高分子量普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株及利用該菌株生產(chǎn)高分子量普魯蘭多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高分子量普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株及利用該菌株生產(chǎn)高分子量普魯蘭多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]普魯蘭多糖(Pullulan)，又稱短梗霉多糖、茁霉多糖，是由出芽短梗霉(.Aureobacidium pu 11 u 1 an s') %泌^]一類水溶性胞外中性多糖。該多糖是以α-1，6-糖苷鍵連接的聚麥芽三糖(含有少量麥芽四糖)，一般沒有分支結(jié)構(gòu)，是直鏈多糖。普魯蘭多糖獨(dú)特的糖苷鍵連接方式使得它具有高度的結(jié)構(gòu)柔韌性及良好的水溶性，因而擁有其它多糖所沒有的、獨(dú)特的、優(yōu)異的物理特性，包括良好的粘結(jié)性能、成纖維性、成膜性和可塑性。同時(shí)，普魯蘭多糖易進(jìn)行化學(xué)改性以改變其水溶性或提供活性反應(yīng)基團(tuán)。因此，普魯蘭多糖及其衍生物被廣泛地用于食品、醫(yī)藥、化工及電子等眾多領(lǐng)域，是一種有極大開發(fā)價(jià)值和前景的多功能新型生物制品。
[0003]目前，普魯蘭多糖主要的應(yīng)用是作為食品添加劑、膠囊材料及化妝品原料。近年來，由于普魯蘭多糖具有良好的生物相容性、高分子本身及降解產(chǎn)物均無毒、降解速度可控、適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能、優(yōu)良的可成型性等特性，在藥物包埋載體、微膠囊制備材料、組織工程應(yīng)用和醫(yī)藥封裝高分子材料中的應(yīng)用研究獲得大量關(guān)注。作為高分子生物材料，分子量及其分布是微生物多糖的重要參數(shù)，影響其應(yīng)用產(chǎn)品(如組織工程支架等)的物理機(jī)械性能和降解速率。另一方面，高分子量產(chǎn)品可以顯著提高溶液粘度。因此，生產(chǎn)高分子量的普魯蘭多糖可以大大拓展普魯蘭多糖應(yīng)用領(lǐng)域，提高產(chǎn)品附加值。
[0004]微生物發(fā)酵是普魯蘭多糖主要的生產(chǎn)方法，因菌種的差異、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件的不同，普魯蘭多糖的分子量也有很大的變化。關(guān)于不同分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法也有很多報(bào)道。專利97121608.8公開一種發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的新方法，生產(chǎn)的普魯蘭多糖平均分子量為10萬道爾頓；專利200810052070.6公開的一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法得到分子量20-60萬道爾頓之間的普魯蘭多糖；專利200910148764.4公開了一種生產(chǎn)不同分子量普魯蘭多糖的方法，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中有機(jī)氮源和無機(jī)氮源的濃度能夠生產(chǎn)平均分子量在8萬-48萬之間的普魯蘭多糖。從這些及其他已公開的普魯蘭多糖生產(chǎn)方法的報(bào)道中，生產(chǎn)的普魯蘭多糖的分子量都較低，均在60萬道爾頓以下，極大限制了普魯蘭多糖的生產(chǎn)和應(yīng)用。目前，文獻(xiàn)中僅有山東福瑞達(dá)生物科技有限公司(專利申請?zhí)?201210555219.9)通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度和初始pH，得到分子量從50萬到200萬的普魯蘭多糖，但其針對高分子量普魯蘭多糖的產(chǎn)量未見報(bào)道，也沒有針對不同分子量產(chǎn)品設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)方案。
