專利名稱：用于在免疫或酶法測(cè)定中定量被分析物的系統(tǒng)和方法
用于在免疫或酶法測(cè)定中定量被分析物的系統(tǒng)和方法發(fā)明人埃曼努埃爾·姆波克(Emmanuel Mpock)和威爾瑪·曼甘(WilmaMangan)。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于定性或定量測(cè)定流體樣品中一種或多種被分析物的存在的測(cè)試 試劑盒和裝置。
背景技術(shù)：
典型情況下，免疫測(cè)定方法導(dǎo)致信號(hào)標(biāo)記物在結(jié)合在特異性結(jié)合對(duì)成員的復(fù)合物 中的信號(hào)標(biāo)記物與未結(jié)合的信號(hào)標(biāo)記物之間分配。結(jié)合與未結(jié)合信號(hào)標(biāo)記物之間的差異， 可能是結(jié)合與未結(jié)合信號(hào)標(biāo)記物的物理分離或可檢測(cè)信號(hào)在結(jié)合與未結(jié)合信號(hào)標(biāo)記物之 間調(diào)節(jié)的結(jié)果。通過觀察在一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)積累的標(biāo)記物的圖式，并將圖式與樣品中被 分析物的量相關(guān)聯(lián)，來進(jìn)行定量。測(cè)定的結(jié)果通過電磁手段、特別是光投射穿過檢驗(yàn)條來確 定。類似地，在典型的夾心測(cè)定形式中，將樣品與用于被分析物的標(biāo)記的特異性結(jié)合 對(duì)成員混合，并允許其橫越側(cè)向流基質(zhì)，通過位于基質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)捕獲區(qū)。如果樣品中 存在被分析物，標(biāo)記的特異性結(jié)合對(duì)成員將與被分析物結(jié)合，得到的被分析物-標(biāo)記的復(fù) 合物將被運(yùn)送到并通過捕獲區(qū)。被分析物與標(biāo)記的特異性結(jié)合對(duì)成員之間復(fù)合物形成的程 度，與樣品中存在的被分析物的量直接成比例。在每個(gè)捕獲區(qū)上固定化有能夠結(jié)合被分析 物-標(biāo)記復(fù)合物的第二特異性結(jié)合對(duì)成員。該第二特異性結(jié)合對(duì)成員不能結(jié)合標(biāo)記的特異 性結(jié)合對(duì)成員，除非后者與被分析物結(jié)合。因此，積累在捕獲區(qū)上的標(biāo)記的特異性結(jié)合對(duì)成 員的量，與樣品中存在的被分析物的量直接成比例。典型的側(cè)向流裝置是硝酸纖維素條。將樣品施加到施用區(qū)，所述樣品從那里通過 毛細(xì)作用流過含有對(duì)被分析物特異的可視標(biāo)記的抗體的區(qū)域。游離和結(jié)合的標(biāo)記物繼續(xù)遷 移到捕獲區(qū)，固定化的特異性針對(duì)被分析物的抗體在捕獲區(qū)與被分析物_標(biāo)記物復(fù)合物相 結(jié)合。游離的標(biāo)記物(未結(jié)合抗體)繼續(xù)遷移，在捕獲區(qū)中留下被分析物特異性信號(hào)。被 分析物-標(biāo)記物復(fù)合物的捕獲由固定化的試劑介導(dǎo)，該試劑典型為特異性針對(duì)被分析物的 抗體。例如，EP653625公開了側(cè)向流測(cè)定檢驗(yàn)條，在檢驗(yàn)條上特定標(biāo)記物的結(jié)合程度使 用測(cè)定讀取器光學(xué)測(cè)定。美國(guó)專利No. 7，239，394公開了用于檢測(cè)標(biāo)記的被分析物/試劑 復(fù)合物與固定化在側(cè)向流測(cè)定棒檢測(cè)區(qū)中的特異性結(jié)合試劑的結(jié)合的讀取器，在側(cè)向流測(cè) 定棒上讀取器檢測(cè)積累在檢測(cè)區(qū)中的標(biāo)記物的信號(hào)。國(guó)際專利申請(qǐng)公開W000/20866公開了用于測(cè)定被分析物的裝置，包含標(biāo)記物能 夠在其中與被分析物結(jié)合的標(biāo)記區(qū)，與捕獲區(qū)連通，其中捕獲區(qū)的孔徑使得沒有與被分析 物結(jié)合的標(biāo)記物能夠遷移過去，而與被分析物結(jié)合的標(biāo)記物不能。