fā)酵的最后，收集Pf201、Pf20118和Pf20118AlgLH203R的細菌細胞并進行聲波處理。在聲波處理后，分析提取物的藻酸鹽裂解酶活性，通過如“材料和方法”中提供的方法測量。定義Pf201的裂解酶活性為100％，使用該方法可以檢測低至2％的活性。Pf20118顯示93％活性。Pf20118AlgLH203R沒有檢測到活性，表明它是菌株Pf201活性的少于2％。然而，當?shù)鞍酌窤lkalase和Neutrase都以1.15ml/l加入后，Pf201和Pf20118的自身粘性升高到約50dl/g，Pf20118AlgLH203R的自身粘度升高到70dl/g，表明突變體裂解酶具有某些殘留活性。變體菌株Pf20118AlgLH203R保藏在NCIMB中，保藏編號為41144。
實施例6帶有降低的差向異構酶活性的變體突變菌株的制備突變菌株Pf201和Pf20118提供了體內制作藻酸鹽的工具，分別具有約30％古洛糖醛酸鹽殘基含量和純的甘露糖醛酸。具有在約0和30％之間的中間量古洛糖醛酸鹽(古洛糖醛酸鹽殘基)含量的藻酸鹽也可被制作。獲得這些菌株的一個途徑是從操縱子中刪除差向異構酶基因，然后將該由啟動子控制的基因引入到質?；蜣D位子上。質粒pMG53如表1所述構建，該質粒包含algG的變體，其中，內部40％的基因被移走。然后將該質粒轉移到Pf201中，通過同源重組，獲得包含該刪除的菌株，命名為Pf201ΔalgG。該菌株不能生產(chǎn)藻酸鹽，盡管它生產(chǎn)小的寡糖醛，在非還原末端包含一個不飽和的殘基。質粒pCNB111是自殺質粒，其包含一個基于Tn5的小型轉位子?；蚩杀豢寺∪朐撔⌒娃D位子，它們的表達由可誘導的Pm啟動子控制。野生型algG-基因被轉移到該質粒中，如表1所述，創(chuàng)建質粒pKB10。該質粒被結合到Pf201ΔalgG中，如在“材料和方法”中所描述的，通過同源重組。但是在這種情況中，合并入染色體依賴于轉位子，而非同源性。所得菌株命名為Pf201ΔalgG::TnkB10。該菌株即使在誘導物不存在的情況下也能生產(chǎn)藻酸鹽，但是隨著誘導物濃度的提高，聚合物的量提高(未顯示)。當產(chǎn)物用NMR和質譜儀分析時，發(fā)現(xiàn)該菌株生產(chǎn)藻酸鹽和低聚物的混合物。pKB10也被轉移到Pf20118，創(chuàng)建菌株Pf20118::TnKB10。該菌株生產(chǎn)野生型藻酸鹽的混合物，包含30％G和甘露糖醛酸(結果未顯示)。這些結果顯示，差向異構酶不僅對于藻酸鹽生產(chǎn)是必須的，它也作為蛋白復合物的一部分。為了獲得同源的藻酸鹽，僅可存在一種形式的藻酸鹽。
一種制備帶有降低的差向異構酶活性的變體菌株的方法是用編碼具有降低活性的突變蛋白的突變基因交換野生型algG?，F(xiàn)在建立了一種用于獲得所述突變體的方法，應用Pf201ΔalgG和pKB10的特性。大腸桿菌S17.1λ-pir(pKB10)的指數(shù)生長細胞(OD600nm0.5)通過亞硝基胍誘變。將來自5ml培養(yǎng)基的細胞在TM-緩沖液(1.0g/l(NH4)2SO4、0.1g/l MgSO4×7H2O、5mg/l Ca(NO3)2、0.25mg/l FeSO4×7H2O、5.8g/l馬來酸、6.05g/lTris，pH用NaOH調節(jié)到6.0)中洗滌2次。將細胞重新懸浮在2.85mlTM-緩沖液中，用100μg/ml亞硝基胍處理，37℃進行30分鐘。將懸浮液在冰上冷卻3分鐘，然后通過離心將細胞沉淀，在5ml LB中洗滌3次。加入甘油至終濃度10％，將該重新懸浮的懸浮液冰凍在-80℃。僅0.007％的細胞在誘變后存活。質粒被從解凍的細胞中分離，轉化到大腸桿菌S17.1λ-pir中。該質?，F(xiàn)在命名為pKB10-M*，以強調它們構成了一個pKB10突變方式的文庫。
