一種化學-酶法生產(chǎn)加巴噴丁的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種加巴噴丁的制備方法，特別涉及一種綠色、高效的化學-酶法合 成加巴噴丁的方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 加巴噴?。℅abapentin)是一種一線的抗癲癇藥物，其化學名為1-氨甲基環(huán)己基 乙酸，分子式為C 19H17NO2。加巴噴丁是哺乳動物體中的一種重要神經(jīng)遞質一 γ -氨基丁酸 (GABA)的結構類似物，主要通過改變GABA的代謝來發(fā)揮藥理作用，尤其對重癥癲癇的治療 效果明顯。在高劑量下耐受性良好，不與血漿蛋白結合，毒性較低，半衰期較長，副作用小。
[0003] 由加巴噴丁的結構信息可知，加巴噴丁分子中包含有一個環(huán)己烷基、一個氨甲基 和一個乙酸基。因此，其合成多以環(huán)己烷基化合物為起始原料。目前，諸多研宄者以環(huán)己 酮、環(huán)己基甲醛、亞甲基環(huán)己烷、苯甲腈等為原料開發(fā)出了數(shù)十條合成路徑。這些合成路徑 所使用的皆為單純的化學方法，他們各有優(yōu)劣，但總體上依然普遍存在或多或少的缺陷， 如：反應步驟冗長、反應條件苛刻、需要使用有毒或者易燃易爆的危險性試劑、工藝過程不 經(jīng)濟等。因此，多數(shù)并不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。Rex Alien等（ΕΡ0414262Α2)于1991年報 道的從1-氰基環(huán)己基乙腈經(jīng)選擇性水解、加氫合成加巴噴丁的方法。其過程如圖1，圖 1 中試劑和條件：（1)① Py/TiCl4,② NaCN/Et0H/H20 ; (2)Et0H/PhCH3/HClg/H20/3M NaOH/ MetOH ； (3) 10%Rh-C/H2(50psi)/Me0H/i-Pr0H or Raney Ni (50% in H2O)/Me0H/50 % NaOH/ H2(180psi)/i-Pr0H/THF。
[0004] 這條合成路徑通過I-氫基環(huán)己基乙腈分子上兩個氰基的選擇性反應，分別引入 氨甲基和乙酸基，反應步驟較少，原料廉價易得，因而是一條可選路徑。然而該路徑之所以 未得到廣泛應用，其原因在于：一方面，該路徑需要使用大量的酸、堿及有機試劑。如反應 ⑵，每生產(chǎn)It 1-氰基環(huán)己基乙酸即需消耗HCl氣體：0.94t，3M NaOH水溶液：2. 82m3,乙 醇：0. 71t，甲苯：3. 93m3,甲醇：0. 47m3,水：7. 06t ;另一方面，該路徑的總體收率較低，反應 (2)中1-氰基環(huán)己基乙酸的收率為78%，反應（3)中加巴噴丁的收率最高僅為79%，最終 從1-氫基環(huán)己基乙腈到加巴噴丁，其總體收率最高僅為61. 62%。因此該路徑的經(jīng)濟性及 環(huán)境友好性皆較低，從而限制了其工業(yè)化應用。鑒于此，我們嘗試對該路徑進行大量的改 進，尤其是對第二步及第三步反應的改進，從而構建出一條新的合成工藝。
[0005] 化學法水解1-氰基環(huán)己基乙腈生成1-氰基環(huán)己基乙酸，反應條件苛刻，環(huán)境污染 嚴重，且選擇性差，得率低，原子經(jīng)濟性低。而腈水解酶的高催化選擇性、高催化活力、溫和 的催化條件為解決這一問題提供了方向。
