專(zhuān)利名稱(chēng)：酶聯(lián)免疫測(cè)定增敏劑和一步測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測(cè)增敏劑，尤其是使用該增敏劑進(jìn)行酶聯(lián)免疫一步法測(cè)定。
現(xiàn)有酶聯(lián)免疫檢測(cè)多采用“二步法”，該技術(shù)是由EngvallPerlmann和Weemene等人1966年創(chuàng)建的，已沿用20多年，經(jīng)不斷改進(jìn)和完善后應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域。酶聯(lián)免疫(EnzgmeImmunAssag-EIA)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理是特異性的抗原或抗體在一定條件下能結(jié)合到固相載體的表面，并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶連接所形成的結(jié)合物仍然能保持其特異性的免疫反應(yīng)和酶的活性，結(jié)合物和相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合后，可根據(jù)加入酶底物溶液的顏色反應(yīng)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，且顏色反應(yīng)的深淺與樣品中相應(yīng)抗體或抗原的量成比例關(guān)系，反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)

圖1。這是一種既特異又敏感的疾病診斷方法，具有安全、穩(wěn)定、易觀察等特點(diǎn)，但現(xiàn)有的測(cè)定技術(shù)操作繁瑣，每次測(cè)定需3～5個(gè)小時(shí)，且敏感性不理想，滿足不了及時(shí)診斷的要求。
本發(fā)明的目的在于提供一種酶聯(lián)免疫測(cè)定增敏劑以及使用該增敏劑的酶聯(lián)免疫一步測(cè)定法，以縮短測(cè)定時(shí)間，提高敏感性和準(zhǔn)確性，簡(jiǎn)化操作過(guò)程。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案是在酶聯(lián)免疫檢測(cè)中采用一種增敏劑，該增敏劑由葡聚糖、丙三醇和明膠配制而成，其中所用葡聚糖可為葡聚糖5000，配入量為53～32%，丙三醇和明膠的配入量分別為25～41%和22～28%;酶聯(lián)免疫一步測(cè)定法是在固相載體表面同時(shí)加入液相抗原、液相酶標(biāo)記抗體，特異性抗體和上述增敏劑，增敏劑濃度為0.5～4%，并在35～39℃之間溫育10分鐘，之后洗滌過(guò)剩的酶標(biāo)記物和痕量抗原，一次性生成固相抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體(Ab-Ag-Ab-E)復(fù)合物，然后再加入酶底物顯色。其反應(yīng)機(jī)理是該增敏劑在反應(yīng)過(guò)程中使用液相酶標(biāo)抗體與液相抗原優(yōu)先結(jié)合生成Ag-Ab-E復(fù)合物Ag+Ab ()/() Ab+Ag K＝(AgAb)/(Ag)(Ab)平衡常數(shù)變大，隨著分子量的增大，在引力的作用下，加速了Ag-Ab-E向固相表面運(yùn)動(dòng)，分子間引力F＝Q+Q-/ad2，分子增大，電荷量也增大，這樣作用力也增大，加速了固相抗體與液相Ag-Ab-E反應(yīng)速度，從而使整個(gè)反應(yīng)過(guò)程加速，增敏劑在上述反應(yīng)過(guò)程中還具有親水性增強(qiáng)的特點(diǎn)，因?yàn)槊庖咔虻鞍讓儆谑杷詢(xún)?yōu)球蛋白類(lèi)，純化后高濃度時(shí)為微混溶液，當(dāng)用本發(fā)明提供的增敏劑后，由于IgG分子空間結(jié)構(gòu)和分子肽鏈發(fā)生了變化，易溶于水，且為清亮溶液，溶解度增加，從而有利于反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)采用本發(fā)明后不發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，使酶標(biāo)抗體具有單質(zhì)點(diǎn)的特性，它與特異性抗原的結(jié)合是一對(duì)一，或是1個(gè)抗原分子結(jié)合2～10個(gè)酶標(biāo)記抗體，具備抗體過(guò)剩免疫反應(yīng)特點(diǎn)，故使靈敏度明顯提高。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果由于在本發(fā)明中采用了增敏劑，故加速了酶聯(lián)免疫反應(yīng)過(guò)程，使兩步法需要3～5小時(shí)才能完成的測(cè)定過(guò)程縮短到僅要20分鐘就可完成的一步法，敏感性較兩步法提高了5～10倍，且加樣微量，檢測(cè)敏、準(zhǔn)、快、簡(jiǎn)，應(yīng)用該增敏劑可生產(chǎn)出酶聯(lián)免疫診斷試劑的換代新產(chǎn)品，為臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷提供了一種更新更準(zhǔn)確的手段和方法。
