專利名稱：一種小麥黃矮病候選抗性基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥黃矮病候選抗性基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分離植物抗病基因?qū)τ诮沂局参锟共》肿訖C(jī)制，徹底防治植物病害具有重要意義。近年來(lái)，植物抗病基因的研究已成為植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前分離克隆功能產(chǎn)物序列未知的植物抗病(resistance，R)基因主要采用圖位克隆法和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，已成功分離了約30個(gè)植物抗病基因。圖位克隆法需要精細(xì)的遺傳圖譜及物理圖譜、建立多種文庫(kù)，工作量巨大。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法需要有效的轉(zhuǎn)座子體系和大量篩選工作。小麥不僅基因組龐大，相當(dāng)水稻基因組的近40倍，且重復(fù)序列含量豐富，缺乏有效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，因此小麥抗病基因克隆一直是國(guó)際的難題，至今尚未有成功分離小麥抗病基因的報(bào)道。
小麥黃矮病是小麥重要的病毒病害。至今小麥屬內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有效的抗黃矮病基因。小麥近緣植物中間偃麥草，至少包含2個(gè)抗黃矮病基因，分別位于第7和第2部分同源染色體上。本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室和澳大利亞合作，將中間偃麥草第7部分同源群染色體7X長(zhǎng)臂(7XL＝7AilL)上抗黃矮病基因Bdv2成功地導(dǎo)入小麥，育成抗黃矮病的小麥-中間偃麥草小片段易位系HW642、YW443、TC系等(Xin Z Y，Xu H J，Chen X，等，1991，Development of common wheat germplasm resistant to barley yellow dwarfvirus by biotechnology.Sciences in China(Series B)34(9)1055-1062；張?jiān)銎G，馬有志，辛志勇等，1998，應(yīng)用基因組原位雜交技術(shù)鑒定抗黃矮病小麥新種質(zhì)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).31(3)1-4；Banks P M，Larkin P J，Bariana H S等，1995.The useof cell culture for subchromosomal introgressions of barley yellow dwarf virusresistance from Thinopyrum intermedium to wheat.Genome 38395-405)，為克隆小麥黃矮病抗性基因提供了良好的基礎(chǔ)材料。但是中間偃麥草與小麥染色體重組交換率很低，采用通常的方法克隆其抗病基因顯然十分困難。
已克隆植物R基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有一定保守性，如具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)、富亮氨酸重復(fù)(LRR)或絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)等保守區(qū)域，該特點(diǎn)為利用同源序列法分離其它植物抗病基因提供了依據(jù)和一條快捷的新途徑(Leister D，Ballvora A，Salamini F，Gebhardt C，1996，A PCR-base approachfor isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wideapllication in plants.Narure genet.14421-429；王石平，劉克德，王江等.1998，用同源序列的染色體定位尋找水稻抗病基因DNA片段.植物學(xué)報(bào)，40(1)43-51)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已利用同源序列法從多種植物中分離克隆了抗病基因類似物(resistancegene analog，RGA)(Collin N，Webb C，Seah S，Ellis J，Hulbert S and Pryor AJ.1998.The isolation and mapping of disease resistance gene analogs in maize.Mol.Plant-Microbe Interact.11968-978；鄭先武，翟文學(xué)，李曉兵等.2001，水稻NBS-LRR類R基因同源序列.中國(guó)科學(xué)(C輯)，31(1)43-51；Collins N，Park R，Spielmeyer W，Ellis J and Pryor A J.2001.Resistance gene analogs in barleyand their relat ionship to rust resi stance genes.Genome.44375-381)。但迄今未見(jiàn)有關(guān)中間偃麥草RGA的報(bào)道。
