專利名稱：補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)l－乳酸的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳酸發(fā)酵領(lǐng)域，特別是涉及一種利用根霉菌種，通過(guò)利用葡萄糖或水解糖等發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
乳酸是一種十分有用的化合物，在食品、醫(yī)藥、釀造、皮革、塑料等行業(yè)具有廣泛的用途。特別是聚L-乳酸(PLA)是一種可完全生物降解的化工產(chǎn)品，在消除“白色污染”具有十分重大的意義。
乳酸分為D-型、DL-型和L型，其中L-乳酸具有完全的生物相容性和生物可降解性，而D-乳酸卻不被絕大多數(shù)的生物所吸收利用，過(guò)量攝入D-乳酸會(huì)對(duì)人體造成一定的危害。
現(xiàn)有的發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的工藝，一般是以稱之為乳酸菌類的細(xì)菌為生產(chǎn)菌種，如乳酸桿菌(Lactobacllillus)，乳球菌屬(Lactococcus)等在厭氧或微好氧的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中所用的培養(yǎng)基以玉米粉、米粉、淀粉、葡萄糖、水解糖、糖蜜等為主要碳源，并配合酵母提取物、蛋白胨、玉米漿等作為氮源及少量的無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵所得為DL-乳酸，若所需純度高的L-乳酸則要經(jīng)過(guò)分離消旋，從而使L-乳酸價(jià)格較高。
另一方面，利用根霉菌屬類的絲狀真菌，使用通氣攪拌反應(yīng)器、氣泡塔型反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等，在通氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸。發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)的選擇較廣，可以為葡萄糖、玉米粉、米粉、淀粉等為主要的原料，少量(NH4)2SO4、NH4NO3等作為氮源，少量其它無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行培養(yǎng)。例如Hang(Hang和Yong D，U.S.Pat.No.4963486A C12P7/56)利用玉米粉為碳源，由R.oryzae NRRL 395(ATCC 9363)和R.oryzae NRRL394的孢子一步發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，產(chǎn)酸量達(dá)到350g/Kg玉米粉(相當(dāng)于52.5g/L)，糖的轉(zhuǎn)化率大于44％。高年發(fā)(高年發(fā)，樊曉翔和楊楓，中國(guó)釀造，1997(2)19-25)利用經(jīng)α-淀粉酶對(duì)玉米粉液化并去渣，由米根霉(Rh.oryzae L-A6)進(jìn)行分批發(fā)酵，L-乳酸產(chǎn)量可達(dá)100g/L，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)75.4％。虞東勝，周曉燕(虞東勝，周曉燕等，工業(yè)微生物，Vol30，No3，2000，4-7)以誘變菌株Rs928在60噸的發(fā)酵罐上利用淀粉水解糖發(fā)酵L-乳酸，產(chǎn)酸量為140g/L，L-乳酸收率80.4％。以上工藝，前兩個(gè)屬一步發(fā)酵生產(chǎn)，盡管產(chǎn)生的乳酸產(chǎn)品純度較高，分離純化工藝簡(jiǎn)單，但L-乳酸產(chǎn)量和收率都較低，兩步法發(fā)酵相對(duì)而言發(fā)酵產(chǎn)酸量和乳酸收率都有所提高，但上述研究課題所用的研究菌株為具有高產(chǎn)酸和高轉(zhuǎn)化特性的誘變菌株，存在產(chǎn)酸率的穩(wěn)定性問(wèn)題。
由于在L-乳酸發(fā)酵過(guò)程中，根霉菌屬的菌絲體可以形成粒狀、塊狀或微球狀，通過(guò)簡(jiǎn)單的沉降作用即可與發(fā)酵培養(yǎng)液分離。利用菌絲體易沉降的特點(diǎn)，岡部滿康等(岡部滿康，JP9-173090A，C12P7/56)設(shè)計(jì)制造了一種“氣泡塔型反應(yīng)器”，利用R.oryzae NRRL 395發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，在發(fā)酵培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)，通過(guò)靜置，菌絲體與培養(yǎng)基分離并沉降于反應(yīng)器的錐形底部，分離上清液后反應(yīng)器中重新加入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。此課題研究通過(guò)上述方式實(shí)現(xiàn)L-乳酸生產(chǎn)的連續(xù)和半連續(xù)的分批發(fā)酵，在一定意義上提高發(fā)酵生產(chǎn)中乳酸的收率和終產(chǎn)物乳酸的濃度。單批發(fā)酵產(chǎn)酸量達(dá)82～86g/L，產(chǎn)酸收率為68％以上。友村友宏等(友村友宏，JP6-253871A，C12P7/56)在研究中使用與岡部滿康等相似的生物反應(yīng)器，利用R.oryzaeAHU6537發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)半連續(xù)分批培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)72g/L，乳酸收率70％左右。這兩項(xiàng)發(fā)明都利用了菌絲體易沉降的特性，形成半連續(xù)或連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，能有效的利用生物反應(yīng)器，但單批發(fā)酵L-乳酸產(chǎn)量低，乳酸收率較低，同時(shí)工藝的實(shí)施需要特定的生物反應(yīng)器作為技術(shù)基礎(chǔ)。