然后將pKB10-M*結合到熒光假單胞菌Pf201ΔalgG中，如“材料和方法”部分(在“同源重組”中)所描述的，除了在與熒光假單胞菌菌株混合之前，將100μl冰凍的大腸桿菌S17.1λ-pir(pKB10-M*)直接培養(yǎng)在10ml LB-培養(yǎng)基中，生長2小時。每個培養(yǎng)的OD600nm是0.4。在培養(yǎng)在LA-培養(yǎng)基上30℃、36小時后，將結合混合物涂布在包含40μg/ml卡那霉素(Km)的PIA-培養(yǎng)基(Difco)上。只有那些轉位子TnKB10-M*已經(jīng)整合入染色體的熒光假單胞菌細胞將生長在該培養(yǎng)基上，引物pKB10和它的衍生物不能在熒光假單胞菌中復制。即使在誘導物不存在的情況下，一些AlgG被從熒光假單胞菌中的Pm-啟動子表達，其水平足以在菌株Pf201ΔalgG::TnKB10中引起黏液型克隆。約0.5％的克隆是非-黏液型的，表明或者這些細胞中algG基因由于Pm-啟動子或mRNA前導序列中產(chǎn)生突變而不表達，或者或AlgG蛋白是無功能的。
每個板(245×245mm)包含4-5000個克隆，并且使用克隆挑取工具(GenetixQ-pixII，Genetix Limited，英國)，其中1200至1400可從板上挑出。調節(jié)參數(shù)使小的(非黏液型)克隆不被挑出。開發(fā)了一種篩選包含突變文庫的菌株的方法。在該篩選中，參數(shù)細胞生長、藻酸鹽生產(chǎn)(應用M-和G-裂解酶的混合物測量)和G-含量(僅應用G-裂解酶測量)被分別測量。
細菌生長使用Genetix Q-pixII克隆挑取工具，將克隆一式兩份加入到兩種不同的置于96孔板的液體培養(yǎng)基中。為了保存克隆，一份生長在110μl包含三氯生(0.025g/l)和卡那霉素(Km，40mg/l)的LB-培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)48小時。每個孔中加入甘油(60％，40μl)，將溶液混合，并將板冰凍在-80℃。
另一份生長在0.5×PIA(細菌蛋白胨(10g/l)、NaCl(2g/l)、MgCl2(0.7g/l)、K2SO4(5g/l)、甘油(5g/l)、三氯生(0.025g/l)和Km(40mg/l))中，加入m-甲苯甲酸鹽(誘導物)至0.1mM。細菌生長在滅菌的Nunc 96-V-孔板中，每孔包含110μl培養(yǎng)基，在25℃培養(yǎng)72小時，使用900rpm、3mm振幅軌道運動。
藻酸鹽生產(chǎn)的測定在每個孔中加入NaCl(0.2M，120μl)，離心(3900g，200℃，30分鐘)使細胞沉淀。從每孔中轉移50μl上清到Nunc96-flatwell板上。通過在每個孔中加入NaOH(0.6M，10μl)使藻酸鹽脫去乙?；?，混合25秒，在室溫培養(yǎng)1小時。然后加入100μl裂解酶反應緩沖液(50mM Tris-HCl，1.5％NaCl(pH7.5))，溶液混合60秒。
從每孔中轉移75μl至Costar-UV 96-孔板。再加入150μl裂解酶反應緩沖液，溶液混合25秒。讀取230nm(A2)的吸光率，然后每孔中加入8μl的G-特異的藻酸鹽裂解酶(0.2u/ml)。溶液混合25秒，室溫下培養(yǎng)60分鐘。溶液再次混合25秒，讀取A230nm(A2)。然后每孔加入8μl的M-特異的藻酸鹽裂解酶(1u/ml)，溶液混合25秒，再室溫下培養(yǎng)60分鐘。溶液再次混合25秒，讀取A230nm(A3)。加入的裂解酶的吸光率被從A2和A3讀取值中減除。使用已知成分的藻酸鹽(由Pf20118產(chǎn)生的多聚甘露糖醛酸鹽，以及由Pf201產(chǎn)生的具有30％G-含量的藻酸鹽)作為本測定的標準。
基于以下公式計算藻酸鹽的總量Aalg＝A3-A1通過比較樣品的Aalg與具有已知藻酸鹽濃度的標準的Aalg，計算樣品中的藻酸鹽濃度。