與抗病基因緊密連鎖的RGA片段是從基因組文庫(kù)中分離抗病基因侯選克隆的重要探針。傳統(tǒng)篩選文庫(kù)的方法是菌落原位雜交法。由于小麥-中間偃麥草小片段易位系相當(dāng)普通小麥的基因組，基因組龐大(1.6×1010bp)，采用通常方法構(gòu)建、保存和篩選其基因組文庫(kù)的工作量和資金非常巨大。為解決該問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了抗黃矮病小麥-中間偃麥草易位系HW642的基因組TAC文庫(kù)(王曉萍，張?jiān)銎G，張群宇，劉耀光，辛志勇.2002，抗黃矮病小麥-中間偃麥草易位系基因組可轉(zhuǎn)化人工染色體文庫(kù)的構(gòu)建及初步篩選.29712-718)，以混合池法保存于24塊96孔板，每一個(gè)孔即克隆池保存了1000個(gè)不同重組克隆。Liu等建立了克隆池PCR(Pooled-PCR)篩選TAC文庫(kù)的方法，并從“中國(guó)春”小麥TAC文庫(kù)中篩選到I型硫素基因(Liu Y G，NagakiK，F(xiàn)ujita M et al.2000.Development of an efficient maintenance and screeningsystem for large insert genomic DNA libraries of hexaploid wheat in atransformation-competent artificial chromosome(TAC)vector.Plant Journal，2000，23(5)687-695)?？寺〕豍CR法篩選基因組文庫(kù)較傳統(tǒng)的菌落原位雜交法有以下優(yōu)點(diǎn)①由于構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)，以大腸桿菌作為受體，因此與大腸桿菌基因組DNA有部分同源性的DNA序列，在菌落原位雜交時(shí)，背景往往很深，易于掩蓋陽(yáng)性克隆的信息，通過(guò)克隆池PCR法篩選則可解決該問(wèn)題。②每個(gè)混合克隆池有1000個(gè)不同的克隆，其中一個(gè)特定克隆只占每個(gè)克隆池的1/1000。用菌落原位雜交篩選時(shí)雜交信號(hào)過(guò)弱會(huì)影響篩選結(jié)果。由于PCR擴(kuò)增的靈敏度高，克隆池PCR法能夠檢測(cè)到混合克隆池中每個(gè)克隆。③PCR法速度快，效率高，易操作。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種小麥黃矮病候選抗性基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所提供的小麥黃矮病候選抗性基因，是下列核苷酸序列之一
1)序列表中的SEQ ID №1；2)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1，由6448個(gè)堿基組成，它包括自5’端第4345位到5220位堿基，和自5′端第5180位到6022位堿基兩個(gè)讀碼框。
本發(fā)明所提供的小麥黃矮病候選抗性基因編碼的蛋白質(zhì)，是序列表中SEQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2和/或SEQ ID №3相同活性的由SEQ ID №2和/或SEQ ID №3衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID №2是由291個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，序列表中SEQ ID №3是由290個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，它們包含信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)等序列。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
可以將本發(fā)明的小麥黃矮病候選抗性基因基因?qū)胄←湹戎参镏?，以期獲得抗黃矮病轉(zhuǎn)基因小麥。本發(fā)明的小麥黃矮病候選抗性基因?qū)τ谘芯啃←湆?duì)黃矮病抗性機(jī)制，開(kāi)辟抗病新途徑，快速培育優(yōu)良的抗病作物品種，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。


圖1為RGA引物擴(kuò)增基因組DNA的電泳2為TirgaZ1/EcoRI組合的RFLP分折圖譜圖3為引物TZ1(U+L)擴(kuò)增抗病與感病基因組DNA的電泳4為第二輪篩選TAC文庫(kù)的部分結(jié)果圖5為TZ1(U+L)擴(kuò)增陽(yáng)性克隆和對(duì)照電泳6為以TirgaZ1做探針與陽(yáng)性克隆Southern雜交圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、中間偃麥草RGA的克隆與序列分析材料攜有抗黃矮病基因Bdv2的小麥-中間偃麥草易位系HW642、YW443、YW243、YW1029及二體附加系L1、雙端體附加系7Ai-1L、中間偃麥草；感病材料感病系150S(HW642姊妹系)、小麥親本中8601(ZH8601)、中7902(ZH7902)、中國(guó)春(CS)，Vilmorin27(Vi)；小麥-中間偃麥草易位系HW642基因組TAC文庫(kù)；均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，農(nóng)業(yè)部作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育、收集、構(gòu)建、保存。
1)RGA引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增分別根據(jù)已克隆R基因的NBS、LRR和STK(絲氨酸/蘇氨酸)激酶等保守結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，其序列見(jiàn)表1。
