一種補(bǔ)料生產(chǎn)wf16616的分批發(fā)酵工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種補(bǔ)料生產(chǎn)WF16616的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] WF16616 (C51H82N8O21S,分子量 1174)是從真菌Tolpocladiumparasiticum No. 16616的發(fā)酵培養(yǎng)液中分離得到的一種新型脂肽類抗真菌化合物，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾可以得 到一種新型棘白菌素類抗真菌藥物米卡芬凈（Micafungin，F(xiàn)K- 463)。WF16616及FK- 463 的結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]
[0004] 米卡芬凈對(duì)念珠菌屬、曲霉屬具有廣泛抗真菌作用，對(duì)耐氟康唑與伊曲康唑的念 珠菌亦有作用；能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制1，3 -葡聚糖合成酶的活性，從而抑制真菌細(xì)胞壁合成，故 該化合物對(duì)真菌細(xì)胞具有較高的特異性，而對(duì)人體副作用較小。
[0005] 米卡芬凈由日本藤澤公司開發(fā)，于2002年12月在日本上市，商品名為Fungard， 2005年3月獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)；目前米卡芬凈主要獲準(zhǔn)用于治療以目前治療手段難以治愈 的真菌感染以及預(yù)防造血干細(xì)胞移植患者的真菌感染。
[0006] 到目前為止，液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)WF16616的專利較少。美國(guó)專利US5854276公布了 利用真菌TolypocladiumparasiticumNo. 16616發(fā)酵生產(chǎn)WF16616的過程：從斜面培養(yǎng)基 取一環(huán)生長(zhǎng)時(shí)間為2周的Wf16616產(chǎn)生菌，接種于含種子培養(yǎng)基（蔗糖2%，棉籽粉2%，干酵 母1%，聚蛋白胨1%，甘油2%，KH2P040.l%，Tween-800. 1%，121°C滅菌30min，上述百分比為重 量百分比wt%，即每IOOmL培養(yǎng)基中的組分克數(shù)）的500mL搖瓶中，裝量160mL，25°C培養(yǎng)一 周后，接種于含有20L發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖1%，玉米淀粉2%，大豆粉0. 5%，干酵母0. 5%，棉 籽粉1%，KH2PO4O. 1%，Tween- 800. 1%，121°C滅菌30min，上述百分比為重量百分比）的30L 發(fā)酵罐中，200r/min攪拌，通氣量為20L/min，25°C培養(yǎng)6天后，所得15L發(fā)酵液經(jīng)分離純化 僅得到純品46. 6mg(產(chǎn)量約3.lmg/L)，Wf16616的產(chǎn)量很低，距工業(yè)化生產(chǎn)還有很大差距。
[0007]RyuichiKanasaki等在J.Antibiot.，59 (3) : 158 - 167 公布了利用真菌 TolpocladiumparasiticumNo. 16616發(fā)酵生產(chǎn)WF16616的過程：從斜面培養(yǎng)基取一環(huán)生 長(zhǎng)時(shí)間為2周的Wf16616產(chǎn)生菌，接種于含種子培養(yǎng)基（蔗糖2%，棉籽粉2%，干酵母1%，聚 蛋白胨1%，甘油2%，KH2PO4O. 1%，Tween- 800. 1%，121°C滅菌30min，上述百分比為重量百分 比wt%，即每IOOmL培養(yǎng)基中的組分克數(shù)）的500mL搖瓶中，裝量160mL，25°C培養(yǎng)7天后，接 種于含有20L發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖1%，玉米淀粉2%，黃豆粉0. 5%，干酵母0. 5%，棉籽粉1%， AdekanolLG- 1090. 05%，SiliconeKM- 700. 05%，121°C滅菌 30min，上述百分比為重量百分 比）的30L發(fā)酵罐中，200r/min攪拌，通氣量為20L/min，25°C培養(yǎng)6天后，所得15L發(fā)酵液 經(jīng)分離純化僅得到純品47mg(產(chǎn)量約3.lmg/L);同樣，WF16616的產(chǎn)量也很低。
[0008] 胡海峰等發(fā)表的名稱為一種生產(chǎn)WF16616的發(fā)酵培養(yǎng)基及使用方法的專利申請(qǐng) 號(hào)CN201110390608. 6,通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成將WF16616單位產(chǎn)量由現(xiàn)有技術(shù)的3.lmg/L提 高到 300 - 420mg/L。
[0009] 綜上，上述發(fā)酵生產(chǎn)Wf16616的存在普遍問題是發(fā)酵單位偏低，工業(yè)應(yīng)用受限。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010] 本發(fā)明目的是提供一種補(bǔ)料生產(chǎn)WF16616的新工藝，通過流加碳源為葡萄糖、蔗 糖、甘露醇、油或甘露醇與油混合液的補(bǔ)料溶液實(shí)現(xiàn)，解決分批發(fā)酵中WF16616產(chǎn)量較低的 問題，以提高WF16616產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
[0011] 本發(fā)明提供了一種補(bǔ)料生產(chǎn)WF16616的分批發(fā)酵工藝，其特征是：所述工藝包 括發(fā)酵步驟和補(bǔ)料步驟；其中，所述發(fā)酵步驟采用的菌株為Tolpocladiumparasiticum No. 16616,所述補(bǔ)料步驟采用的營(yíng)養(yǎng)成分選自甘露醇、葵花籽油、大豆油和蔗糖中的至少兩 種。
[0012] 發(fā)酵步驟采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，即，采用合適的菌種以及適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件。
[0013] 而補(bǔ)料步驟為本發(fā)明創(chuàng)新和獨(dú)有。
[0014] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述補(bǔ)料步驟采用的營(yíng)養(yǎng)成分選自甘露醇和葵花籽油。