古洛糖醛酸鹽(G)含量的測定樣品中相對G-含量(Gr)通過以下公式計算Gr＝(A2-A1)/(A3-A1)通過比較樣品的Gr和標準的Gr，計算樣品中的G-含量。
1萬克隆通過這種途徑來篩選，選出少數(shù)候選克隆具有改變的活性，但不是零。然后使這些突變體在搖瓶中生長，如“材料和方法”中描述的。使用的PIA-培養(yǎng)基中加入了三氯生(0.025g/l)、卡那霉素(40mg/l)和m-甲苯甲酸鹽(0.1mM)，生產(chǎn)的藻酸鹽通過NMR分析，如“材料和方法”部分所描述的。一種突變體產(chǎn)生包含僅13％古洛糖醛酸鹽殘基的藻酸鹽，而野生型產(chǎn)生包含約30％古洛糖醛酸鹽殘基的藻酸鹽(表4)。也發(fā)現(xiàn)一些產(chǎn)生純的甘露糖醛酸的其它菌株。該方法使篩選比野生型產(chǎn)生更少古洛糖醛酸鹽的突變形式的AlgG成為可能。
為了生產(chǎn)進一步的產(chǎn)生所需藻酸鹽產(chǎn)物的變體突變菌株，可使用已知的PCR技術來使突變基因恢復，使用同源重組，克隆入pMG48并轉移入Pf201或任何實際上可過量生產(chǎn)的菌株，如在前面的描述中所描述的。類似于甘露糖醛酸生產(chǎn)菌株Pf2012、Pf2013、Pf20118和Pf20137，在algG中的一個點突變影響差向異構作用，而不影響藻酸鹽的生產(chǎn)量。
實施例7具有降低的差向異構酶活性的變體突變菌株的制備一種制備具有降低的差向異構酶活性的變體突變菌株的可選的方法是用編碼低活性突變蛋白的突變基因交換野生型algG。四種不同的氨基酸取代物顯示在表3中，獲得差向異構酶陰性的AlgG突變體。在這四種情況中，氨基酸的變化影響氨基酸的長度或電荷，它們中的兩種長度和電荷特性都發(fā)生了改變。通過實施例6中描述的方法，通過對突變體測序，也可鑒定出可能的附加氨基酸。在這些氨基酸中，編碼更多保守性變化的algG的可選擇的等位基因通過位點特異的誘變制造，使用pMG26作為模板。制作誘變引物，其包含一個編碼新的氨基酸的密碼子，加上約10-15個與已知序列相同的核苷酸。在Ser337的突變將毀壞SmlI位點，用于其它氨基酸的引物優(yōu)選包含靜止突變，引入一個限制酶位點，以協(xié)助鑒定新的突變菌株。用于每條鏈的引物進行合成，并如“材料和方法”中所描述的進行誘變。然后將突變的algG-等位基因以2.7kb BspHI-PstI消化的DNA片段轉移到用NsiI-NcoI消化的pMG48。所得質粒轉移到Pf201，選擇非黏液型的、四環(huán)素抗性的、在包含XGal的瓊脂板上呈現(xiàn)藍色的轉位結合子。在生長后，一些選擇的克隆連續(xù)轉移到LB-培養(yǎng)基中，雙重組子在包含XGal的瓊脂板上呈現(xiàn)白色、黏液型克隆，對四環(huán)素敏感。可擴增這些候選克隆的algG，使用引物對PfalgG5f和PfalgG3r。擴增的產(chǎn)物1.7kb長。如果移走一個限制位點，或通過引物引入，正確的突變體可通過使用相應的限制酶來鑒定?？蛇x擇地，候選克隆通過DNA-測序來驗證。
突變菌株生長在搖瓶中，如“材料和方法”中描述的方法分離產(chǎn)生的藻酸鹽。藻酸鹽的量和G-含量通過M-裂解酶和G-裂解酶確定，如“材料和方法”中所述。從感興趣的菌株所得結果通過NMR-光譜驗證。
