一種抗菌素及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物深加工技術領域，具體涉及一種抗菌素及其制備方法與應 用。
【背景技術】
[0002] Nisin亦稱乳酸鏈球菌素，是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，是一種細菌抗菌 肽，僅有34個氨基酸組成，分子量為3510Da左右，其活性分子常以二聚體和四聚體的形式 存在。乳酸鏈球菌素由親水端和疏水端構(gòu)成，是典型的表面活性物質(zhì)。Nisin對大多數(shù)革 蘭氏陽性細菌均有抑制能力，產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌種對Nisin尤其敏感。在一般情況下， Nisin對革蘭氏陰性菌種、酵母和霉菌無抑制效果。因此被作為食品防腐劑廣泛應用于食品 行業(yè)。食用后在人體的生理pH條件和a-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改 變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群以及產(chǎn)生如其它抗菌素所出現(xiàn)的抗性問題，更不會與其它抗菌素出 現(xiàn)交叉抗性，具有高效、無毒、無殘留、無耐藥性、耐酸、耐高溫、安全、高效等優(yōu)點，在生物飼 料添加、食品防腐保鮮以及藥物治療方面有著廣闊的應用前景。
[0003] 目前Nisin的生產(chǎn)主要以乳酸乳球菌為生產(chǎn)菌，采用經(jīng)蛋白酶處理的巴氏滅菌奶 和酵母膏作為培養(yǎng)基，在一定條件下進行發(fā)酵、提取獲得。工業(yè)上常用的提取方法有有機溶 劑法、吸附法、膜分離法和柱層析法。有機溶劑法是分離Nisin的經(jīng)典方法，操作簡便，但回 收率低，產(chǎn)物活性低；吸附法能使產(chǎn)物保持較高的活性，但當發(fā)酵液中的Nisin濃度超過細 胞吸附能力時，只能回收部分Nisin，損失率較高；用膜分離法得到的產(chǎn)物純化效果不佳， 雜質(zhì)較多；柱層析法能獲得較高純度的產(chǎn)物，但是處理量小，分離時間長。
[0004] 這些分離純化工藝的不足導致Sigma公司生產(chǎn)的Nisin價格昂貴，純度只有 2. 5% ;而國產(chǎn)的Nisin價格雖然不高，其效價、純度和穩(wěn)定性都非常低。這使得高效價、高 純度Nisin的獲得及其廣泛應用受到影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種抗菌素及其制備方法解決現(xiàn)有乳酸鏈球菌素生產(chǎn)時分 離純化工藝的不足，價格昂貴，效價、純度和穩(wěn)定性都非常低等問題。
[0006] 為了實現(xiàn)上述的目的，采用如下的技術方案：
[0007] 本發(fā)明的抗菌素的制備方法包括如下步驟：
[0008] 步驟一，將乳酸乳球菌ATCC11454菌種活化后，挑取單菌落進行培養(yǎng)，離心處理 后去除菌種，獲得乳酸乳球菌發(fā)酵液；
[0009] 步驟二，將步驟一所得發(fā)酵液pH調(diào)至2以下，再利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再將pH調(diào)至 初始值，然后離心處理后取上清，過濾處理后得到乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液；
[0010] 步驟三，取步驟二所得發(fā)酵濃縮液與PBS緩沖液以重量比2:1混合，再加入Triton X-114和MgSO4M合液構(gòu)成雙水相體系，離心處理使雙水相達到相平衡后取上相，再用PBS 緩沖液稀釋后制得包含乳酸鏈球菌素和TritonX-114的抗菌素。
[0011] 該方法通過乳酸乳球菌的培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和TritonX-IlVMgSO4雙水相體系 萃取制得抗菌素，抗菌素中包含抗菌肽乳酸鏈球菌素和具有抑菌效果的表面活性劑Triton X-114,兩者的結(jié)合起協(xié)同作用使得抗菌素具有較高的效價。