[0015] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述營(yíng)養(yǎng)成分以流加方式加入發(fā)酵液中，并通過調(diào)節(jié)流 加速度控制發(fā)酵液的pH值為6. 0 - 6. 6,優(yōu)選為6. 2 - 6. 4。
[0016] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，甘露醇的補(bǔ)加量（g)為原始發(fā)酵液體積（mL)的 0. 1 - 10%，優(yōu)選為0. 5 - 5%，葵花籽油的補(bǔ)加量（mL)為原始發(fā)酵液體積（mL)的0. 1 - 10%， 優(yōu)選為〇. 5 - 5%。
[0017] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，自發(fā)酵72小時(shí)時(shí)開始補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)成分，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)停 止。
[0018] 發(fā)酵結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)為：監(jiān)測(cè)到發(fā)酵液開始變得稀，還原糖含量降低到1.0%以下，鏡檢 發(fā)現(xiàn)菌絲體開始衰老。
[0019] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，控制所述發(fā)酵步驟和補(bǔ)料步驟的溫度為20 - 30°C(優(yōu)選 為25°C)，攪拌轉(zhuǎn)速為100 - 300r/min，通氣量為0. 5 - 2v/v?m，全工藝的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為 10 - 16 天。
[0020] 為便于理解發(fā)明，本發(fā)明也提供了一種優(yōu)選實(shí)施方式，其中，發(fā)酵所用的發(fā)酵培養(yǎng) 基組成為：甘露醇1. 8 - 2. 5%，玉米淀粉1. 8 - 2. 5%，棉籽粉1. 8 - 2. 5%，干酵母0. 8 - 1. 5%， 聚蛋白胨 〇? 8 -L5%，NaH2PO4O. 08 - 0? 15%，余量為水，pH值為 6. 5 - 7. 5。
[0021] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，發(fā)酵所用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘露醇2%，玉米淀粉2%， 棉籽粉2%，干酵母1%，聚蛋白胨1%，NaH2PO4O. 1%，余量為水，pH值為7. 0。
[0022] 為便于理解發(fā)明，本發(fā)明也提供了一種優(yōu)選實(shí)施方式，其中，對(duì)于發(fā)酵采用的菌株 進(jìn)行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)，以達(dá)到發(fā)酵所需的菌種量；斜面培養(yǎng)所用的斜面培養(yǎng)基組成為： 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，pH自然，斜面培養(yǎng)條件為：20 - 30°C培養(yǎng)10- 16天；
[0023] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，鹿糖1. 8 - 2. 5%，棉籽粉1. 8 - 2. 5%，干酵母0. 8 -1. 5%，聚 蛋白胨0. 8 - 1. 5%，甘油1. 8 - 2. 5%，KH2PO4O. 08 - 0. 15%，余量為水，pH值為7. 0,種子培養(yǎng) 條件為：20 - 30°C培養(yǎng)3 - 8天。
[0024] 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，種子培養(yǎng)所用的種子培養(yǎng)基組成為：鹿糖2%，棉籽粉2%， 干酵母1%，聚蛋白胨1%，甘油2%，KH2PO4O. 1%，余量為水。
[0025] 通過本發(fā)明的補(bǔ)料發(fā)酵工藝，解決分批發(fā)酵中WF16616產(chǎn)量低的問題，顯著提高 WF16616產(chǎn)率，其發(fā)酵效價(jià)達(dá)到550 - 660mg/L，從而極大程度的降低生產(chǎn)成本。
[0026] 術(shù)語(yǔ)及說明
[0027] 未做其他說明，本文中的術(shù)語(yǔ)或縮寫具有本領(lǐng)域通常所指的含義，具體地：g為重 量單位克的縮寫，L為體積單位升的縮寫，mL為體積單位毫升的縮寫，yL為體積單位微升 的縮寫，min是時(shí)間單位分鐘的縮寫，h是時(shí)間單位小時(shí)的縮寫，d是時(shí)間單位天的縮寫。r/ min表示每分鐘的攪拌轉(zhuǎn)數(shù)。此外，在微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，一般以通氣比來表示通氣量，通常 以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示（V/V?min)。如：內(nèi)裝3m3培養(yǎng)液發(fā) 酵罐若每分鐘通入I. 5m3無菌空氣則通氣比1. 5/3=0. 5簡(jiǎn)稱通氣量0. 5(V/V?min)。發(fā) 酵液PH值通過pH計(jì)測(cè)量得到。
[0028] 以下通過實(shí)施例以進(jìn)一步闡明本發(fā)明；應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 色譜條件
[0030] 采用HPLC法定量檢測(cè)WF16616各組分的含量。色譜柱C18柱（4. 6mmX200mm， 5um);流動(dòng)相乙腈-0. 32%磷酸二氫鈉（45 :55);流速lmL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)212nm;柱溫30°C; 進(jìn)樣量20iiL。
[0031] 實(shí)驗(yàn)菌株：TolpocladiumparasiticumNo. 16616。
[0032] 實(shí)施例1 :步驟1)斜面培養(yǎng)：將種子取出活化后接種至斜面培養(yǎng)基（PDA，其配方 為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，pH自然，121°C滅菌30min)，將接種的斜面置于28°C 恒溫培養(yǎng)14d，得到成熟孢子；
[0033] 步驟2)種子培養(yǎng)：將斜面成熟孢子接種于裝量為500mL種子培養(yǎng)基（蔗糖2%，棉