因此，在從標(biāo)記區(qū)向捕獲 區(qū)的遷移過程中，未結(jié)合的標(biāo)記物能夠進(jìn)入并通過捕獲區(qū)，而結(jié)合的標(biāo)記物將被捕獲在標(biāo) 記區(qū)與捕獲區(qū)的接合處。因此，該公開物公開了使用減小的孔徑用于條上的固定化而不是使用常規(guī)的免疫捕獲技術(shù)。這些方法要求將被檢測(cè)的標(biāo)記物固定化在檢測(cè)區(qū)中。這并不總是方便的，并增加 了測(cè)定系統(tǒng)的復(fù)雜性。因此，對(duì)于不使用固定化區(qū)域來檢測(cè)標(biāo)記的復(fù)合物，存在著需求。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了不需捕獲區(qū)進(jìn)行測(cè)定的裝置和方法。本發(fā)明的方法和裝置比傳統(tǒng)方 法更加耐用和可靠；減少了測(cè)定時(shí)間；增加了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；為使用微量被分析物濃度進(jìn) 行定量測(cè)定提供了更好的控制；并改進(jìn)了可制造性，具有最小的批次間差異。本發(fā)明的方法和裝置提供了被分析物與用于被分析物的標(biāo)記的特異性結(jié)合對(duì)成 員的混合，以提供均質(zhì)的溶液?？梢允褂纱双@得的均質(zhì)溶液以恒定的流速流過讀取點(diǎn)。結(jié) 合的被分析物/標(biāo)記物復(fù)合物可以使用比色計(jì)、電學(xué)手段或本技術(shù)領(lǐng)域已知的其他方法來 檢測(cè)。在參考了下面的詳細(xì)描述之后，本發(fā)明的這些以及其他方面將變得明顯。此外，在 本文中提出了多個(gè)參考文獻(xiàn)，它們更詳細(xì)地描述了某些步驟或組成，因此以其全文引為參考。


圖1顯示了本發(fā)明的一次性條的透視圖。圖2顯示了不使用捕獲區(qū)的微粒的檢測(cè)。圖2A顯示了使用Avie Alc計(jì)量器X7 作為檢測(cè)器測(cè)量的作為時(shí)間函數(shù)的信號(hào)的圖。圖2B顯示了使用Avie Alc計(jì)量器X8作為 檢測(cè)器測(cè)量的作為時(shí)間函數(shù)的信號(hào)的圖。圖2C顯示了使用Avie Alc計(jì)量器X9作為檢測(cè) 器測(cè)量的作為時(shí)間函數(shù)的信號(hào)的圖。詳細(xì)描述本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)，無(wú)論是見上文還是見下文，在此都以其 全文引為參考。除非另有說明，否則在本申請(qǐng)包括說明書和權(quán)利要求書中使用的下列術(shù)語(yǔ)，都具 有下面給出的定義。必須指出，說明書和隨附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式包括了復(fù)數(shù) 指稱物，除非上下文明確表明不是這樣。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”包含哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括 但不限于哺乳綱的任何成員人類，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物例如黑猩猩，以及其他猿和猴物種；農(nóng) 場(chǎng)動(dòng)物例如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家養(yǎng)動(dòng)物例如兔、狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物，例 如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳動(dòng)物的例子包括但不限于禽類、魚等。該術(shù)語(yǔ)不指稱具體的 年齡或性別。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括但不限于基本上由免疫球蛋白基因或多個(gè)免疫球 蛋白基因或其片段編碼的、特異性結(jié)合和識(shí)別被分析物(抗原)的多肽。