另外，在以發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸時(shí)，為解除L-乳酸對(duì)產(chǎn)物的抑制現(xiàn)象，必需使用中合劑中和L-乳酸。常用的中和劑是CaCO3，也有使用Ca(OH)2、NaOH、氨水等的研究。岡部滿康(岡部滿康，JP2000-37196A，C12P7/56，CN1254016A，C12P7/56)利用耐氨性L-乳酸產(chǎn)生菌Rhizopus sp.MK96-1156發(fā)酵生產(chǎn)，用連續(xù)流加氨水的方式中和L-乳酸，分批發(fā)酵產(chǎn)酸率可達(dá)81g/L，乳酸收率77.4％，以回收菌絲體實(shí)現(xiàn)連續(xù)分批發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量最高可達(dá)89g/L，乳酸收率最高為81.6％。此項(xiàng)發(fā)明此能有效提高發(fā)酵過(guò)程L-乳酸的收率，但需要特定的耐氨性生產(chǎn)菌株和特定的發(fā)酵設(shè)備作為工藝的基礎(chǔ)，此項(xiàng)發(fā)明難于規(guī)?；a(chǎn)。
綜上所述，現(xiàn)國(guó)內(nèi)外關(guān)于L-乳酸的生產(chǎn)研究技術(shù)主要集中在三個(gè)方面，一是研究根霉發(fā)酵過(guò)程中的代謝特性；二是通過(guò)定向育種獲得高產(chǎn)酸、高轉(zhuǎn)化率的特性菌株來(lái)提高發(fā)酵培養(yǎng)中的L-乳酸產(chǎn)量和收率；三是通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)設(shè)備的創(chuàng)新來(lái)實(shí)現(xiàn)半連續(xù)或連續(xù)化生產(chǎn)工藝，提高L-乳酸的收率。但對(duì)于用一般菌株和常規(guī)設(shè)備進(jìn)行L-乳酸生產(chǎn)，綜合解決在其生產(chǎn)過(guò)程中菌絲形態(tài)與產(chǎn)率關(guān)系，綜合能使其產(chǎn)酸量和收率提高都存在較大的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)上述現(xiàn)有的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的問(wèn)題，提供一種以一般根霉菌屬菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的生產(chǎn)工藝，解決發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中乳酸的產(chǎn)量和收率的問(wèn)題。
本發(fā)明提供的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸工藝，可解決生產(chǎn)過(guò)程中菌絲體形態(tài)與產(chǎn)酸的關(guān)系，并由于是以一般的穩(wěn)定生產(chǎn)菌株和在常規(guī)的發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行L-乳酸生產(chǎn)，可解決發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中乳酸的產(chǎn)量和收率的問(wèn)題，提高乳酸的產(chǎn)量和收率。
本發(fā)明提供的補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸工藝是一種以一般根霉菌屬菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸時(shí)種子的培養(yǎng)方法。
另外，本發(fā)明提供一種根霉菌屬菌在好氧條件下通過(guò)補(bǔ)料工藝生產(chǎn)L-乳酸的方法。
本發(fā)明具體的操作步驟如下A.對(duì)菌種進(jìn)行斜面菌種的制備和孢子的增生培養(yǎng)；采用此方法可大量的擴(kuò)增根霉孢子，而且在制備孢子時(shí)易于孢子的分散處理，孢子量達(dá)到106個(gè)/mL。
B.將步驟A獲得的孢子置入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)；本發(fā)明通過(guò)此種培養(yǎng)方法可獲得均勻的最適于發(fā)酵的菌絲體形態(tài)，利于發(fā)酵產(chǎn)酸。
C、將步驟B獲得的種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)加單糖料及中和劑，使發(fā)酵液殘?zhí)菨舛忍岣?～3％，中和劑添加總量達(dá)到5-7％。