[0005]由于高分子量普魯蘭多糖發(fā)酵液具有很高的粘度，尤其在發(fā)酵后期表現(xiàn)出典型的非牛頓性流體特性，從而影響到發(fā)酵后期的氧的傳遞，這也決定了整個發(fā)酵工藝的特殊性。目前，普魯蘭多糖的生產(chǎn)多采用機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐；然而在高分子量普魯蘭多糖發(fā)酵后期會出現(xiàn)嚴(yán)重的溶氧限制，在攪拌槳外發(fā)酵液幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)，為了改善攪拌效果，不得不以消耗大量的電力為代價(jià)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種高分子量普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株及利用該菌株生產(chǎn)高分子量普魯蘭多糖的方法，能大量獲得高分子量普魯蘭多糖。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
高分子量普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株，其特征在于:
所述高產(chǎn)菌株的分類命名為出芽短梗霉(WyreoAaWii/a? pullulans) SWP35，于2015年11月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.11602ο
[0008]利用所述的高分子量普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，其特征在于:
包括以下步驟:
(1)菌種活化:
將4°C斜面保藏菌種出芽短梗霉{Aureobasidium pullulans) SWP35轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基，28±2°C培養(yǎng)4~6天；
(2)種子培養(yǎng):
選取純培養(yǎng)的平板，使用無菌打孔器和無菌接種針，將菌塊接種于種子培養(yǎng)液，于28±2°C，轉(zhuǎn)速200±30 rpm條件下培養(yǎng)24~48h，制得種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):
將步驟(2)制得的種子液以1~5% (V/V)接種于發(fā)酵培養(yǎng)液，于裝液量40~70%的氣升式發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵溫度28 ±2 °C，通氣量為0.5-1.5VVM，發(fā)酵60~96h ；
(4)發(fā)酵液后處理:
發(fā)酵液稀釋后經(jīng)板框過濾除菌、澄清過濾、酒精沉淀、酒精洗滌，壓濾或離心脫除有機(jī)溶劑得固形物，固形物經(jīng)干燥和粉碎后即可得到白色的普魯蘭多糖產(chǎn)品。
[0009]步驟(1)中，PDA培養(yǎng)基的配方如下:
馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，余量為水；
初始pH自然，121°C，20min滅菌。
[0010]步驟(2)中，種子培養(yǎng)液的配方如下:
葡萄糖50g/L，硫酸銨0.6g/L，酵母粉1.7g/L，硫酸鎂0.2g/L，氯化鈉1.0g/L,磷酸氫二鉀 5.0g/L ;
初始 pH6.5，121°C，20min 滅菌。
[0011]步驟(3)中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方如下:
蔗糖50~100g/L，硫酸銨1.2-2.lg/L,硫酸鎂0.2g/L，氯化鈉1.0g/L,磷酸氫二鉀5.0g/L，余量為水；
初始 pH 6.5，121±5°C，20min 滅菌。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
利用本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的高分子量普魯蘭多糖產(chǎn)量高(大于35g/L)，重均分子量大于200萬，可用于水凝膠、人工骨等組織工程領(lǐng)域；用于食品增稠則可顯著降低普魯蘭多糖添加量，降低使用成本。
[0013]本發(fā)明采用氣升式發(fā)酵罐生產(chǎn)高分子量普魯蘭多糖，相比攪拌式發(fā)酵罐，耗能更低，獲得的普魯蘭多糖分子量更高；本發(fā)明所用發(fā)酵培養(yǎng)基不含有機(jī)氮源，培養(yǎng)基成分明確，后提取工藝簡單，能夠大量獲得高分子量普魯蘭多糖，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0014]圖1為實(shí)施例一制備普魯蘭多糖紅外色譜圖。
[0015]圖2為實(shí)施例二制備所得普魯蘭多糖紅外圖譜。
[0016]圖3為普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)紅外圖譜。
[0017]圖4為普魯蘭多糖分子量標(biāo)品(Sigma) GPC結(jié)果。
[0018]圖5為通過三階擬合獲得的普魯蘭多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019]圖6為實(shí)施例一分子量測定圖。