“抗體”也包括但 不限于基本上由免疫球蛋白基因或多個(gè)免疫球蛋白基因或其片段編碼的、特異性結(jié)合和識(shí) 別由宿主對(duì)暴露于毛滴蟲抗原做出響應(yīng)所產(chǎn)生的抗體的抗原特異性結(jié)合區(qū)(獨(dú)特型)的多 肽。例子包括多克隆、單克隆、嵌合、人源化和單鏈抗體等。免疫球蛋白片段包括Fab片段 和由表達(dá)文庫(kù)、包括噬菌體展示所產(chǎn)生的片段。對(duì)于抗體的結(jié)構(gòu)和術(shù)語(yǔ)，參見例如Paul的 《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(第三版)(Fundamental Immunology, 3rdEd.), 1993, Raven Press, NewYork0
術(shù)語(yǔ)“與…特異性結(jié)合”或“與…發(fā)生特異性免疫反應(yīng)”是指在存在蛋白和其他生 物物質(zhì)的異源群的情況下，對(duì)靶被分析物的存在具有鑒別性的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定測(cè)定 條件下，特異性結(jié)合部分優(yōu)選與特定靶被分析物結(jié)合，并且不以顯著的量與測(cè)試樣品中存 在的其他成分結(jié)合。在這樣的條件下與靶被分析物的特異性結(jié)合，可能需要選擇對(duì)特定靶 被分析物具有特異性的結(jié)合部分?？梢允褂枚喾N免疫測(cè)定形式來選擇與特定抗原發(fā)生特異 性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測(cè)定方法通常被用于選擇與被分析物發(fā)生特異 性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。對(duì)于可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件的描 述，參見 Harlow 和 Lane (1988)的《抗體實(shí)驗(yàn)指南》(Antibodies，A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Publications, New York。典型情況下，特異性或選擇性反應(yīng)將提供 至少兩倍于背景、更典型比背景高10到100倍以上的信噪比。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”和“可檢測(cè)標(biāo)記物”是指能夠檢測(cè)的分子，包括但不限 于放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、發(fā)色團(tuán)、酶、酶的底物、酶的輔助因子、酶的抑制劑、 發(fā)色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(例如生物素、親和素、鏈親和素或半抗原)等。本文中使用的“固相支持物”是指固相表面例如塑料板、磁珠、乳膠珠、微滴定板的 孔、玻璃板、尼龍、瓊脂糖、丙烯酰胺等。在指稱兩種分子或一種分子與分子復(fù)合物的結(jié)合時(shí)，“特異的”是指一種對(duì)另一種 的特異性識(shí)別以及穩(wěn)定復(fù)合物的形成，與此相比對(duì)其他分子的識(shí)別明顯較低，并缺少與這 些其他分子的穩(wěn)定復(fù)合物的形成。特異性結(jié)合的例子是抗體_抗原相互作用、酶-底物相 互作用、多核苷酸雜交和/或雙鏈體形成、細(xì)胞受體_配體相互作用，等等。II.概述本發(fā)明提供了用于測(cè)定被分析物的方法和裝置。方法包括含有用于被分析物的標(biāo) 記物的容器。將被分析物與標(biāo)記物混合以提供均質(zhì)溶液?？梢匀芜x地使均質(zhì)溶液流過濾器， 在濾器中不想要的物質(zhì)可以被部分或完全除去。均質(zhì)溶液或?yàn)V液可以受控的流速計(jì)量流過 讀取區(qū)，并檢測(cè)顆粒。本發(fā)明的方法和裝置不需要使用捕獲區(qū)。因此，本發(fā)明的方法和裝置具有下述優(yōu) 點(diǎn)比傳統(tǒng)方法更加耐用和可靠；減少了測(cè)定時(shí)間；增加了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；為使用微量被分 析物濃度進(jìn)行定量測(cè)定提供了更好的控制；以及改進(jìn)了可制造性，具有最小的批次間差異。 