以中間偃麥草基因組DNA、抗病易位系HW642及顯微分離的7XL擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，分別利用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25ul，反應(yīng)液組成10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol/L，模板DNA 50mg/L，正反引物各0.4-0.5μmol/L，Taq聚合酶1U，加水至25μl，覆以石醋油1滴，在PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmer Cetus，DNA Thermalcycle480)上進(jìn)行。程序如下94℃預(yù)變性5min，進(jìn)入94℃ 45s，50℃ 1.5min，72℃ 1.5min共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
2)PCR產(chǎn)物的克隆與分析PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液進(jìn)行分離。用玻璃奶試劑盒回收PCR擴(kuò)增片段，回收產(chǎn)物用pGEM-Teasy vector system(Promega)試劑盒連接，電激轉(zhuǎn)化E.coli JM109菌株感受態(tài)細(xì)胞(電激儀為Bio-Rad公司的E.coli Pulser)，涂于含IPTG、X-gal和氨芐青霉素(75mg/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)白色菌落，液體LB培養(yǎng)后用堿法提取質(zhì)粒DNA。用最接近克隆位點(diǎn)的EcoRI酶切撿測(cè)插入片段的有無(wú)與大小，再用Sau3AI酶切對(duì)重組克隆進(jìn)行指紋分析、分類，每類抽取1-2個(gè)克隆采用T7或SP6引物測(cè)定插入片段的序列，用Blast軟件在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列搜索。
結(jié)果如圖1所示，除NF+NR引物對(duì)外，其余9對(duì)引物對(duì)分別在中間偃麥草基因組DNA中擴(kuò)增到1-3條理想帶；圖1中，模板1、6、11、15、20、25、30為7XL；2、7、16、21、26、31為HW642；4-6、8-10、12-14、17-19、22-24、27-29、32-34為中間偃麥草；引物1-3為K2A/EGF引物對(duì)；4為EGF；5為K2A；6-7為NLRRF/NLRRR引物對(duì)；9為NLRRR；10為NLRRF；11-12為RFKF/RLKR引物對(duì)；13為RLKR；14為RLF；15-17為S1/AS1引物對(duì)；18為AS1；19為S1；20-22為ST2F/ST2R引物對(duì)，23為ST2R；24為ST2F；25-27為CF9F/CF9R；28為CF9R；29為CF9F；30-32為K1A/HD引物對(duì)；33為HD；34為KiA；M為λ/EcoRI+HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn)?；厥罩虚g偃麥草和7XL的預(yù)想擴(kuò)增片段，進(jìn)行克隆。限制酶(EcoRI，Sau3AI)酶切圖譜分析白色克隆，部分克隆進(jìn)行測(cè)序和序列分析。結(jié)果表明，獲得9個(gè)具有開(kāi)放閱讀框的中間偃麥草RGA，分別屬于NBS，STK，LRR類，這些RGA特點(diǎn)見(jiàn)表2。
實(shí)施例2、與抗黃矮病基因Bdv2連鎖的RGA的鑒定與轉(zhuǎn)化1)RFLP分析RFLP分析程序參見(jiàn)張?jiān)銎G等(Zhang Z Y，Xin Z Y，Ma Y Z，Chen X，Xu Q F，LinZ S.1999.Mapping of a BYDV resistance gene from Thinopyrum intermedium inwheat background by molecular markers.Science in China(Series C)42(6)663-668)。以序列分析后確定的RGA片段為探針，采用EcoRI、EcoRV、BamHI、HindIII、DraI、PstI、XhoI、XbaI、BglII等限制性內(nèi)切酶完全消化中間偃麥草、HW642、150S和小麥親本中8601各15μg，構(gòu)成不同的RGA片段/酶切組合，進(jìn)行RFLP分折，結(jié)果表表1 RGA引物的序列引物序列(5′-3′) 基因結(jié)構(gòu)域Kinla GGIGGIGTIGGIAAIACIAC N，Rps2 P-loopHD A(A/G)AGCIA(G/A)IGGIA(G/A)ICC N，Rps2 GLPLA/TLS1 GGTGGGGTTGGGAAGACAACG N，Rps2 P-loopAS1 C(A/C)ACGCTAGTGGCAATCCN，Rps2 GLPLANLRR RevTATAAAAAGTGCCGGACTN LRRNLRR ForTAGGGCCTCTTGCATCGTN YGLLHRRLKFGA(T/C)GTNAA(A/G)CCIGA(A/G)AA Lr10k VI區(qū)RLKRTC(T/C)GG(T/C)GC(A/G)AT(A/G)TANCCNGGITGICCLr10k VIII區(qū)STK2F GNTTYGGNAGYGTNTAYAARGGLr10k 起始區(qū)VYKGSTK2R TCYGGYGCRATRTANCCCATIGTICCLr10k VIII區(qū)Cf9FCGAGACGACAGGACAAGTGA Cf9 315-334Cf9RCAACCGTAACCCACGAGAAC Cf9 2516-2497PtoFGTTTACAAGGGTGTTTTGCG Pto 163-182PtoRTATTATGCGACTCCACTGCC Pto 784-765Xa21F ATAGCAACTGATTGCTTGG Xa213225-3243Xa21R CGATCGGTATAACAGCAAAAC Xa21Downstream of3`end of Xa21KIN2A TGATACTGGATGATGTCTGG Cre3Kinase2EGF GTGCTTCTTATGAACCCTTC Cre3EGF明大多數(shù)RGA片段/酶切組合沒(méi)有多態(tài)性，只有1個(gè)RGA片段TirgaZ1與EcoRI酶切組合，能夠檢測(cè)出抗病雜交帶；進(jìn)一步擴(kuò)大抗病與感病樣品，結(jié)果如圖2所示，表明TirgaZ1/EcoRI組合能夠在含有Bdv2的抗病材料(中間偃麥草，L1、抗病易位系HW642、YW443、YW243、YW1029及F2抗病單株)中檢測(cè)到約4.0kb的特異雜交帶，而沒(méi)有Bdv2的感病系150S，感病小麥親本中7902、Vi、CS及F2感病單株沒(méi)有上述特異雜交帶；圖2中，1-2表示中間偃麥草，3表示7Ai1L，4-7表示抗病易位系，8-9表示感病系和小麥親本。