[0006] 腈水解酶的工業(yè)化應用，其關鍵在于高效的酶生產(chǎn)技術，而高密度培養(yǎng)則使實現(xiàn) 這一目標成為可能。我們的另一項專利（CN 104212785 A)中詳細描述了含可高效催化 1-氰基環(huán)己基乙腈選擇性水解生成1-氰基環(huán)己基乙酸的腈水解酶，及其基因工程菌的高 密度培養(yǎng)技術。利用該技術，實現(xiàn)了工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)此腈水解酶，這為后續(xù)加巴噴丁合成 的研宄奠定了基礎。
[0007] -般而言生物催化主要包括：添加前體發(fā)酵法、游離酶法、靜息細胞法、固定化酶 法、固定化細胞法等，這些方法各有特點。而就工業(yè)化應用而言，靜息細胞法和固定化細胞 法由于避免了酶的純化步驟，從而大大降低了生產(chǎn)成本。
[0008] 利用純酶催化1-氰基環(huán)己基乙腈選擇性水解生成1-氰基環(huán)己基乙酸在 本實驗室的一篇論文里即有報道（Xin-Hong Zhang et al/Process Biochemistry 49(2014)，2141-2148)。然而純酶催化的弊端在于：（1)酶蛋白直接暴露于催化反應體系 內，穩(wěn)定性大大降低，反應一段時間后酶活衰減明顯；(2)酶的純化過程復雜而繁瑣，會大 大增加生產(chǎn)成本；(3)酶蛋白回收困難，且會對后續(xù)的反應產(chǎn)生影響，不利于分離。正是這 些缺陷，致使其不適合應用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009] 與之相比，靜息細胞催化則表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢。一方面，酶蛋白存在于相對 溫和、適宜的細胞內環(huán)境，穩(wěn)定性大大提高；另一方面，細胞收集操作簡單、方便，避免了 繁瑣的酶純化過程；最后，靜息細胞也更利于催化劑回收。利用含腈水解酶的靜息細胞 催化1-氰基環(huán)己基乙腈選擇性水解生成1-氰基環(huán)己基乙酸在我們的另一項專利（CN 104212785A)中即有論述。同時，我們的另一篇論文里也有詳細報道（Xue et al/Catalysis Communications 66(2015) 121-125)。結果表明，催化水平較純酶有大幅度提高。在此基礎 上，我們初步建立了一條化學一酶法合成加巴噴丁的工藝。并報道于一篇論文里（Ya-Ping Xue et al/Catalysis Communications 66(2015)121-125)。
[0010] 該工藝中，首先用含腈水解酶的靜息細胞催化1-氰基環(huán)己基乙腈選擇性水解生 成1-氰基環(huán)己基乙酸。由于靜息細胞在催化過程中細胞破碎，導致大量的蛋白及有機大分 子物質被釋放至反應體系，這些有機大分子物質會讓后續(xù)的加氫催化劑中毒。因此，不得不 對酶催化轉化液進行預處理。
[0011] 經(jīng)過預處理后的含1-氰基環(huán)己基乙酸的水溶液可直接加氫生成加巴噴丁內酰 胺，然后加巴噴丁內酰胺經(jīng)過一個簡單的化學過程生成加巴噴丁純品，其過程如圖2所示。
[0012] 然而該工藝依然存在較為突出的缺陷，無法在工業(yè)化生產(chǎn)中得到應用：
[0013] (1)該工藝使用靜息細胞作為催化劑，但靜息細胞使用一次后酶活迅速衰減至 20%，這意味著靜息細胞幾乎只能使用一次，無法實現(xiàn)批次重復使用。然而就該生產(chǎn)加巴噴 丁的工藝而言，生物催化劑的生產(chǎn)成本恰是總成本的主要部分，因此，降低總成本，即必須 從提高生物催化劑利用率著手。
[0014] (2)靜息細胞在催化過程中，隨著細胞的破碎，大量的蛋白及有機大分子物質被釋 放出來，這些物質會使后續(xù)的加氫催化劑中毒，為了解決這一問題，不得不對靜息細胞催化 轉化液進行預處理。使用三氯化鋁絮凝，雖然能達到加氫要求，但是一方面，三氯化鋁對設 備有一定的腐蝕作用；同時轉化液中還存在少量的蛋白質。對加氫催化劑的重復使用存在 一定的影響，另一方面，預處理工序也會增加生產(chǎn)成本；