本發(fā)明通過(guò)補(bǔ)料工藝提高L-乳酸的單批發(fā)酵產(chǎn)量及收率。
通過(guò)補(bǔ)料工藝，可有效提高發(fā)酵產(chǎn)量15％以上，和L-乳酸的收率9％以上，從而有效的利用生產(chǎn)原料，獲得高產(chǎn)。
本發(fā)明中，只要屬于根霉菌屬的，能夠產(chǎn)生L-乳酸的絲狀真菌就可以使用。屬于根霉菌屬的，具有L-乳酸發(fā)酵能力的菌有米根霉(Rhizopusoryzae)、無(wú)根根霉(Rhizopus arrhizus)、爪哇根霉(Rhizopus javanic)、變黑色根霉(Rhizopus nigricans)、德列馬根霉(Rhizopus delemar)等，其中以米根霉(Rhizopus oryzae)和無(wú)根根霉(Rhizopus arrhizus)產(chǎn)L-乳酸能力較高。以東京根霉(Rhizopus torinensis NO 3.851)根霉菌屬菌為絲狀真菌，能產(chǎn)生孢子，在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)呈現(xiàn)顆粒狀、塊狀、絲狀和小球狀。以上涉及到的菌種均可通過(guò)中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心購(gòu)置。
本發(fā)明中，對(duì)菌種的斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基無(wú)特殊的要求，只要能使菌種良好的生長(zhǎng)，并產(chǎn)生孢子即可，如馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，以鉑絲或竹簽接種于斜面培養(yǎng)基上，在25～35℃內(nèi)培養(yǎng)，直至產(chǎn)生大量孢子。
本發(fā)明中，對(duì)菌種的孢子增生采用固曲培養(yǎng)法。固曲原料可以是麩皮、面包渣等易于真菌生長(zhǎng)并產(chǎn)生孢子的原料。在本發(fā)明中優(yōu)選麩皮為原料。因?yàn)椋熎に缮?，吸水性較好，在培養(yǎng)過(guò)程中可以為菌絲體的生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，并且菌絲生長(zhǎng)較短，加無(wú)菌水、滅菌的生理鹽水或滅菌的培養(yǎng)基制備孢子懸浮液時(shí)孢子能很好的分散，在孢子量需求較大時(shí)可將整個(gè)麩皮培養(yǎng)基分散后加入種子培養(yǎng)基中。
本發(fā)明中，對(duì)孢子采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后再加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基由碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽組成。碳源通常可以是葡萄糖、玉米粉、玉米淀粉、淀粉、米粉、糖蜜、乳糖等，即可單獨(dú)使用，也可混合使用。在本發(fā)明中優(yōu)選玉米粉水解物作碳源、和硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉，碳酸鈣組成種子培養(yǎng)基。因?yàn)?，玉米粉的?淀粉酶水解物不但可以為孢子的生長(zhǎng)提供良好的營(yíng)養(yǎng)，而且培養(yǎng)的種子形成均一細(xì)小的菌絲球，不易結(jié)團(tuán)或成塊，有利于發(fā)酵產(chǎn)酸，從而解決菌絲體形態(tài)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量和原料利用率的影響作用。同時(shí)，接種以玉米粉水解物為培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)液也有利于發(fā)酵反應(yīng)器內(nèi)菌種的進(jìn)一步生長(zhǎng)。
另外、利用本發(fā)明的種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)屬好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度以所使用的菌種的最適生長(zhǎng)溫度為宜。培養(yǎng)方式可以是振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)等，在本發(fā)明中優(yōu)選振蕩培養(yǎng)和攪拌培養(yǎng)并選擇通氣攪拌型反應(yīng)器。因?yàn)閿嚢栊头磻?yīng)器更利于細(xì)小菌絲球的形成、物料和氧均一分布。
本發(fā)明中，根霉菌屬菌的發(fā)酵培養(yǎng)使用液體培養(yǎng)，分批發(fā)酵。液體培養(yǎng)方式選用振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)中的任何一種。在本發(fā)明中優(yōu)選振蕩培養(yǎng)、深部通氣攪拌培養(yǎng)。選用攪拌型反應(yīng)器是因?yàn)槭褂么朔N生物反應(yīng)器的機(jī)械攪動(dòng)方式雖會(huì)影響菌的生長(zhǎng)速度和有菌絲的纏繞現(xiàn)象，但在這種攪拌方式下菌絲體的增生會(huì)受到一定的限制，從而使更多的原料用以合成L-乳酸。對(duì)于反應(yīng)器對(duì)菌絲體生長(zhǎng)速度的影響作用可以加大接種量的方法解決。深部通氣培養(yǎng)中通入的氣體可以是空氣或氧氣，通氣量的大小以分批發(fā)酵最適通氣量為好。