本發(fā)明的方法可以與使用離子或共價(jià)柱的液相色譜一起使用，可以與磁珠一起使用，可以 與根據(jù)孔徑排除顆粒物的膜一起使用，或與跨過濾器的電極化場(chǎng)等一起使用。III.微機(jī)械系統(tǒng)使用微機(jī)械系統(tǒng)對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行了說明，盡管在本發(fā)明的實(shí)施中可以使用任 何其他用于檢測(cè)被分析物的分析方法。例如，在本發(fā)明的方法的實(shí)施中，可以使用在共同 待決和共同擁有的題為“用于執(zhí)行測(cè)定的微機(jī)械方法和系統(tǒng)”(Micro Mechanical Methods and Systemsfor Performing Assays)的美國(guó)專利申請(qǐng) No. 10/976，651 中公開的微機(jī)械 系統(tǒng)，或在共同待決或共同擁有的題為“用于測(cè)量血液凝集的方法和裝置”(Methods And Apparatus For Measuring Blood Coagulation)的美國(guó)臨時(shí)專禾Ij 申請(qǐng) No. 60/945，290 中 公開的微機(jī)械系統(tǒng)。示例性的微機(jī)械系統(tǒng)顯示在圖1中。微機(jī)械系統(tǒng)可以通過將兩個(gè)或多 個(gè)固相支持物連接在一起而制成，其中在至少一個(gè)支持物中存在溝槽。固相支持物可以是 矩形、圓形、橢圓形或任何形狀。支持物可以由合適的材料制成，所述材料根據(jù)其性質(zhì)進(jìn)行
5選擇，例如良好的導(dǎo)熱性、對(duì)光透射的澄明度、易于焊接的機(jī)械性質(zhì)、允許均勻涂層和試劑 穩(wěn)定的表面性質(zhì)，以及防止干擾測(cè)定的對(duì)液體介質(zhì)的中性。為此目的，適合的塑料包括具 有高自由表面能和低吸水率的塑料，包括PETG、聚酯(Mylar )、聚碳酸酯(Lexan )、聚 氯乙烯、聚苯乙烯、SAN、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、特別是由Borg Warner以商品名 Cycolac供應(yīng)的ABS，等等。當(dāng)固相支持物是疏水塑料時(shí)，它可以用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法 進(jìn)行處理以賦予表面親水性，例如通過等離子體蝕刻或通過電暈處理?？商孢x地和等價(jià)地， 在本發(fā)明的實(shí)施中可以使用可商購(gòu)的模制固相支持物。出于說明的目的，參考通過將兩個(gè)固相支持物相連而形成的微機(jī)械系統(tǒng)10，對(duì)本 發(fā)明的該實(shí)施方案進(jìn)行描述。至少一個(gè)固相支持物具有用作樣品室20的溝槽或空腔，反應(yīng) 室30和毛細(xì)管路40和50。溝槽可以具有任何幾何形狀，優(yōu)選為圓形或矩形。溝槽的維度 使其具有足夠的體積容納樣品并允許反應(yīng)發(fā)生。因此，取決于支持材料的長(zhǎng)度和寬度，圓形 溝槽可以具有大約0.01mm到大約IOOmm之間的直徑，取決于支持材料的厚度，可以具有大 約0. OOlmm到大約4mm的高度。溝槽的直徑和高度可以由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員容易地確 定。在本發(fā)明的一個(gè)方面，一個(gè)或多個(gè)孔可以安置在一個(gè)或多個(gè)支持物上，在那里允許孔通 向樣品室20所在的位置，樣品可以放置在該樣品室20中。在將兩個(gè)部件連接之前，可以將 可移動(dòng)元件60放置在所需反應(yīng)室30中?？梢苿?dòng)元件60可以使用不銹鋼或不銹鋼與任何其他所需材料的組合來制造，以 便它能夠被外部磁動(dòng)裝置吸引并驅(qū)動(dòng)。材料可以是任何形式的可磁化合金，帶有不銹覆蓋 層以防止腐蝕，或進(jìn)行了特殊涂覆用于結(jié)合特定分子?？梢苿?dòng)元件的厚度取決于反應(yīng)室的 高度。它必須足夠小，以便與反應(yīng)室匹配并自由移動(dòng)。