[0015] (3)該工藝并未實現(xiàn)水的循環(huán)利用，而廢水處理恰恰也是總生產(chǎn)成本的一個重要 部分。
[0016] 為了解決這些問題，不得不對該工藝做進一步改進。首先，固定化細胞為解決使用 靜息細胞催化所帶來的問題提供了可能。將游離細胞固定化，可大大增強其機械強度，很好 的保證其細胞的完整性，避免了蛋白及大分子物質的泄漏問題，增強了酶的穩(wěn)定性，從而使 得酶的批次重復使用成為可能。因此，研宄開發(fā)一種性能優(yōu)異、制備工藝簡單經(jīng)濟的固定化 細胞技術具有極大的現(xiàn)實意義。此外，需要設計更加優(yōu)化的水及有機試劑循環(huán)利用的工藝， 從而進一步降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明正是基于這一思路展開的探索與研宄。 (三）
【發(fā)明內容】

[0017] 本發(fā)明的目的是提供一種綠色、高效的化學-酶法合成加巴噴丁的方法，即首先 利用固定化細胞催化1-氰基環(huán)己基乙腈選擇性水解生成1-氰基環(huán)己基乙酸，然后含1-氰 基環(huán)己基乙酸的酶催化轉化液直接加氫生成加巴噴丁內酰胺，最后加巴噴丁內酰胺經(jīng)水 解、堿化生成加巴噴丁，并在該過程中實現(xiàn)廢水及其他試劑的循環(huán)使用，最終得到一條綠 色、經(jīng)濟、高效的加巴噴丁合成工藝。
[0018] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0019] 本發(fā)明提供一種化學-酶法生產(chǎn)加巴噴丁的方法，所述的方法為：（1)酶催化：以 含腈水解酶的固定化細胞為酶源，以1-氰基環(huán)己基乙腈為底物，以水或磷酸鹽緩沖液為反 應介質，在20-50°C、100-350rpm條件下進行轉化反應（優(yōu)選20-50°C、100-350rpm條件下 反應l-5h，更優(yōu)選35°C、200rpm條件下反應2. 5h)，反應結束后，將轉化反應液過濾，獲得 濾餅和濾液，濾餅回收酶源，濾液即為含1-氰基環(huán)己基乙酸的轉化液；所述含腈水解酶的 固定化細胞按如下方法制備：將含腈水解酶基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌 體加入緩沖液（優(yōu)選pH = 7. 0、IOOmM磷酸鹽緩沖液）或蒸餾水中，制成菌懸液；向菌懸液 中添加載體，攪拌混勻，再加入聚乙烯亞胺，攪拌絮凝〇. 5~2h，然后加入戊二醛進行交聯(lián)， 10~25°C攪拌交聯(lián)0. 5~a后，棄去上清液，真空抽濾后，獲得固定化細胞；所述腈水解酶 基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示；所述 載體為硅藻土、珍珠巖或活性炭；所述載體與菌懸液中濕菌體重量比為〇. 01~〇. 1 :1 (優(yōu) 選0. 04~0. 09:1);所述緩沖液或蒸餾水體積用量以濕菌體濕重計為5ml/g~15ml/g ;所 述戊二醛以體積濃度25% (v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25% (v/v)戊二醛水溶液 體積用量以濕菌體重量計為〇. 05~0. 5ml/g (優(yōu)選0. lml/g);所述聚乙稀亞胺以體積濃度 5 % (v/v)聚乙烯亞胺水溶液形式加入，所述5 % (v/v)聚乙烯亞胺水溶液體積用量以濕菌 體重量計為0. 01~I. 〇ml/g (優(yōu)選0. 3ml/g)，本發(fā)明所述聚乙稀亞胺分子量70000,聚合度 1600 ；