[0020]圖6中，實(shí)施例一樣品出峰時(shí)間為14.278，通過三階擬合方程估算，制得的普魯蘭多糖分子量Mw=2359232。
[0021]圖7為實(shí)施例二分子量測定圖。
[0022]圖7中，實(shí)施例二樣品出峰時(shí)間為14.067，通過三階擬合方程估算，獲得的普魯蘭多糖分子量為3330502 kDa。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0024]下述內(nèi)容中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。
[0025]本發(fā)明利用復(fù)合誘變技術(shù)篩選獲得一株高分子量普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株，分類命名為出芽短梗霉iAureobasidium pullulans) SWP35，從我國陜西省洛j 11地區(qū)蘋果表面分離獲得的出芽短梗霉Uwreofeii/i? /wWWaft?)SW2009AP5為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外和亞硝酸鹽復(fù)合誘變獲得，于2015年11月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC N0.11602。
[0026]利用上述高分子量普魯蘭多糖的高產(chǎn)菌株生產(chǎn)普魯蘭多糖的方法，包括以下步驟:
(1)菌種活化:
將4°C斜面保藏菌種出芽短梗霉{Aureobasidium pullulans) SWP35轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基，28±2°C培養(yǎng)4~6天；
(2)種子培養(yǎng):
選取純培養(yǎng)的平板，使用無菌打孔器和無菌接種針，將菌塊接種于種子培養(yǎng)液，于28±2°C，轉(zhuǎn)速200±30 rpm條件下培養(yǎng)24~48h，制得種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):
將步驟(2)制得的種子液以1~5% (V/V)接種于發(fā)酵培養(yǎng)液，于裝液量40~70%的氣升式發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵溫度28 ±2 °C，通氣量為0.5-1.5VVM，發(fā)酵60~96h ； (4)發(fā)酵液后處理:
發(fā)酵液稀釋后經(jīng)板框過濾除菌、澄清過濾、酒精沉淀、酒精洗滌，壓濾或離心脫除有機(jī)溶劑得固形物，固形物經(jīng)干燥和粉碎后即可得到白色的普魯蘭多糖產(chǎn)品。
[0027]步驟(1)中，PDA培養(yǎng)基的配方如下:
馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，余量為水；
初始pH自然，121°C，20min滅菌。
[0028]步驟(2 )中，種子培養(yǎng)液的配方如下:
葡萄糖50g/L，硫酸銨0.6g/L，酵母粉1.7g/L，硫酸鎂0.2g/L,氯化鈉1.0g/L,磷酸氫二鉀 5.0g/L ;
初始 pH6.5，121°C，20min 滅菌。
[0029]步驟(3)中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方如下:
蔗糖50~100g/L，硫酸銨1.2-2.lg/L,硫酸鎂0.2g/L,氯化鈉1.0g/L,磷酸氫二鉀5.0g/L，余量為水；
初始 pH 6.5，121±5°C，20min 滅菌。
[0030]高分子量普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株的獲得:
(1)原始菌株SW2009AP5及其特性:原始菌株SW2009AP5是從從我國陜西省洛川地區(qū)蘋果表面分離獲得的出芽短梗霉(jyreoAWii/a? pullulans、。該菌株在平板上生長時(shí)，菌落初期為灰白色，后逐漸轉(zhuǎn)暗至褐色，呈皮革狀，有褶皺，菌落濕潤，顯微觀察菌體呈菌絲狀。采用含有機(jī)氮源培養(yǎng)基液體培養(yǎng)96小時(shí)后發(fā)酵液顏色呈黃褐色，菌體多呈酵母狀，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到23.5g/L，蔗糖轉(zhuǎn)化率47%，獲得普魯蘭多糖的重均分子量約20萬。
[0031](2)誘變菌株的獲得:原始菌株SW2009AP5經(jīng)紫外和亞硝酸復(fù)合誘變處理獲得誘變菌株SWP35。
[0032]1)孢子懸液的制備:將斜面菌種接種于液體培養(yǎng)