實施例8帶有用于調節(jié)藻酸鹽產(chǎn)量的可誘導Pm啟動子的變體突變菌株Pf201MC的制備已知Pm啟動子以及它的效應蛋白XylS是一種強效可誘導啟動子，其可被用在很多革蘭氏陰性菌中，Blatny等，1997，63，Appl.Environ.Microbiol.p.370-379。經(jīng)常使用的誘導物是甲苯甲酸鹽，其可通過細菌膜自由地擴散。熒光假單胞菌菌株Pf0-1目前已經(jīng)在JGI(The DOE Joint Genome Institute)上登出了序列(http://spider.jgipsf.org/JGI microbial/html/pseudomonas/pseudo homepage.html)。該菌株的藻酸鹽操縱子與已知的來自其它假單胞菌種類的藻酸鹽操縱子序列相比較，我們發(fā)現(xiàn)，它們的結構是相似的。所有測序的生產(chǎn)假單胞菌藻酸鹽的種類也具有相同的保守的開放讀框，位于藻酸鹽啟動子的上游。它潛在地編碼一種蛋白，其功能是未知的。本實驗的目的把終止密碼子下游的序列交換為該開放讀框，并把起始密碼子的上游交換為algD，藻酸鹽操縱子的第一個基因，帶有編碼XylS的序列，Pm啟動子和來自載體pJB658的Shine-Dalgarno序列描述在Blatny等，1997，38，p.35-51。多數(shù)DNA-片段，其在pJB658中分離xylS和Pm啟動子，被移走。
第一步是克隆假設蛋白(簡寫的hyp)的3’部分和algD的5’部分，以獲得用于插入的側序列。當菌株Pf0-1的algEGXLIJFA序列與NCIMB10525序列相比較時，發(fā)現(xiàn)該兩個序列不是相同的。然后使用部分hyp和algD基因構建引物，它們在一些種類中高度保守。Hyp的3’部分作為0.7kb BspLU11I-SpeI-消化的PCR片段(使用表2中的引物HypBspLU11I和HypSpel)被克隆入自殺載體pMG48中，生成pHE139。algD的5’部分以0.8kb NdeI-NsiI限制的PCR片段被克隆入NdeI-PstI-限制的pJB658celB中，生成pHE138。然后，通過一系列的克隆步驟(表1)，構建替換的載體pMC1，參見圖5。
通過結合，將質粒轉移入菌株Pf201，如“材料和方法”中描述的。選擇XGal和四環(huán)素抗性/敏感性來篩選重組子和隨后的雙重組。選擇在包含1mM甲苯甲酸鹽的PIA-培養(yǎng)基上比在不包含甲苯甲酸鹽的培養(yǎng)基上更具黏液型特性的克隆，進行進一步PCR分析。應用引物對HypBspLU11I和AlgDNsiI(表2)，預期的野生菌株的PCR產(chǎn)物長度為2.3kb，而突變菌株是3.0kb。選出的菌株被命名為Pf201MC。然后將該菌株在作為誘導物的甲苯甲酸鹽(0.025mM)不存在和存在下進行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中使用PM5-培養(yǎng)基和標準條件，如“材料和方法”中所描述的。非誘導的培養(yǎng)每升培養(yǎng)基生產(chǎn)3.5g藻酸鹽，而誘導的培養(yǎng)每升培養(yǎng)基生產(chǎn)13g藻酸鹽。突變菌株Pf201MC保藏在NCIMB中，保藏編號為41145。
實施例9使用可誘導的突變的Pm啟動子調節(jié)藻酸鹽生產(chǎn)野生型Pm-啟動子能夠發(fā)揮作用，但是，非誘導水平的表達是相當高的。目前已經(jīng)發(fā)展了一種方法，篩選所述啟動子的突變體，基于Winther-Larsen等，Metabol.Eng.(2000)，2，p.92-103。改變原始的pJT19-bla，在Pm啟動子的上游插入一條終止序列和一個AflIII位點，啟動子下游的Spel位點改變?yōu)锽spLU11I位點。新的質粒命名為pIB11。在該質粒中，Pm啟動子帶有獨立的XbaI和BspLU11I限制位點。然后，覆蓋該DNA片段的兩條互補的50bp DNA-低聚體被合成。選擇條件以在使這些限制位點側翼鏈的核苷酸獲得約12％的錯誤率。相應的野生型鏈也被合成。然后，通過退火每個包含帶有互補野生型寡核苷酸的突變體的寡核苷酸，制作一個雙鏈的寡核苷酸文庫。寡核苷酸的末端被構建成可與由XbaI和BspLU11I限制的pIB11互補。然后將退火的寡核苷酸連接到由XbaI和BspLU11I限制的pIB11上，獲得50000轉化子。在大腸桿菌中，該文庫必須進行篩選，使用青霉素抗性作為標記。但是，熒光假單胞菌已經(jīng)存在相當高的β-內酰胺抗性。針對β-內酰胺酶的基因用編碼熒光素酶的基因交換，如表1中所描述的，創(chuàng)建包含野生型啟動子的載體pHH100以及包含啟動子文庫的pHH100-文庫。pH100-文庫包含8000個獨立的轉化子。然后通過如“材料和方法”中所述結合，將其轉移到熒光假單胞菌中。