說(shuō)明TirgaZ1是Bdv2連鎖的RGA基因片段，可作為篩選文庫(kù)的探針。分析TirgaZ1序列，其具有NBS結(jié)構(gòu)的保守域p-loop(kinasel)、kinase2、kinase3及domainl(GLPLA)。該序列含有537堿基，如序列表中序列6，其讀碼框?yàn)樽?’端第1到537位堿基。編碼序列表中序列7的多肽序列。
表2中間偃麥草R基因同源序列的特點(diǎn)片段的名稱片段大小 類別 引物對(duì)與已克隆基因編碼蛋白的同源性比較bp 基因名稱 identities(％) positive(％)TirgaZ1 537NBSS1/AS1 RPP13/RPM1/Mi/Rx 39/36/38/34 58/58/57/55TirgaZ2 536NBSS1/AS1 Putative protein of Arabisdopsis 25 45TirgaZ3 670NBSS1/AS1 RPP13/Mi/I2C-132/31/2953/50/48TirgaZ4 541NBSK1A/HD RPP13/I2C-2/Prf/Rx30/28/27/26 52/49/48/46TirgaZ5 532NBSK2a/EGFCre3//Rp1-dp2/I2C-2 84/38/3389/55/49TirgaZ6 544NBSK2a/EGFCre3/Rp1-dp3/I2C-256/36/2669/55/45TirgaZ7 485STKST2F/ST2R STK protein of Arabisdopsis 69 83TirgaZ8 488STKST2F/ST2R STK protein of Arabisdopsis 64 80TirgaZ9 428-LRR NLRRF/RXa1/Cf9 21/17 42/362)特異PCR標(biāo)記的建立為了用PCR法高效地篩選文庫(kù)，根據(jù)TirgaZ1序列及其與大腸桿菌基因組序列比較的結(jié)果，分別從5‘端88-112堿基、447-470堿基設(shè)計(jì)了1對(duì)特異PCR引物，見(jiàn)序列表中的序列4和5TZ1UGTA TGA TGG TAA AGC TTT GCT GCT ATZ1LAGG CAA CTT CTT GGG TCA CTG TAT優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件后，以具有Bdv2抗病材料和沒(méi)有Bdv2的感病材料的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3所示，表明TZ1U、TZ1L能夠在具有Bdv2的抗黃矮病材料中擴(kuò)增出約460bp的單一產(chǎn)物，而感病材料中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明特異的TirgaZ1/EcoRI標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)換為經(jīng)典的特異PCR標(biāo)記(SC-TZ1)，可用于PCR法篩選文庫(kù)。圖3中，CS、Vi、ZH7902、ZH8601、150S為感病材料，7Ai-36、Y243、Y443、ZY2000、ZY172、L1、TAF46、Z1146為抗黃矮病材料，M為λDNA/EcoRI+HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3、抗病易位系基因組TAC文庫(kù)的篩選1)克隆池PCR法進(jìn)行TAC文庫(kù)篩選用堿裂解法提取抗病易位系HW642的基因組TAC文庫(kù)的所有混合質(zhì)粒。通過(guò)克隆池PCR法進(jìn)行篩選第1輪篩選以1000個(gè)混合克隆的質(zhì)粒作為一個(gè)擴(kuò)增模板進(jìn)行；第2輪篩選將初級(jí)陽(yáng)性克隆池稀釋鋪單板、收集50-60個(gè)克隆構(gòu)成次級(jí)克隆池做為1個(gè)擴(kuò)增模板，第三輪篩選是將次級(jí)陽(yáng)性克隆池再次稀釋分離單菌落作為擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μl，其組成為10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，dATP，dTTP，dGTP，dCTP 0.2mmol/L，Taq聚合酶1U，10-20ng質(zhì)粒，1對(duì)特異PCR引物各為0.5μmol/L，補(bǔ)水至25μl，反應(yīng)在PCR儀9600或PTC-100上進(jìn)行，擴(kuò)增程序95℃變性3min，進(jìn)入以下程序35個(gè)循環(huán)(94℃ 45s，64℃ 1min，72℃ 1.5min)；然后72℃延伸補(bǔ)平10min。
利用特異引物對(duì)TZ1(U+L)和Pool-PCR法篩選抗病易位系HW642的基因組TAC文庫(kù)。通過(guò)第一輪篩選，分離到3個(gè)初級(jí)陽(yáng)性克隆，每個(gè)初級(jí)克隆池稀釋涂布，50-60個(gè)菌構(gòu)成1個(gè)次級(jí)克隆池，再次pooled-PCR篩選，結(jié)果獲得13個(gè)次級(jí)陽(yáng)性克隆池(如圖4，圖中，箭頭示陽(yáng)性擴(kuò)增帶)，將次級(jí)陽(yáng)性克隆池稀釋鋪成單菌落，對(duì)每個(gè)次級(jí)陽(yáng)性克隆池挑取96-192個(gè)單菌落分別做模板進(jìn)行PCR篩選，獲得4個(gè)陽(yáng)性單克隆T1，T2，T3，T4。同時(shí)用引物對(duì)TZ1(U+L)擴(kuò)增這4個(gè)單克隆和抗病對(duì)照(中間偃麥草Ti、抗病易位系HW642R)、感病對(duì)照(感病系HW641SS、小麥親本8601)基因組DNA，結(jié)果如圖5所示，表明4個(gè)陽(yáng)性單克隆與抗病對(duì)照擴(kuò)增帶一致；圖5中，箭頭示陽(yáng)性擴(kuò)增帶。4個(gè)陽(yáng)性單克隆為侯選克隆。