另外，本發(fā)明對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇與種子培養(yǎng)基相同，在本發(fā)明中優(yōu)選葡萄糖、水解糖等以單糖為主的生產(chǎn)原料，在發(fā)酵培養(yǎng)中，當(dāng)發(fā)酵液酸積累量達(dá)到85～95g/L，殘?zhí)橇康陀?％時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，向生物反應(yīng)器內(nèi)單獨(dú)添加單糖，使發(fā)酵液中殘?zhí)橇刻岣?～4％。促進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)的進(jìn)行，使分批發(fā)酵產(chǎn)酸量提高，并提高糖向L-乳酸的轉(zhuǎn)化率。
根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的培養(yǎng)過(guò)程分為兩個(gè)階段，第一階段以菌絲體的生長(zhǎng)為主，第二階段以菌體代謝產(chǎn)酸為主。發(fā)酵培養(yǎng)的中后期，菌體將糖和雜酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸的代謝能力最高，此時(shí)補(bǔ)加葡萄糖不但可以為菌絲體代謝提供能量促進(jìn)L-乳酸的生成，而且此時(shí)菌絲體可以將糖高效轉(zhuǎn)化，首先轉(zhuǎn)化為中間酸，然后再轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸，從而提高糖的利用率和分批發(fā)酵的產(chǎn)酸量。此項(xiàng)是利用菌本身的代謝特性，也就是本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)和理論依據(jù)，本發(fā)明在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的這一特性階段，即中間酸的大量合成階段，在此階段中菌體可有效的將糖轉(zhuǎn)化為中間酸，從而在以后的培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸；另外，在發(fā)酵后期提高發(fā)酵液中的葡萄糖量能促進(jìn)行菌絲體的進(jìn)一步代謝，促使L-乳酸生成。這也是本工藝路線為什么能提高發(fā)酵產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化率的原因。
本發(fā)明補(bǔ)料的方式是間歇式的補(bǔ)加，補(bǔ)加糖是一次性的加入。
另外，培養(yǎng)基的pH控制可以用添加碳酸鈣、或通過(guò)pH傳感器和pH控制器添加氫氧化鈉、氫氧化鈣、氨水、碳酸鈉等物質(zhì)自動(dòng)維持pH穩(wěn)定于所培養(yǎng)菌種的最適發(fā)酵產(chǎn)酸范圍內(nèi)。補(bǔ)料的方式是間歇式的補(bǔ)加，補(bǔ)加糖是一次性的加入。
本發(fā)明采用分批發(fā)酵，在分批發(fā)酵中，優(yōu)選中性碳酸鹽類為pH中和劑，分三次加入，第一次在發(fā)酵培養(yǎng)初始時(shí)加入1-3％的中性碳酸鹽類，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.5～6.0，第二次在第一次加入的中性碳酸鹽類用盡后補(bǔ)加，最后一次則與補(bǔ)料時(shí)一同加入。
有益效果通過(guò)本發(fā)明的工藝設(shè)計(jì)，在使用常規(guī)生產(chǎn)菌株和發(fā)酵設(shè)備的情況下可有效的提高分批發(fā)酵培養(yǎng)的L-乳酸產(chǎn)率15％以上，同時(shí)提高原料中糖的利用率9％以上，從而有效的降低了L-乳酸的生產(chǎn)成本，促進(jìn)L-乳酸的生產(chǎn)應(yīng)用。
為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，現(xiàn)參照下列附圖和實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行解釋。附圖和實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明。


圖1為根霉生產(chǎn)L-乳酸的生產(chǎn)工藝流程2為用根霉生產(chǎn)L-乳酸的操作流程號(hào)說(shuō)明1-種子培養(yǎng)缸 2-發(fā)酵培養(yǎng)缸3-補(bǔ)料缸4-碳酸鈣貯缸 5-種子缸進(jìn)氣管路6-接種管路7-發(fā)酵培養(yǎng)缸進(jìn)氣管路 8-補(bǔ)料管路9-碳酸鈣添加管路 10-排料管路具體實(shí)施方式