使用Wood，K.V.和DeLuca，M.(1987，Anal.Biochem.161501-507)所描述的測定，篩選突變的Pm啟動子的文庫，找出具有熒光素酶活性的。為了獲得可再現(xiàn)的結果，我們發(fā)現(xiàn)細菌首先必須生長在包含110μl帶有40μg/ml卡那霉素(Km)的液體PIA培養(yǎng)基的微量滴定板上(25℃，48小時，900rpm搖動)。然后將一些細菌稀釋在新的培養(yǎng)基中，使用一種滅菌的印章來轉移，然后印在兩張尼龍濾紙上。濾紙置于帶有和不帶有誘導物(1mMm-甲苯甲酸鹽)的PIA-培養(yǎng)基上，細菌面朝上，在30℃培養(yǎng)14小時。然后將濾紙置于包含3ml蟲螢光素(Promega)(1mM在0.1M檸檬酸鈉中，pH5.0)的Petri盤上，搖動直至液體分布均勻，培養(yǎng)10分鐘。將其置于濾紙上以移走液體，并向下放置在透明的塑料膜上。一張干燥的濾紙置于其上，以移走殘留的潮濕。然后將尼龍膜曝光10分鐘，使用Kodak 2000IR相機。通過該方法篩選到1200克隆，鑒定出84個來自未加誘導物的生長克隆顯示沒有或低的活性，在誘導物存在下生長的克隆具有可檢測的活性。這些克隆中79個被重新篩選，與野生型pHH100相比，其中75個在誘導物不存在下顯示明顯的低活性。
這些克隆中6個生長在10ml包含50mg/l卡那霉素的LB中。選出5個，因為在沒有誘導物時它們的表達水平非常低，第6個(Pf201(pHH100-E1))在不加入誘導物時具有中等水平的表達，但是在誘導物存在下具有明顯高的表達水平。然后固定階段培養(yǎng)(100μl)被轉移到兩個包含10ml新鮮LB-培養(yǎng)基的搖瓶中，在加入m-甲苯甲酸鹽至終濃度1mM之前培養(yǎng)2小時。在誘導進行14小時后，收集培養(yǎng)液，將90μl培養(yǎng)液加入到包含10μl緩沖液(1M K2HPO4、20mM EDTA、pH7.8)的1.5ml試管中，冰凍在-80℃。使用Promega公司的熒光素酶測定系統(tǒng)(Cat.nr.E1500)測量熒光素酶活性(表5)。該方法證明，對于尋找與野生型相比，達到不僅非常低的非-誘導表達水平，也具有低的非-誘導表達水平以及仍然相當高的誘導表達水平的突變的啟動子是有用的。結果見下表。
表5在熒光假單胞菌中Pm表達的熒光素酶活性
菌株NCIMB被用作空白，沒有可測量的活性。顯示了每種菌株的兩個獨立的接種物所得平均結果。a活性以任意單位給出(其值依賴于儀器的設置)。b活性以野生型水平的百分數(shù)的百分數(shù)表示。c誘導的/非誘導的值。
實施例10甘露糖醛酸藻酶鹽產(chǎn)物的體外差向異構作用如實施例4中所述，產(chǎn)生的甘露糖醛酸溶解在緩沖液(Mops(50mM)、CaCl2(2.5mM)、NaCl(10mM)，pH6.9)中，至0.259％甘露糖醛酸藻酸鹽的濃度。如Ramstad等，Enzymeand Microbial Technology，(1999)，24，p.636-646所述生產(chǎn)和純化甘露糖醛酸C5-差向異構酶AlgE4，加入到甘露糖醛酸，濃度為1mg酶/200mg甘露糖醛酸。該溶液在37℃培養(yǎng)23小時。通過酸沉淀藻酸鹽，終止差向異構作用。然后將藻酸鹽重新溶解在蒸餾水中，用堿中和。在藻酸鹽溶液中加入NaCl至0.2％濃度，加入1體積的乙醇(96％)沉淀藻酸鹽。沉淀的藻酸鹽用70％乙醇洗滌3次，用96％乙醇洗滌2次，凍干。凍干的藻酸鹽進一步處理和用NMR分析，如“材料和方法”中所述。所得產(chǎn)物是幾乎完全聚合的交互的藻酸鹽(PolyMG，表6)。