對(duì)于高度為0.010英寸的反應(yīng)室空 腔來說，可移動(dòng)元件的厚度可以在大約0. 007到大約0. 008英寸之間。在本發(fā)明的一個(gè)方面，微機(jī)械系統(tǒng)10可以放置在加熱器組件頂部，加熱器組件可 以容納包埋在其中或緊鄰的傳感器(發(fā)射器或檢測(cè)器)，但傳感器的排列使得信號(hào)通過檢 測(cè)區(qū)70。應(yīng)該理解，取決于使用的檢測(cè)機(jī)制，反射束排列、檢測(cè)器和發(fā)射器可以在檢驗(yàn)條的 同一側(cè)。檢測(cè)機(jī)制不限于光學(xué)檢測(cè)方法，而是也可以使用其他方法例如電、放射性和其他方 法。供本發(fā)明的裝置和相關(guān)方法使用的用于自動(dòng)檢測(cè)的檢測(cè)系統(tǒng)的例子，包含激發(fā) 源、單色器(或任何能夠?qū)饨M分進(jìn)行光譜解析的裝置，或一組窄帶濾光器)以及檢測(cè)器陣 列。激發(fā)源可以包含紅外、藍(lán)光或紫外波長(zhǎng)，激發(fā)波長(zhǎng)可以短于待檢測(cè)的發(fā)射波長(zhǎng)。檢測(cè)系 統(tǒng)可以是寬帶UV光源，例如前方帶有濾光器的氘燈；白色光源例如氙燈或氘燈在通過單 色器以提取出所需波長(zhǎng)后的輸出；或多種連續(xù)波(CW)氣體激光的任一種，包括但不限于任 何氬離子激光器譜線(457、488、514nm等)或HeCd激光器；藍(lán)光固態(tài)二極管激光器例如基 于GaN和GaAs (雙重)的激光器或基于YAG或YLF的激光器的雙重或三重輸出；或任何輸 出藍(lán)光的脈沖式激光器。來自反應(yīng)孔中的樣品或反應(yīng)物的發(fā)射光，可以用提供底物的光譜信息的裝置例如 光柵分光計(jì)、棱鏡分光計(jì)、成像分光計(jì)等，或使用干涉(帶通)濾光器進(jìn)行檢測(cè)。使用二維 區(qū)域成像儀例如CCD相機(jī)，可以對(duì)許多物體同時(shí)成像。可以經(jīng)不同的帶通、長(zhǎng)通或短通濾光 器(干涉濾光器或可電調(diào)諧的濾光器是適合的)收集一張以上的圖像來產(chǎn)生光譜信息?？?以使用一個(gè)以上的成像儀通過專用濾光器同時(shí)收集數(shù)據(jù)，或者可以改變單個(gè)成像儀前面的濾光器?；诔上竦南到y(tǒng)例如Biometric成像系統(tǒng)，對(duì)表面進(jìn)行掃描以發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)。因此，本發(fā)明的方法包含將樣品與試劑在反應(yīng)室30中混合?；旌峡梢允褂每梢苿?dòng) 元件60和外部磁源來進(jìn)行。試劑可以是例如固定化在顆粒上的抗體或凝固劑。適合用于 與抗體偶聯(lián)的顆粒物包括例如乳膠珠、包被有乳膠的桿狀體、含有染料的顆粒、膠體顆粒、 金屬顆粒、微粒和納米粒、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物以及磁珠。在本發(fā)明的一個(gè)方面，顆 粒物是乳膠珠。乳膠珠典型地具有大約50到大約500納米、優(yōu)選為大約100到大約350納 米的平均直徑。磁珠的平均直徑為大約50到大約350納米，優(yōu)選為大約100到大約300納 米?；旌蟽?yōu)選持續(xù)到獲得均質(zhì)溶液。因此，混合可以從大約5秒到大約5分鐘，優(yōu)選為大約 10秒到大約4分鐘，更優(yōu)選為大約20秒到大約150秒。正如專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到的， 混合時(shí)間將取決于目標(biāo)被分析物和試劑，時(shí)間可以很容易地確定。均勻混合的溶液可以任選被過濾。因此，在本發(fā)明的可替選方面，微機(jī)械系統(tǒng)包括 與反應(yīng)室30和檢測(cè)區(qū)70流體連通的濾器80。可以使均勻混合的樣品流過濾器80或施加 到其上。濾器80可以接收流體樣品，并可以允許它流入檢測(cè)區(qū)70。濾器80也可以用于移 除可能干擾測(cè)定的較大顆粒。濾器80可以包含任何適合的材料例如網(wǎng)紗、纖維素、乙酸纖 維素、其他聚酯和其他有孔膜。此外，濾器可以捕集未結(jié)合抗體、凝固劑等。微機(jī)械裝置10可以具有檢測(cè)區(qū)70(圖1)，可以在其中檢測(cè)結(jié)合的被分析物的量。 