為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，現(xiàn)參照下列實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行解釋。實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)(三角燒瓶振蕩培養(yǎng))培養(yǎng)所用的根霉菌屬菌東京根霉(Rhinous tokinensis NO 3.851)，購(gòu)自菌種管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，經(jīng)分離純化選育。在表1所示的PDA斜面瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接種斜面孢子于裝有表2所示的孢子增生培養(yǎng)基2.5g的100mL三角燒瓶上，34℃恒溫培養(yǎng)，至孢子大量生成為止。無(wú)菌水50mL加入長(zhǎng)滿孢子的100mL三角燒瓶中，振蕩，使孢子懸浮，孢濃度大于104個(gè)/mL。取4mL孢子懸浮液加入裝有表3所示的種子培養(yǎng)基30mL的100mL三角燒瓶中，置于恒溫振蕩器上恒溫振蕩培養(yǎng)，34℃，180rpm，14h。
然后，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基全部接種于裝有100mL如表4所示的發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，并置于恒溫振蕩器上恒溫振蕩培養(yǎng)，34℃，300rpm。培養(yǎng)24h，發(fā)酵液澄清，此時(shí)添加2％的滅過(guò)菌的CaCO3繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)36h時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖2g和1％的CaCO3，繼續(xù)培養(yǎng)直至72h時(shí)發(fā)酵到達(dá)終點(diǎn)。發(fā)酵過(guò)程如表5所示。
從接種培養(yǎng)的12h后糖的消耗速度加快，24h后，L-乳酸的生長(zhǎng)成較快。在36h補(bǔ)加糖和CaCO3后發(fā)酵培養(yǎng)繼續(xù)進(jìn)行，菌絲體首選吸收利用葡萄糖然后再生成L-乳酸，最終L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量為120g/L，以發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中的含糖量為基準(zhǔn)，L-乳酸的收率達(dá)79％。
表1鈴薯瓊脂培養(yǎng)基

表2 孢子增生培養(yǎng)基

表3種子培養(yǎng)基

表4發(fā)酵培養(yǎng)基

表5發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程

比較例1使用根霉NO 3.851，在與實(shí)施例1相同的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，只是在發(fā)酵過(guò)程中不補(bǔ)加糖，CaCO3的添加不變。其結(jié)果如表6所示。
從表6可以看出，根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸在不補(bǔ)加糖的情況下，發(fā)酵產(chǎn)酸率為103g/L，乳酸收率為70％。由此可以看出，發(fā)酵的中后期補(bǔ)加葡萄糖不但可以提高分批發(fā)酵產(chǎn)酸量，而且能提高糖的利用率。
表6

實(shí)施例2L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)(三角燒瓶振蕩培養(yǎng))本實(shí)驗(yàn)中，所用的三角燒瓶改為具有擋板結(jié)構(gòu)的500mL三角燒瓶。由于使用了這種三角燒瓶使振蕩培養(yǎng)過(guò)程氧的供給條件得到了較大的改善，但發(fā)酵時(shí)間有所延長(zhǎng)。
本實(shí)驗(yàn)中，從斜面菌種到種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作與實(shí)施例1相同。其結(jié)果如表7所示。
實(shí)施例2與實(shí)施例1相比在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中菌絲體量明顯的減少，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)酸速度顯著下降。在培養(yǎng)30h時(shí)第一次添加CaCO3，60h和補(bǔ)糖一起再次添加CaCO3。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)L-乳酸產(chǎn)量達(dá)136g/L，乳酸的發(fā)酵收率達(dá)到86％。
實(shí)施例3L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)(攪拌型反應(yīng)器培養(yǎng))本實(shí)施例中斜面菌種、孢子增生培養(yǎng)與實(shí)施例1中相同，在種子培養(yǎng)時(shí)以500mL三角瓶裝150mL如表3所示的種子培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)。按表8所示的發(fā)酵培養(yǎng)基配制發(fā)酵培養(yǎng)基3.5L，于7L攪拌型反應(yīng)器中，其中加水時(shí)3.1L，滅菌后加入200mL培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，200mL30％(W/V)的CaCO3懸濁液，使發(fā)酵培養(yǎng)液總體積達(dá)到3.5L。