[0020] (2)加氫反應：取步驟（1)含1-氰基環(huán)己基乙酸的轉化液于加氫反應釜中， 加入加氫催化劑，通入氫氣，于0-300°C、400-1200rpm條件下攪拌反應（優(yōu)選0-300°C、 400-1200rpm條件下攪拌反應4-20h，更優(yōu)選110°C、1000 rpm條件下攪拌反應9h)，反應完 全后將反應液冷卻至30-80°C (優(yōu)選60°C )，放空氫氣，將反應液過濾，獲得濾液和濾餅， 濾餅回收催化劑，濾液冷卻至室溫后加入等體積的二氯甲烷萃?。▋?yōu)選萃取3次），靜置 分層（優(yōu)選于分液漏斗中靜置l_8h，更優(yōu)選5h)，獲得有機相和水相，有機相經(jīng)旋蒸（優(yōu)選 35-60°C，更優(yōu)選40°C )得加巴噴丁內酰胺晶體，加巴噴丁內酰胺晶體進行水解反應生成加 巴噴丁鹽酸鹽，然后加巴噴丁鹽酸鹽進行堿化反應，獲得加巴噴丁，二氯甲烷回收再利用； 水相通過蒸氨法（即于25-150°C，優(yōu)選55°C下旋蒸，收集氨氣，直至母液pH達7. 0左右） 回收氨氣和廢水，而廢水則回收作為反應介質用于步驟（1)中的酶催化反應；所述加氫催 化劑為雷尼鎳。
[0021] 進一步，步驟（2)所述水解反應為：取加巴噴丁內酰胺晶體與0. l-12mol/L的HCl 水溶液混合（優(yōu)選6mol/L)，加熱回流I-IOh (優(yōu)選4h)，回流反應液冷卻至室溫，加入二氯 甲烷萃取，有機相回收未反應的加巴噴丁內酰胺，水相于〇_4°C冷卻結晶，過濾得白色固體， 濾液回收補充HCl后用于加巴噴丁內酰胺水解反應；所得白色固體于丙酮中研磨，過濾，濾 餅于40°C下干燥得加巴噴丁鹽酸鹽，其中二氯甲烷及丙酮通過旋蒸回收再利用，而回收所 得的加巴噴丁內酰胺則繼續(xù)水解；所述加巴噴丁內酰胺晶體用量以HCl水溶液體積計為 15. 3-612. 8g/L，更優(yōu)選 153. 2g/L。
[0022] 進一步，步驟⑵所述堿化反應為：取加巴噴丁鹽酸鹽加入水中，20-60°C (優(yōu)選 40°C )下攪拌溶解，調pH值至L 0-7. 5,加入甲苯，攪拌10-120min (優(yōu)選30min)，于0-4°C 下冷卻結晶，過濾得白色晶體，濾液回收與加巴噴丁鹽酸鹽混合后，繼續(xù)下一次堿化反應， 白色晶體于甲醇或異丙醇中重結晶，得加巴噴??；所述加巴噴丁鹽酸鹽用量以水體積計為 20. 8-1038. 4g/L，更優(yōu)選 726. 9g/L ;所述調 pH 值至 L 0-7. 5 所用試劑為 0· l-12mol/L 的 NaOH水溶液，也可以用其他堿，更優(yōu)選10mol/L的NaOH水溶液；所述甲苯與水體積比為 0· 05-0. 8:1，更優(yōu)選 0· 25:1。
[0023] 進一步，步驟（1)所述酶源用量為1.0~3. 5g/L反應介質（更優(yōu)選2. 2g/L)，所述 底物終濃度為〇· 2-1. 5mol/L(更優(yōu)選0· 5mol/L) 〇
[0024] 進一步，步驟（2)所述加氫催化劑與1-氰基環(huán)己基乙腈的質量比為0.02-0.3:1， 更優(yōu)選0. 1:1。
[0025] 進一步，步驟（2)所述通入氫氣前先通入氮氣置換空氣，（優(yōu)選置換3次），氫氣通 入量為〇. 5-5MPa，更優(yōu)選2MPa。
[0026] 本發(fā)明所述含腈水解酶基因的重組基因工程菌是將Acidovorax facilis ZJB09122腈水解酶突變體基因 F168V(核苷酸序列為SEQ ID N