2)陽(yáng)性單克隆的鑒定用EcoRI、EcoRV、NotI、PstI、ScaI、XhoI、HindIII、XbaI、BamHI等9種限制性內(nèi)切酶消化可能陽(yáng)性的TAC單克隆質(zhì)粒，結(jié)果表明4個(gè)陽(yáng)性克隆分為2類，T1，T2，T3為1類，T4為另1類，插入片段分別為23、25kb左右。將陽(yáng)性克隆T1和T4的酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用Takara生物工程公司BcaBEST DNA聚合酶標(biāo)記的TirgaZ1片段作探針進(jìn)行Southern雜交，Kodak K磷屏上曝光適時(shí)，用MolecularImage(Bio-Rad公司)系統(tǒng)掃描、記錄結(jié)果。結(jié)果如圖6所示，表明各種酶切產(chǎn)物均有明顯的不同雜交帶，并且同一酶切產(chǎn)物雜交帶中包含1-2條相同帶和1-3相異帶。說(shuō)明這2個(gè)克隆為含有NBS類R基因片段TirgaZ1的候選抗病基因克隆。
分別以抗黃矮病中間偃麥草、抗黃矮病易位系HW642和小麥親本中8601的基因組DNA約30ng作探針，對(duì)陽(yáng)性克隆T1和T4的酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交分析。由雜交圖譜可知，陽(yáng)性克隆T1、T4的XhoI，EcoRV，EcoRI，PstI酶切產(chǎn)物，能與中間偃麥草、HW642的基因組DNA雜交出與小麥雜交不存在的特異雜交帶，即陽(yáng)性克隆T1和T4插入片段中有中間偃麥草特異片段，說(shuō)明陽(yáng)性克隆T1和T4是來(lái)源抗黃矮病易位系的中間偃麥草易位染色體片段7XL，抗黃矮病侯選基因克隆。
對(duì)陽(yáng)性克隆T1的部分插入片段進(jìn)行序列測(cè)定和序列比較，結(jié)果表明，測(cè)定的6448bp插入片段中，其包含信號(hào)肽編碼序列、完整的ORF(NB-ARC)、跨膜結(jié)構(gòu)編碼序列，其中NB-ARC中包含與TirgaZ1完全同源的序列，可作為抗黃矮病侯選基因克隆。此侯選基因克隆具有序列表中序列1的核苷酸序列，編碼序列表中SEQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸序列。SEQ ID №2是由280個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其編碼框?yàn)樽?’端第4345位到5220位堿基；序列表中SEQ ID №3是由280個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其編碼框?yàn)樽?’端第5180位到6022位堿基。此侯選基因編碼產(chǎn)物具有信號(hào)肽、低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)、NB-ARC、跨膜域等結(jié)構(gòu)。
序列表<160>7<210>1<211>6448<212>DNA<213>小麥-中間偃麥草易位系(Triticum aestivum-Thinopyrum intermediumtranslocation line)<400>1aagctttagt tgtacgccca atcctccgtc gccaaccgtc cgtgtcgcaa gctggcatac60aagttcttcg gccccttcac ggtgacggag cgcatcggca ctttggcata tcgcctgaac120ctgccgcccg acagccgcat ccaccccgtc ttccacgtct cgcaactcaa gccgttcgtc180cccgactaca ctccggtctt cgccgagctg ccaaagatac cggacctcac ggccgtggaa240cgtgttccgg tcgccattct ggatcgccgc atgatgaaga aaggagacgc cccagtcgtc300caagtgcagg tgcagtggag caccatgcag ccgtcaacaa caacctggga agactactat360gtgctatggc agcgctaccc ggacgcgccc tttgggcaga ggaagatcca gctgctcgag420agggggcaaa tgtcacgcct gcagaccagc ctgcagcgga ctgatcagtg caagtgcgga480tcgtcacttg caacgactaa gtcatcgtcg agctgggggc tgggacccac cgccaagtgt540atgcgtgtgt gctaagccaa gtgttggcgt gtgtgttaag ccaactgtgg cctacttgta600acggaatgac tggaggggga ggagatggaa aaagtaatga actactttcc cctcgccttc660gtctctctcg ctctcaccta acccagctcc ctcttcctcg tcccgattcc cctttctcat720ctcaaccctc tcgatcgtgt cgtgacacgg cggcggcggc ggatcaatcg attgaaaccg780tagcgagcag cgggtgcgtt ggtgtcacgc ggaggaccac ttactggccg agcgtgcagc840tgggcccgat cagcggggta aggccatgaa ggccaaaaca ctggagctag ctcaagcttt900gggctacgag gatgttgtgc ttctgctgag gggcccttgc gtggataaag gctagaagct960gctaaacacg tggagaaggt gcaaggagca tgagatttgt ttgaaaagaa atagtttccc1020aaataagagc cacatggtac gggttggctt tctggtgcaa agaactagca aacccagaat1080atctgatgca tggcgtgagc attgtgtggc ctgttttttg aatcaactat tagttctgct1140aggtacatgg aaaatgctac gtaggtctag gtaattgggg ttgaagagtt ctttacaaga1200agtgtgtacc tagggcttct gaggcaggaa gacaacgtgc gtataaggct cggaggagtc1260