發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度34℃，通氣量0.6vvm，最初攪拌速度200rpm；36h時(shí)發(fā)酵液澄清，此時(shí)補(bǔ)加30％(W/V)CaCO3懸濁液200mL，提高攪拌速度至300rpm；60h時(shí)菌絲體處于高速產(chǎn)酸的中期，些時(shí)添加50％(W/V)葡萄糖液200mL，和15％(W/V)CaCO3懸濁液100mL。最終發(fā)酵L-乳酸產(chǎn)酸量為154g/L，以加入的葡萄量計(jì)算L-乳酸收率為87％。發(fā)酵過(guò)程如表9所示。
從以上實(shí)施例和對(duì)比例可以看出，以本發(fā)明工藝進(jìn)行L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)發(fā)酵類型基本屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵，即培養(yǎng)前期主要是菌體的生長(zhǎng)為主，中后期以產(chǎn)酸為主。在發(fā)酵培養(yǎng)中期出現(xiàn)酸的高速積累，但菌絲體代謝葡萄糖的量與產(chǎn)酸量并不成正比關(guān)系，經(jīng)層析法定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中有中間酸的積累現(xiàn)象，在發(fā)酵后期中間酸可轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸。
表7

表8

表9

權(quán)利要求
1.一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝，采用根霉菌屬的菌種生成乳酸，其特征在于其工藝包括以下步驟A.對(duì)菌種進(jìn)行斜面菌種的制備和孢子的增生培養(yǎng)；B.將步驟A獲得的孢子置入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)；C.將步驟B獲得的種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)加單糖料及中和劑，使發(fā)酵液殘?zhí)菨舛忍岣?～3％，中和劑添加總量達(dá)到5-7％。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝，其特征在于以固曲孢子擴(kuò)增培養(yǎng)基對(duì)根霉的孢子進(jìn)行增生培養(yǎng)；固曲原料選用麩皮或面包渣作為真菌生長(zhǎng)并產(chǎn)生孢子的原料。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝，其特征在于種子培養(yǎng)基采用玉米粉水解物。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝，其特征在于1)、在發(fā)酵培養(yǎng)中，當(dāng)發(fā)酵液酸積累量達(dá)到85～95g/L，殘?zhí)橇康陀?％時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，向生物反應(yīng)器內(nèi)單獨(dú)添加單糖，使發(fā)酵液中殘?zhí)橇刻岣?～4％。2)、補(bǔ)料的方式是間歇式的補(bǔ)加，補(bǔ)加糖是一次性的加入。3)、在分批發(fā)酵中，優(yōu)選中性碳酸鹽類為pH中和劑，分三次加入，第一次在發(fā)酵培養(yǎng)初始時(shí)加入1-3％的中性碳酸鹽類，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.5～6.0，第二次在第一次加入的中性碳酸鹽類用盡后補(bǔ)加，最后一次則與補(bǔ)料時(shí)一同加入。
全文摘要
本發(fā)明為一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的工藝，采用根霉菌屬的菌種生成乳酸，其工藝包括以下步驟A.對(duì)菌種進(jìn)行斜面菌種的制備和孢子的增生培養(yǎng)；B.將步驟A獲得的孢子置入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)；C.將步驟B獲得的種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，并在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)加單糖料及中和劑，使發(fā)酵液殘?zhí)菨舛忍岣?～3％，中和劑添加總量達(dá)到5－7％。本發(fā)明工藝在種子的制備過(guò)程中通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基成分的控制可獲得微小的菌球體，并在發(fā)酵中期進(jìn)行分批補(bǔ)加碳源可獲得L－乳酸的高產(chǎn)，并提高碳源的利用率，其產(chǎn)品L－乳酸廣泛用于食品、醫(yī)藥、釀造、皮革、塑料等行業(yè)，是十分有用的化合物。
文檔編號(hào)C12P7/56GK1566350SQ0314856
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月3日
發(fā)明者茆軍, 婁愷, 張志東, 歐提庫(kù)爾·馬合木提 申請(qǐng)人:新疆威仕達(dá)生物工程股份有限公司