可以使任選被過濾的均質(zhì)溶液以恒定的流速流過檢測(cè)區(qū)70，可以在檢測(cè)區(qū)70中檢測(cè)與抗 原結(jié)合的反應(yīng)物。典型情況下，被分析物與固定化在顆粒上的標(biāo)記物的結(jié)合將提供溶液中的顆粒。 因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，在檢測(cè)區(qū)70中的檢測(cè)使用顆粒計(jì)數(shù)器。在本文中使用的術(shù)語(yǔ) “顆粒計(jì)數(shù)器”是指包含傳感器、并能夠用于對(duì)液體中的顆粒計(jì)數(shù)并任選地確定顆粒尺寸的 裝置。傳感器可以是光源，并包含對(duì)于收集顆粒所反射的光來說可能必需的反射鏡、透鏡、 光檢測(cè)器等。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以對(duì)整個(gè)樣品中顆粒的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，例如，可以 使均勻混合的溶液的整個(gè)體積流過檢測(cè)區(qū)，并對(duì)顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。在另一個(gè)方面，只使用了流 過檢測(cè)區(qū)的一部分均勻混合的溶液進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)，然后可以通過已知方法推斷樣品中的顆 粒數(shù)量。用于推斷顆粒數(shù)量的手段包括例如顆粒濃度對(duì)計(jì)量讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 等。因此，可以使用運(yùn)送過檢測(cè)區(qū)裝置的5%或以下的樣品、優(yōu)選運(yùn)送過檢測(cè)區(qū)的大約90% 或以上的樣品、或運(yùn)送過檢測(cè)區(qū)的大約10%、20%、30%、50%或其他百分率的樣品進(jìn)行測(cè) 量。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于測(cè)量血液凝固時(shí)間的方法和微流體裝置。血樣 可以通過傳統(tǒng)手段例如靜脈穿刺或手指扎刺從患者獲得。樣品可以放置在樣品室20中。在 本發(fā)明的一個(gè)方面，從患者獲得的血液樣品可以不用附加操作即用于本發(fā)明的方法和裝置 中?；蛘撸瑥幕颊攉@得的血液樣品可以被處理，以完全或部分除去紅細(xì)胞。紅細(xì)胞可以通過 任何已知方法，例如離心、將樣品與紅細(xì)胞凝集素反應(yīng)、或通過使用紅細(xì)胞濾器除去。在執(zhí) 行方法中使用血漿，通過例如允許成像系統(tǒng)更好地監(jiān)測(cè)在血液中發(fā)生的物理變化、例如纖 維蛋白原物理聚合成纖維蛋白，可以提供更好的準(zhǔn)確性和精確性。在圖1中顯示的微流體裝置中，反應(yīng)室30可以具有包被有一種或多種凝固劑例如 組織因子或其他凝固劑的乳膠珠。將一滴血液或等價(jià)物放置在樣品室20中。任選地，可以將稀釋劑放入儲(chǔ)液器90中，由此血樣與稀釋劑的混合可以任選地提供稀釋的血樣。稀釋 劑可以簡(jiǎn)單地是水性溶液，或者它可以是非水性溶液，并任選地可以包含多種添加劑，例如 鹽、蛋白、糖、糖類、金屬離子例如鈣、鎂、鑭系元素等。某些稀釋劑的制劑可以包括含有明膠 的成分和乳液。典型情況下，稀釋劑是緩沖溶液，例如檸檬酸鹽緩沖液。然后可以將血樣與凝固劑在反應(yīng)室30中相接觸，凝固劑和血液可以使用可移動(dòng) 元件60進(jìn)行混合，以提供均質(zhì)溶液。本發(fā)明的凝固測(cè)定包括凝血酶原時(shí)間(PT)、部分促凝 血酶原激酶時(shí)間(PTT)、活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)、凝血酶凝固時(shí)間(TCT)、 纖維蛋白原、肝素管理檢驗(yàn)(HMT)、魚精蛋白響應(yīng)時(shí)間(PRT)、肝素響應(yīng)時(shí)間(HRT)、低分子 量肝素(LMWH)、低范圍肝素管理檢驗(yàn)(LHMT)和蛇靜脈酶(ecarin)凝固時(shí)間(ECT)，其中用 于每種這些測(cè)試的試劑如本技術(shù)領(lǐng)域中所描述。