Poly MG重新溶解在緩沖液(Mops(50mM)、CaCl2(2.5mM)、NaCl(10mM)，pH6.9)中。如Ramstad等，Enzyme and Microbial Technology，(1999)，24，p.636-646所述生產(chǎn)和純化甘露糖醛酸C5-差向異構酶AlgE4，除了將其僅通過離子交換層析進行純化。加入到甘露糖醛酸，濃度為1mg酶/200mg甘露糖醛酸。該溶液在37℃培養(yǎng)4天。在1、2和3天培養(yǎng)后，加入附加的AlgE1(1mg酶/200mg甘露糖醛酸)。如前所述終止差向異構作用。如前所述分離藻酸鹽和NMR分析。差向異構作用的結果是藻酸鹽具有＞95％的G-含量(表6)。
表6在用AlgE4和AlgE1對甘露糖醛酸進行差向異構作用后，藻酸鹽的組分
實施例11利用不同碳源的藻酸鹽生產(chǎn)已知假單胞菌具有利用許多化合物進行生長的能力。在本實施例中，使用PM5-培養(yǎng)基取代果糖作為實際的碳源，將不同的碳源變換為藻酸鹽的能力得到了證實。在發(fā)酵實驗中，培養(yǎng)基組分、生長條件和藻酸鹽濃度分析如“材料和方法的全面描述”中所描述的進行，除非另外作出說明。
生產(chǎn)藻酸鹽的能力通過乙醇(甘油)、單糖(果糖，葡萄糖)和二糖(乳糖)(見表7)證明。
熒光假單胞菌不編碼β-半乳糖苷酶，從而不能利用乳糖作為碳源，但它能生長在葡萄糖和半乳糖上。我們通過如在“描述”中同源重組那一段所描述的結合，將編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶(LacZ)和乳糖通透酶(lactose permase)(LacY)的pHM2(描述在Mostafa，H.E.，Heller，K.J.，Geis，A.2002.Appl.Environment.Microbiol.682619-2623)轉移入菌株Pf201。所得菌株成為Pf201(pHM2)。為了避免質粒遺失的問題，使用質粒pCNB111的衍生物，lacZ和lacy可優(yōu)選插入到染色體中。乳清，從干酪生產(chǎn)中所得廢品，包含高含量的乳糖。當Pf201(pHM2)生長在包含27.5％經(jīng)超濾的乳清的PM5-培養(yǎng)基中時，相當于培養(yǎng)基中含50.9g/l乳糖，生產(chǎn)出13.3g/l的藻酸鹽。
所得結果給出在表7中，表明通過藻酸鹽過量表達突變體菌株，可利用大量碳源生產(chǎn)大量藻酸鹽。
表7通過利用不同的碳源(C-源)，藻酸鹽的生產(chǎn)
1)所有碳源(40g/l)在發(fā)酵接種前加入。
2)在發(fā)酵開始之前，4.5g/l葡萄糖加入到培養(yǎng)基中。剩下的葡萄糖(35.5g/l)以連續(xù)的速率給料(1g葡萄糖/升，小時)。在接種10小時后葡萄糖-給料開始。
3)包含經(jīng)超濾的乳清作為主要成分乳糖以及礦物作為次要成分，加入到PM5培養(yǎng)基中。經(jīng)超濾的乳清也包含微量的牛乳蛋白。在加入超濾的乳清后，在培養(yǎng)基中乳糖濃度是51g/l。在發(fā)酵接種前加入經(jīng)超濾的乳清。
權利要求
1.至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述菌株每升培養(yǎng)基至少生產(chǎn)10g藻酸鹽。
2.如權利要求1所述的至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述菌株每升培養(yǎng)基每40-55g碳源至少生產(chǎn)10g藻酸鹽。
3.如權利要求1所述的至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述菌株每升培養(yǎng)基每50-55g碳源至少生產(chǎn)10g藻酸鹽。