圖1為現(xiàn)有技術(shù)中固相雙抗體“夾心酶聯(lián)免疫兩步法示意圖”;
圖2為本發(fā)明的固相雙抗體“夾心酶聯(lián)免疫一步法示意圖”;
圖3為抗體過(guò)剩反應(yīng)。
實(shí)施例1取53%的葡聚糖5000，丙三醇25%，使它們?nèi)芙庠谡袅羲?，加溫?7℃，加入22%的明膠混合后即成混合溶液。在該溶液中加入賴(lài)根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗體，即成酶稀釋液，待用。
實(shí)施例2取32%的葡聚糖5000，和25%的丙三醇，溶解在蒸餾水中后，加溫至37℃，加入28%的明膠混合后即成混合液，以下步驟同實(shí)施例1。
實(shí)施例3在固相載體表面同時(shí)加入液相抗原，液相酶標(biāo)記抗體，特異性抗體或抗原以及濃度為0.5%的增敏劑，置37℃溫育反應(yīng)10分鐘，洗滌過(guò)剩的酶標(biāo)記物和痕量抗原，得到一次性生成的固相抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體(Ab-Ag-Ab-E)復(fù)合物，然后加入酶底物顯色，10分鐘后取出，用酶標(biāo)分析儀進(jìn)行分析計(jì)算即可得到測(cè)定結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種用一步法測(cè)定酶聯(lián)免疫的增敏劑，其特征在于它由葡聚糖、丙三醇和明膠配制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增敏劑，其特征在于所用的葡聚糖可為葡聚糖5000，且配入量為53～32%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增敏劑，其特征在于所用丙三醇和明膠的配入量為25～40%和22～28%。
4.一種酶聯(lián)免疫一步測(cè)定法，其特征在于在固相載體表面同時(shí)加入液相抗原、液相酶標(biāo)記抗體、特異性抗體和增敏劑，一次性生成固相抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定法，其特征在于所述增敏劑由葡聚糖、丙三醇、明膠配制。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定法，其特征在于反應(yīng)溫度為35°～39℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的測(cè)定法，其特征在于所用增敏劑的濃度為0.5～4%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種酶聯(lián)免疫測(cè)定增敏劑和一步測(cè)定法。酶聯(lián)免疫測(cè)定用增敏劑主要由葡聚糖、丙三醇和明膠按一定比例配制而成，測(cè)定時(shí)將液相抗原、液相酶標(biāo)記抗體、特異性抗體和上述增敏劑同時(shí)加在固相載體表面，可一次性生成固相抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，由于本發(fā)明采用了增敏劑，故加速了酶聯(lián)免疫反應(yīng)過(guò)程，僅用20分鐘即可完成酶免檢測(cè)，且加樣微量，檢測(cè)敏，準(zhǔn)、快、簡(jiǎn)，為臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷提供了一種最新最快最準(zhǔn)確的手段和方法。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1077030SQ9210231
公開(kāi)日1993年10月6日 申請(qǐng)日期1992年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月3日
發(fā)明者嚴(yán)家定, 彭長(zhǎng)福 申請(qǐng)人:羅志德