用于一種或多種測(cè)定方法的試劑可以放置 在反應(yīng)室30中，其中凝固劑優(yōu)選固定在乳膠珠上。通過將血液和凝固劑混合而獲得的均質(zhì)溶液可以被過濾，并將如此獲得的溶液以 恒定的流速計(jì)量通過檢測(cè)區(qū)70。血液凝固的量可以通過檢測(cè)液體樣品在與血液凝固試劑接 觸后發(fā)生的物理變化的程度來測(cè)量。物理變化可以是任何變化，例如濁度(包括吸光度)、 黏度、介電常數(shù)等。優(yōu)選情況下，物理變化通過光學(xué)測(cè)量檢測(cè)波的運(yùn)動(dòng)或通過濁度(或吸光 度)來檢測(cè)。除了光學(xué)方法之外的其他方法可用于檢測(cè)凝固的血樣。例如，液體樣品的濁度 (或吸光度)可以通過光學(xué)方法容易地監(jiān)測(cè)，濁度變化程度的檢測(cè)可以使用可商購(gòu)裝置容 易地進(jìn)行，所述可商購(gòu)裝置例如為STAT IMUNO SYSTEM Quick Turbo II (由A&T Corp.制 造)、自動(dòng)化分析儀多化學(xué)單元(Multiple Chemistry Unit) 502X(由A&T Corp.制造)、自 動(dòng)化分析儀Automatic Analyzer 7070 (由日立公司(HitachiLtd.)制造)等。例如，濁度測(cè)量可以使用自動(dòng)化分析儀多化學(xué)單元(MultipleChemistry Unit) 502X來進(jìn)行，其中可以選擇340到795nm之間的兩種波長(zhǎng)作為用于測(cè)量的波長(zhǎng)。通過 在數(shù)秒內(nèi)進(jìn)行的間歇測(cè)量，可以同時(shí)測(cè)量所選的兩種波長(zhǎng)。
實(shí)施例下面是用于執(zhí)行本發(fā)明的具體實(shí)施方案的例子。提供的例子僅用于說明的目的， 不打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)進(jìn)行了努力以確保使用的數(shù)字(例如量、溫度 等)的準(zhǔn)確性，但是某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差當(dāng)然將是允許的。實(shí)施例1下面的實(shí)施例顯示了使用在檢測(cè)區(qū)之前缺少捕獲區(qū)的側(cè)向流免疫條構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲 線。為了構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將固定化在微粒(MP)上的Alc抗原特異性抗體與稀釋劑混合，直 到獲得均質(zhì)混合物。然后允許該混合物芯吸(wick up)到側(cè)向流免疫檢驗(yàn)條上并通過過濾區(qū)。過濾區(qū) 是用于過濾樣品的膜，由此當(dāng)樣品混合物芯吸到檢驗(yàn)條上時(shí)檢測(cè)未捕獲的MP偶聯(lián)物。顆粒 的檢測(cè)使用可以從MECDynamics (Sunnyvale, CA)獲得的Avie計(jì)量器X7進(jìn)行，使用固定在 微粒上的已知濃度的Alc抗原特異性抗體的結(jié)果顯示在下表1中。表 1Avie 計(jì)量器 X7
8
標(biāo)準(zhǔn)曲線使用已知濃度的顆粒產(chǎn)生。對(duì)于每種顆粒濃度，使用都可以從MEC Dynamics獲得的計(jì)量器X7、X8或X9獲取三個(gè)讀數(shù)。獲得的數(shù)據(jù)分別顯示在表2、3和4中。表 2
表3 表 4
使用上述方法和Avie計(jì)量器X7、X8和X9獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示在圖2中。實(shí)施例2使用固定在微粒(MP)上的Alc抗原特異性抗體重復(fù)了實(shí)施例1的步驟，所述微粒 與來自患者的血樣混合，直到獲得均質(zhì)混合物。然后允許該混合物芯吸在側(cè)向流免疫條上 并通過過濾區(qū)。過濾區(qū)是用于過濾樣品的膜，由此當(dāng)樣品混合物芯吸到條上時(shí)檢測(cè)未捕獲 的MP偶聯(lián)物。顆粒的檢測(cè)使用Avie計(jì)量器X7進(jìn)行。