補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵的技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]普魯蘭多糖是一種類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)微生物胞外多糖，是葡萄糖以α-1，4_糖苷鍵結(jié)合成麥芽三糖，兩端再以α-1，6_糖苷鍵同另外的麥芽三糖結(jié)合，如此反復(fù)連接而成高分子聚合物。普魯蘭多糖已作為乳化劑、懸浮劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、膠凝劑、成膜劑和潤(rùn)滑劑等廣泛應(yīng)用于食品、制藥、石油、化工等多個(gè)領(lǐng)域。其將是今后新型發(fā)酵工程的一個(gè)重要發(fā)展方向，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)企業(yè)的重視。
[0003]目前文獻(xiàn)當(dāng)中關(guān)于普魯蘭多糖產(chǎn)量提高主要是通過(guò)菌種誘變、培養(yǎng)基成分優(yōu)化，往往效果不太明顯，發(fā)酵周期長(zhǎng)，且底物的轉(zhuǎn)化率不高，導(dǎo)致普魯蘭多糖成本居高不下。申請(qǐng)?zhí)枮?01210594876.4的中國(guó)發(fā)明專利《大量生產(chǎn)普魯蘭多糖的誘變菌株及其培養(yǎng)方法》，公開(kāi)了一株產(chǎn)普魯蘭多糖的出芽短梗霉CGMCC N0.7055，并公開(kāi)了利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，以及發(fā)酵培養(yǎng)基組成。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)BCSffGHPLlOl在發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖產(chǎn)量為96g/L，較原始菌株68 ±5.2g/L的產(chǎn)量，提高了 41.2%，發(fā)酵條件為28°0，200±20印111下培養(yǎng)3(1。但其仍存在發(fā)酵周期較長(zhǎng)，且底物轉(zhuǎn)化率較低，底物利用率不高的問(wèn)題，導(dǎo)致普魯蘭多糖成本較高，不利于大批量、規(guī)?；a(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。
[0005]本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是:
[0006]本發(fā)明的補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0007]I)種子培養(yǎng)
[0008]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500mL擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100mL，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28_32h ；
[0009]所述種子培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖10，酵母浸粉0.3，氯化鈉0.25，磷酸氫二鉀0.2，硫酸銨0.1，硫酸鎂0.04，硫酸亞鐵0.05，蒸餾水定容至10mL后用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，121°C滅菌20分鐘；
[0010]2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0011]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，初始ρΗ6.0 + 0.1，培養(yǎng)溫度30°C ；
[0012]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖150，蛋白胨5，磷酸氫二鉀7，硫酸鎂0.4，氯化鈉3，硫酸亞鐵0.05，用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，按0.1%。量添加泡敵，121°C滅菌20分鐘;
[0013]在發(fā)酵24-28h后開(kāi)始流加補(bǔ)料溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在6-12g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加一次氨基酸溶液0.5_2g/L，發(fā)酵總周期為65_67h。
[0014]3)普魯蘭多糖的分離
[0015]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，保持4°C靜置過(guò)夜，離心后，再使用無(wú)水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品。
[0016]補(bǔ)加的氨基酸溶液中包括賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸中的至少一種。
[0017]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0018]本發(fā)明的補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法中，針對(duì)出芽短梗霉CGMCCN0.7055發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖過(guò)程中存在周期長(zhǎng)、底物轉(zhuǎn)化率低的缺陷，根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，在發(fā)酵過(guò)程中流加適量氨基酸有助于普魯蘭多糖的合成，提高底物轉(zhuǎn)化率，操作便捷，效果明顯，較大地縮短了發(fā)酵周期，降低了普魯蘭多糖的成本。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明中所述的出芽短梗霉BCSWGHPL101 (Aureobasidium Pullulans)是由實(shí)驗(yàn)室保藏的一株產(chǎn)色素量少的出芽短梗霉TKPM10017經(jīng)篩選誘變獲得，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101。保藏日期2012年12月25日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7055。
[0020]本發(fā)明的補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟:
[0021]I)種子培養(yǎng)
[0022]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500mL擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100mL，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28_32h ；
[0023]所述種子培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖10，酵母浸粉0.3，氯化鈉0.25，磷酸氫二鉀0.2，硫酸銨0.1，硫酸鎂0.04，硫酸亞鐵0.05，蒸餾水定容至10mL后用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，121°C滅菌20分鐘:
[0024]2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0025]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，初始pH6.0±0.1，培養(yǎng)溫度30°C ；
[0026]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖150，蛋白胨5，磷酸氫二鉀7，硫酸鎂0.4，氯化鈉3，硫酸亞鐵0.05，用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，按0.1%。量添加泡敵，121°C滅菌20分鐘;
[0027]在發(fā)酵24_28h后開(kāi)始流加補(bǔ)料溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在6_12g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加一次氨基酸溶液0.5_2g/L，發(fā)酵總周期為65_67h。
[0028]3)普魯蘭多糖的分離
[0029]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，保持4°C靜置過(guò)夜，離心后，再使用無(wú)水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品。
[0030]補(bǔ)加的氨基酸溶液中包括賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸中的至少一種。
[0031]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0032]空白對(duì)照:
[0033]I)種子培養(yǎng)
[0034]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28h ；
[0035]2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0036]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，溫度30°C，轉(zhuǎn)速為400rpm進(jìn)行培養(yǎng)；
[0037]3)普魯蘭多糖的分離
[0038]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過(guò)夜，離心后，再使用無(wú)水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品64.9g/L，發(fā)酵周期為74h。
[0039]實(shí)施例1:
[0040]I)種子培養(yǎng)
[0041]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28h ；
[0042]2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0043]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，培養(yǎng)溫度30°C，發(fā)酵24h后開(kāi)始流加補(bǔ)料溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在6-12g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加一次苯丙氨酸溶液0.8g/L，發(fā)酵時(shí)間67h ；
[0044]3)普魯蘭多糖的分離
[0045]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過(guò)夜，離心后，再使用無(wú)水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品74.6g/L。發(fā)酵周期為67h，與未補(bǔ)料發(fā)酵所需發(fā)酵周期為74h相比，縮短了 7h，普魯蘭多糖產(chǎn)量提高了 14.94%。
[0046]實(shí)施例2:
[0047]I)種子培養(yǎng)
[0048]將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為30h ；
[0049]2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0050]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，培養(yǎng)溫度30°C，發(fā)酵28h后開(kāi)始流加補(bǔ)料溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在6-12g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加一次精氨酸溶液1.5g/L，發(fā)酵時(shí)間65h ；
[0051]3)普魯蘭多糖的分離
[0052]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過(guò)夜，離心后，再使用無(wú)水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品73.9g/L。發(fā)酵周期為65h ;與未補(bǔ)料發(fā)酵所需發(fā)酵周期為74h相比，縮短了 9h，普魯蘭多糖產(chǎn)量提高了 13.86%。
[0053]實(shí)施例3:
[0054]I)將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500ml擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量100ml，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為30h ；
[0055]2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0056]5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，培養(yǎng)溫度30°C，發(fā)酵25h后開(kāi)始流加補(bǔ)料溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在6-12g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加一次賴氨酸溶液1.3g/L，組氨酸溶液1.8g/L，發(fā)酵時(shí)間66h ；
[0057]3)普魯蘭多糖的分離
[0058]發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，4°C靜置過(guò)夜，離心后，再使用無(wú)水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品73.3g/L。發(fā)酵周期為66h，與未補(bǔ)料發(fā)酵所需發(fā)酵周期為74h相比，縮短了 8h ;普魯蘭多糖產(chǎn)量提高了 12.94%。
[0059]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，然而，并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)然會(huì)利用揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾，成為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟: 1)種子培養(yǎng) 將出芽短梗霉菌株進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接到500mL擋板瓶中，培養(yǎng)基裝液量lOOmL，培養(yǎng)溫度為32°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為28_32h ； 所述種子培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖10，酵母浸粉0.3，氯化鈉0.25，磷酸氫二鉀0.2，硫酸銨0.1，硫酸鎂0.04，硫酸亞鐵0.05，蒸餾水定容至10mL后用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，121°C滅菌 20 分鐘； 2)發(fā)酵培養(yǎng) 5L發(fā)酵罐裝液量1.8L，接種量為4% (V/V)，初始ρΗ6.0 + 0.1，培養(yǎng)溫度30°C ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):蔗糖150，蛋白胨5，磷酸氫二鉀7，硫酸鎂0.4，氯化鈉3，硫酸亞鐵0.05，用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)制pH = 6±0.1，按0.1%。量添加泡敵，121°C滅菌20分鐘； 在發(fā)酵24-28h后開(kāi)始流加補(bǔ)料溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在6-12g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加一次氨基酸溶液0.5-2g/L，發(fā)酵總周期為65-67h。 3)普魯蘭多糖的分離 發(fā)酵液濾除菌體后，加入兩倍乙醇，攪拌，保持4°C靜置過(guò)夜，離心后，再使用無(wú)水乙醇沖洗2遍，干燥得白色普魯蘭多糖粗品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:補(bǔ)加的氨基酸溶液中包括賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸中的至少一種。
【專利摘要】一種補(bǔ)料發(fā)酵提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和普魯蘭多糖的分離；在發(fā)酵24-28h后開(kāi)始流加補(bǔ)料溶液，控制發(fā)酵液殘?zhí)蔷S持在6-12g/L，同時(shí)每隔兩小時(shí)補(bǔ)加一次氨基酸溶液0.5-2g/L，發(fā)酵總周期為65-67h。本發(fā)明針對(duì)出芽短梗霉CGMCC NO.7055發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖過(guò)程中存在周期長(zhǎng)、底物轉(zhuǎn)化率低的缺陷，在發(fā)酵過(guò)程中流加適量氨基酸有助于普魯蘭多糖的合成，提高了底物轉(zhuǎn)化率，操作便捷，效果明顯，較大地縮短了發(fā)酵周期，降低了普魯蘭多糖的成本。CGMCC NO.705520121225
【IPC分類】C12R1/645, C12P19/10
【公開(kāi)號(hào)】CN104911231
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410820130
【發(fā)明人】喬長(zhǎng)晟, 王建梓, 郝華璇, 李振海
【申請(qǐng)人】天津北洋百川生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日