tggagtgcgt tgtggtagga tcatgcatac acagggcgtc aagcaatgca cggagatgta1320cggggcggac aaaatgcagg gtggagcatg gttacagtca gacaaggtcg gctgggtcgg1380actgcactat ctgcggatcg acggggatgt cggtcgaagg agaagacgac ggtgatttca1440gcgacgacga cataggagcg tgatgccgat ggtggccgac ttctggggcg tggaaacatg1500tagagcaggc ctgagggctt gtgcggcttt gacatactat ggcgcatggt tgattcaaga1560tggtgcacac atgagagagc ttgtagttga caaggcgcag ggtagcatag cgcagctaca1620tggagtcatg ttgaaggtgg agctggagtc tgatggatga ctacactctg tgctgatgga1680ggggctacga cgtaaatgca tggagagtcg aagcctattt cagcgggata gcgagagaca1740tgtggattgg actggggccc agtggtctga tggaggcgtg atactcagca tcggtcggtg1800atgatcggtg gttctctgta gtagggattt gagtggtgtg ggtctgtggc cctagagact1860tgacaaggac agcagagggt cgacgcggtg atagcgacga ggcgtgcggt aagcacggga1920cacagagaca gaccaaggca ctaatgatga gatatgtggt cagacaaagt gtgcaggggt1980gctgaagcag tgttgatgag taccaaattc aagttggtga ctgggtatat cggtgctagt2040tgatggacag gagttgacca tggagaatct gcgaaagtgg cggaatgtct taatgtcaaa2100agctgagaga gtacatggtc gtatattttg tggtgttcag tgcacatggc aaagtgcgga2160tgacaagtac agaagggggc ggagtgctat aggtatggga catgtcagag actatccggg2220gaaaaaggat gagagaactg cgaatttgac tgagagcgac acaggacgac ggtgaaattc2280cttcaaattt caggcaagca gtcaagaagg agtggtgacg ttgagttcag gtaactctta2340tatgtggcgt ccaatatgtg agttgtttat tttcacgcag acagtggtcg gtgtgtgatg2400gcgtttgaac ggattctccg gaagattggg agcacaaaat agagtaacga ggaacttaat2460tttgctcgag tgttgactgt gaagaagacg agaagggact acagttgcag gtggagtcac2520atggagtatg ggagtagcag cggtggtcat gacgtatctc aagcccaatg tacatggaga2580ttcgatgcat agatgaattc aagatggtga agaatattcg tcaaggtgga gtttgttaga2640gttgtgtcga atattattgt acaaggtagg ttatagttgg acttggtttt tggactgtgt2700gtagacaggg taggagttgt gtcctaatag gacacttgta tcctaggcct cttatatata2760tcgggggtag acaaacgatg taacctaggt atgccaacat aatagcacac gcaggcgggg2820gagccgacgg catgtgccgg cgcccgggcg gccggtgtgc ggtattgtac cggtgtcgtg2880gggaggagcg cccgtactca ggccccggga tgtagacatg atggtgaatc tcgttaacaa2940atctcggtgt catgcctcgt gtgattgctt gattttcggt agatcaacgg tggcctcgga3000ttaactctaa caggttgcat caagtgaggt ttctttcggt cgttccttga aacgttccag3060caaaacaaca cctagaaagc acaagcgtaa gcatactgtt cagaaaagag attactgcac3120catgcatgtc ccggaagata atgagcaaat taaaggccag tattcagaag gagcaactgc3180