然后將來自計(jì)量器的讀數(shù)使用在圖 2顯示的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，以估算血樣中Alc的濃度。盡管已經(jīng)參考優(yōu)選實(shí)施方案和各種不同可替選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體的 顯示和描述，但相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會(huì)理解，可以在其中對(duì)形式和詳細(xì)情況進(jìn)行各 種不同的改變，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。所有在本申請(qǐng)中引用的出版的專利和出版 物，在此以其全文引入本文作為參考。
權(quán)利要求
用于檢測(cè)樣品中的被分析物的方法，所述方法包括將含有被分析物的樣品與反應(yīng)物混合，其中獲得了均質(zhì)溶液；以及將均質(zhì)溶液流過檢測(cè)區(qū)，并檢測(cè)溶液中的顆粒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)物與顆粒偶聯(lián)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中顆粒是乳膠珠、包被有乳膠的桿狀體、膠體顆粒、金屬顆粒、 微粒、納米粒、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物或磁珠。
4.權(quán)利要求2的方法，其中反應(yīng)物包含抗體或凝固劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中抗體是HbAlc特異性抗體。
6.權(quán)利要求4的方法，其中凝固劑用于測(cè)定，所述測(cè)定選自測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)、部 分促凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)、活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)、凝血酶凝固時(shí)間 (TCT)、纖維蛋白原、肝素管理檢驗(yàn)(HMT)、魚精蛋白響應(yīng)時(shí)間(PRT)、肝素響應(yīng)時(shí)間(HRT)、 低分子量肝素(LMWH)、低范圍肝素管理檢驗(yàn)(LHMT)、蛇靜脈酶凝固時(shí)間(ECT)及其組合。
7.權(quán)利要求5的方法，其中測(cè)定是測(cè)定PT。
8.權(quán)利要求5的方法，其中測(cè)定是測(cè)定APTT。
9.權(quán)利要求1的方法，還包括在檢測(cè)前將均質(zhì)溶液流過濾器。
10.權(quán)利要求9的方法，其中濾器包含網(wǎng)紗、纖維素、乙酸纖維素、有孔膜或能夠除去不 與被分析物結(jié)合的反應(yīng)物的固定化部分。
11.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)使用顆粒計(jì)數(shù)器進(jìn)行。
12.權(quán)利要求11的方法，其中檢測(cè)通過UV、IR或其組合進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于執(zhí)行測(cè)定、以確定樣品中被分析物的存在和/或?qū)ζ溥M(jìn)行定量的裝置和方法。將被分析物與優(yōu)選固定化在顆粒上的標(biāo)記物混合，以提供均質(zhì)溶液。任選地，可以使均質(zhì)溶液流過濾器。均質(zhì)溶液或?yàn)V液可以受控的流速計(jì)量流過讀取區(qū)，可以檢測(cè)標(biāo)記物的存在或顆粒的存在。本發(fā)明的方法和裝置不需要使用捕獲區(qū)。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101918835SQ200880124227
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日
發(fā)明者埃曼努埃爾·C·姆波克, 威爾瑪·曼甘 申請(qǐng)人:Mec戴內(nèi)米克公司