4.如權利要求1所述的至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述菌株每升培養(yǎng)基每40g碳源至少生產(chǎn)10g藻酸鹽。
5.如權利要求1所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變菌株選自Pf201、Pf2012、Pf2013、Pf20118、Pf20137、Pf20118algIJΔ、Pf20118algFΔ、Pf20118AlgLH203R和Pf201MC。
6.如權利要求1所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變體能夠生產(chǎn)大量僅由甘露糖醛酸鹽殘基組成的藻酸鹽。
7.如權利要求5和6所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變體選自Pf2012、Pf2013、Pf20118和Pf20137。
8.如權利要求1所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變體能夠生產(chǎn)具有規(guī)定的古洛糖醛酸鹽殘基(G)-含量的藻酸鹽，其含量在0和30％之間。
9.如權利要求1所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變體能夠生產(chǎn)O-乙?；鶖?shù)目未減少或減少的藻酸鹽。
10.如權利要求5和9所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變體選自突變變體菌株Pf20118algIJΔ和Pf20118algFΔ。
11.如權利要求1、2、3、4或5所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變體能夠生產(chǎn)分子量在50,000和3,000,000道爾頓之間的藻酸鹽。
12.如權利要求11所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變體選自變體突變菌株Pf20118AlgLH203R。
13.如權利要求1、2、3、4或5所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，它包含一個由與天然存在的啟動子不同的誘導型啟動子調節(jié)的藻酸鹽生物合成操縱子，并任選含有一種或多種效應基因。
14.如權利要求13所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述誘導型啟動子是Pm啟動子，并進一步包含效應基因xylS。
15.如權利要求13和14所述的純的熒光假單胞菌突變菌株，其特征在于，所述突變菌株是Pf201MC。
16.生產(chǎn)如權利要求1所述的新的熒光假單胞菌突變菌株的方法，其特征在于(a)將熒光假單胞菌野生菌株與一種誘變劑接觸，和(b)使步驟(a)中處理的細菌在一種或多種抗生素存在下生長，和(c)通過選擇分離抗生素抗性的黏液型突變體；和(d)確定步驟(c)分離的黏液型突變體的藻酸鹽生產(chǎn)特性。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述誘變劑是亞硝基胍。
18.如權利要求16或17所述的方法，其特征在于，步驟(a)中處理的細菌在β-內酰胺或氨基糖苷抗生素存在下生長。
19.如權利要求16或17所述的方法，其特征在于，步驟(a)中處理的細菌在羧芐青霉素存在下生長。