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1 5 10 15Ala Val Gln Glu Thr Thr Phe Leu Cys Gly Val Asn Leu Glu Val Gly20 25 30Phe Leu Lys Asp Glu Leu Lys Arg Leu Lys Ser Tyr Leu Lys Ser Ala35 40 45Asp Ala Lys Arg Arg Ser Gly Asp Glu Leu Val Ala Thr Trp Val Ser50 55 60Gln Ile Arg Asp Ala Ala Tyr Glu Ala Glu Asn Ala Ile Glu Ala Ala65 70 75 80Asp Tyr Met Glu Lys Arg Asn Arg Leu Lys Lys Gly Phe Met Gly Ala85 90 95Ile Ser Arg Tyr Ala Arg Leu Pro Ser Asp Leu Leu Thr Leu His Thr100 105 110Ile Gly Ala Glu Ile Gln Arg Val Lys Arg Lys Ile Ser Glu Ile Phe115 120 125Asp Ser Ala Asn Arg Leu Lys Ile Asn Phe Asp Thr Ser Asp Val Glu130 135 140Lys Val His Ile Glu Asp Glu Tyr Pro Gln Asp Tyr Gly Thr Met His145 150 155 160Gln Asn Phe Glu Asp Ile Asp Leu Val Gly Phe Gly Asp Glu Tyr Lys165 170 175Glu Ile Val Gly Lys Leu Val Asp Lys Glu Asn Ile Thr Leu Ser Val180 185 190Val Ser Ile Val Ala Met Gly Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg195 200 205Lys Val Tyr Thr Ser Ser Ser Val Lys Gln His Phe Glu Ala Ala Ser210 215 220Trp Val Thr Val Ser Gln Lys Phe Lys Gly Ile Asp Leu Leu Lys Asp225 230 235 240Ile Met Lys Gln Ile Met Gly Cys Arg Asp Glu Ser Ile Ala Lys Met245250 255Asn Lys Tyr Glu Val Gly Lys Glu Ile His Asp Phe Pro Leu Gln Lys
260 265 270Arg Tyr Leu Val Val Leu Asp Asp Val Trp Glu Asn Arg His Met Gly275 280 285Pro Asp Lys290<210>3<211>280<212>PRT<213>小麥-中間偃麥草易位系(Triticum aestivum-Thinopyrum intermediumtranslocation line)<400>3Met Met Cys Gly Lys Thr Asp Thr Trp Asp Gln Ile Asn Lys Arg Val1 5 10 15Lys Ala Phe Pro Asp Ala Thr Asn Gly Ser Arg Val Leu Leu Thr Thr20 25 30Arg Lys Glu Asp Val Ala Asn His Val Gln Met Pro Thr His Val His35 40 45His Leu Lys Lys Leu Asp Glu Glu Lys Ser Trp Glu Leu Phe Ser Ser50 55 60Lys Ala Leu Pro Pro Tyr Lys Arg Ser Ala Ile Cys Asp Val Asp Glu65 70 75 80Phe Glu Lys Leu Gly Lys Arg Leu Ala Lys Lys Cys Asp Gly Leu Pro85 90 95Leu Ala Leu Ala Val Leu Gly Gly Tyr Leu Ser Lys Asn Leu Asn Ala100 105 110Gln Thr Trp Ser Asn Ile Leu Ser Asp Trp Pro Ser Thr Lys Asn Gly115 120 125Gln Met Met Arg Asp Ile Leu Ala Arg Ser Tyr Lys Asp Leu Pro Asn130 135 140His Tyr Leu Arg Ala Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp
145 150155 160Tyr Val Met Tyr Val Pro Asn Leu Ile Gln Leu Trp Ile Ala Glu Ser165 170 175Phe Ile Pro His Thr Pro Lys His Ile Leu Glu Glu Thr Ala His Asn180 185 190Tyr Val Thr Glu Leu Ala Gln Arg Ser Leu Val Gln Val Val Gly Arg195 200 205Ser Thr Ala His Gly Trp Ile Glu Arg Ile Arg Ile His Asp Ile Leu210 215 220His Asp Trp Cys Ile Glu Glu Ala Arg His Asp Gly Phe Leu Asp Ala225 230 235 240Ile Asn Lys Thr Ala Gly Gln Ala Ser Ser Ala Gly Leu Phe Leu Leu245 250 255Val Asp Ser Ile Phe Tyr Phe Thr Ile Cys Pro Ile Tyr Leu Ala Ser260 265 270Phe Phe Leu Arg Cys Gly Ala Leu275 280<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gtatgatggtaaagctttgctgcta<210>5<211>