20.生產(chǎn)權利要求13所述的熒光假單胞菌突變菌株的方法，其特征在于(i)通過同源重組，熒光假單胞菌野生菌株的藻酸鹽生物合成操縱子被一種誘導型啟動子更換，和(ii)通過同源重組、轉位子誘變或通過質粒的方式，將任選的效應基因引入到(i)的細菌中，和(iii)使突變體生長，然后通過選擇進行分離，和(iv)確定(iii)中分離的突變體的藻酸鹽生產(chǎn)特性。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述誘導型啟動子是來自惡臭假單胞菌Tol-質粒的Pm，或突變的Pm啟動子。
22.生產(chǎn)權利要求8所述的熒光假單胞菌突變菌株的方法，其特征在于(a)將編碼C-5差向異構酶的野生型algG基因克隆入一種質?；蛐⌒娃D位子，并通過化學誘變或通過PCR進行誘變，(b)構建一種熒光假單胞菌的藻酸鹽生產(chǎn)菌株的衍生物，其缺少algG基因(ΔalgG-菌株)，和(c)步驟(a)的誘變的algG的文庫被轉移到熒光假單胞菌的ΔalgG-菌株，并鑒定和測定所述包含質粒或轉位子的菌株的藻酸鹽生產(chǎn)和差向異構酶活性，和(d)通過步驟(c)的測定，鑒定出包含質?；蜣D位子的菌株，其包含編碼差向異構酶的突變algG，可提供古洛糖醛酸鹽殘基含量在0和30％之間的藻酸鹽，和(e)將突變的algG基因克隆入基因-置換載體，和(f)然后將步驟(e)的基因置換載體轉移到熒光假單胞菌的藻酸鹽生產(chǎn)菌株，以用突變的algG基因置換其algG基因，并使它能夠表達突變基因。
23.生產(chǎn)權利要求8所述的熒光假單胞菌突變菌株的方法，其特征在于，a)通過位點-特異的誘變，在基因水平上將一種或多種通過誘變和其后的篩選鑒定為對于差向異構作用重要的氨基酸和與突變型和野生型AlgG-蛋白中產(chǎn)生的氨基酸都不同的氨基酸交換，和b)將突變基因克隆入基因置換載體，并將該載體轉移入熒光假單胞菌的生產(chǎn)藻酸鹽的菌株中，其取代了野生型algG基因，并能夠被表達。
24.如上述權利要求1-15中任何一項所述的至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物的應用，它被用于生產(chǎn)藻酸鹽。
25.如上述權利要求1-15中任何一項所述的至少一種熒光假單胞菌突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物的應用，它被用于大規(guī)模生產(chǎn)藻酸鹽。
26.如上述權利要求1-15中任何一項所述的至少一種熒光假單胞菌突變菌株生產(chǎn)的藻酸鹽的應用，它被用于制備食品或藥物、化妝品、動物飼料、營養(yǎng)品等工業(yè)產(chǎn)品，或作為體外C-5-差向異構作用的中間產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明描述了熒光假單胞菌(Pseudomonasfluroscens)突變菌株的生物純的細菌培養(yǎng)物，其產(chǎn)生大量藻酸鹽。所述藻酸鹽可包含確定含量的甘露糖醛酸鹽和古洛糖醛酸鹽殘基，在藻酸鹽中可能存在確定水平的乙酰基，以及所需分子量的藻酸鹽。同時，也描述了調節(jié)藻酸鹽生產(chǎn)的高產(chǎn)量突變體。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)新的熒光假單胞菌突變菌株及其變體的方法，并將所得菌株應用于藻酸鹽的生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/90GK1685037SQ03822409
公開日2005年10月19日 申請日期2003年7月24日 優(yōu)先權日2002年7月26日
發(fā)明者M·基米斯特德, H·斯拉特, K·P·卡璐娜卡蘭, K·貝克維奇, H·俄特斯瓦奇, T·埃里森, G·斯卡夾克-布萊克, S·維拉 申請人:Fmc生物聚合物聯(lián)合股份有限公司