<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5aggcaacttcttgggtcactgtat<210>6<211>537<212>DNA<213>中間偃麥草(Thinopyrum intermedium)<400>6caacgctagt ggcaatccat cacatttctt tgcaagcttt ctcccaagtt tttcaaactc60gtccacatca cgtatggcag accttttgta tgatggtaaa gctttgctgc taaatagttc120ccaacttttc tcttcatcta acttcttcaa atgatgaaca tgggttggca tttggacatg180atttgcaaca tcttccttcc gggtggttaa tagtactcta ctaccattag ttgcatctgg240aaaagcttta acccttttat ttatctggtc ccatgtgtcg gtttcccaca catcatcaag300aactaccaag tatctttttt gcaatagaaa atcatggatc tcctttccca cctcatactc360attcatctta gcaattgact catctctgcc ccccattatt tgtttcataa tatcctttag420taaatcaatg cccttgaatt tttgagatac agtgacccaa gaagttgcct caaagtgttg480tttgacacta gatgaagtgt atacttttct agcgagcgtt gtcttcccaa ccccacc 537<210>7<211>179<212>PRT<213>中間偃麥草(Thinopyrum intermedium)<400>7Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Lys Val Tyr Thr Ser Ser1 5 10 15Ser Val Lys Gln His Phe Glu Ala Thr Ser Trp Val Thr Val Ser Gln20 25 30
Lys Phe Lys Gly Ile Asp Leu Leu Lys Asp Ile Met Lys Gln Ile Met35 40 45Gly Gly Arg Asp Glu Ser Ile Ala Lys Met Asn Glu Tyr Glu Val Gly50 55 60Lys Glu Ile His Asp Phe Leu Leu Gln Lys Arg Tyr Leu Val Val Leu65 70 75 80Asp Asp Val Trp Glu Thr Asp Thr Trp Asp Gln Ile Asn Lys Arg Val85 90 95Lys Ala Phe Pro Asp Ala Thr Asn Gly Ser Arg Val Leu Leu Thr Thr100 105 110Arg Lys Glu Asp Val Ala Asn His Val Gln Met Pro Thr His Val His115 120 125His Leu Lys Lys Leu Asp Glu Glu Lys Ser Trp Glu Leu Phe Ser Ser130 135 140Lys Ala Leu Pro Ser Tyr Lys Arg Ser Ala Ile Arg Asp Val Asp Glu145 150 155 160Phe Glu Lys Leu Gly Arg Lys Leu Ala Lys Lys Cys Asp Gly Leu Pro165 170 175Leu Ala Leu179
權(quán)利要求
1.一種小麥黃矮病候選抗性基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥黃矮病候選抗性基因，其特征在于所述基因?yàn)樾蛄斜碇械腟EQ ID №1。
3.小麥黃矮病候選抗性基因編碼的蛋白質(zhì)，它是序列表中SEQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2和/或SEQ ID №3相同活性的由SEQ ID №2和/或SEQ ID №3衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)為序列表中SEQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求1所述基因在植物黃矮病防治中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述基因在小麥黃矮病防治中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥黃矮病候選抗性基因及其編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的小麥黃矮病候選抗性基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。本發(fā)明所提供的小麥黃矮病候選抗性基因編碼的蛋白質(zhì)，它是序列表中SEQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2和/或SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2和/或SEQ ID №3相同活性的由SEQ ID №2和/或SEQ ID №3衍生的蛋白質(zhì)?？梢詫⒈景l(fā)明的小麥黃矮病候選抗性基因?qū)胄←湹戎参镏校蛊浍@得抗黃矮病特性。本發(fā)明的小麥黃矮病候選抗性基因在植物黃矮病防治中具有重要的作用。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1570102SQ0314980
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月25日
發(fā)明者張?jiān)銎G, 辛志勇, 許景升, 劉耀光, 王曉萍, 林志珊, 張群宇 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所