[0012] 抗菌肽乳酸鏈球菌素在酸性條件下耐高溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)前先將發(fā)酵液pH調(diào)至2以下 有利于避免活性損失。
[0013] 進一步的，步驟一所述培養(yǎng)包括活化培養(yǎng)24-26h，平板劃線培養(yǎng)18-20h，種子液 培養(yǎng)20-22h和擴大培養(yǎng)16-18h;所述培養(yǎng)均在29-31°C恒溫培養(yǎng)箱中。
[0014] 進一步的，步驟二所述過濾處理為用0. 2-0. 25ixm的濾膜過濾至少一次除菌。
[0015] 進一步的，步驟三所述發(fā)酵濃縮液、所述TritonX-114和所述1%304重量比為 (15. 5-15. 7) : (0? 95-1. 05) : (0? 144-0. 156);所述PBS緩沖液濃度為 0? 018-0. 022M。
[0016] 進一步的，所述雙水相體系的相比為0. 21-0. 23。
[0017] 進一步的，所述離心處理為在24_26°C，11000-13000rpm的條件下離心28_32min。
[0018] -種上述制備方法制備的抗菌素。
[0019] 上述抗菌素的應用，主要是對革蘭氏陽性細菌有顯著的抑菌效果。
[0020] 進一步的，所述革蘭氏陽性細菌包括枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球 菌。其抑菌效果順序為：枯草芽孢桿菌〉金黃色葡萄球菌〉釀膿鏈球菌，而對三種革蘭氏陰 性菌種（大腸桿菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌）均無明顯抑制作用。抗菌素抑菌活性用其 抑菌效價衡量，所用方法為瓊脂擴散法，選用金黃色葡萄球菌為敏感菌。
[0021] 進一步的，所述抗菌素對金黃色葡萄球菌的抑菌效價為9143IU/mL，抗菌素中富集 分離得到的乳酸鏈球菌素效價為3210IU/mL。本發(fā)明所得抗菌素抑菌活性用其抑菌效價衡 量，所用方法為瓊脂擴散法，選用金黃色葡萄球菌為敏感菌。對金黃色葡萄球菌的抑菌效價 可達到Sigma公司乳酸鏈球菌素標準品（0.01g/mL)效價的91. 43%?？咕刂懈患蛛x得 到的乳酸鏈球菌素效價占抗菌素總效價的35. 11%。
[0022] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和TritonX-IlVMgSO4雙水相萃取， 避免了傳統(tǒng)提取技術活性低、收率低等弊端，提取工藝簡單、成本低，適用于間歇性和規(guī)模 化生產(chǎn)加工高效價、高收率的抗菌素成品。本發(fā)明制得的抗菌素同時包含抗菌肽乳酸鏈球 菌素和表面活性劑TritonX-114,兩者的結(jié)合起協(xié)同作用使得抗菌素具有較高的效價，對 革蘭氏陽性菌種有良好的抑菌效果。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明的抗菌素制備工藝流程圖；
[0024] 圖2是本發(fā)明實施例中發(fā)酵濃縮液的Tricine-SDS-PAGE圖，M表示Marker，F(xiàn)表 示發(fā)酵濃縮液，S表示Sigma公司生產(chǎn)的乳酸鏈球菌素標準品；
[0025] 圖3是進行抑菌實驗時標準品與樣品的加樣方式，Si表示乳酸鏈球菌素標準品， Ul表示未知效價樣品；
[0026] 圖4是本發(fā)明制得的抗菌素與雙水相分配乳酸乳球菌培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌 的抑菌效價，實驗組是抗菌素，對照組雙水相分配乳酸乳球菌培養(yǎng)基；上相是乳酸鏈球菌 素和TritonX-114的抗菌素，下相是MgSO4和相對少量損失的乳酸鏈球菌素和Triton X-114 ；
[0027]圖5是本發(fā)明制得的抗菌素與發(fā)酵濃縮液的抑菌效價對比圖；上相即是含乳酸鏈 球菌素和TritonX-114的抗菌素；
[0028]圖6是本發(fā)明制得的抗菌素對枯草芽孢桿菌的抑制效果；
[0029] 圖7是本發(fā)明制得的抗菌素對釀膿鏈球菌的抑制效果。
【具體實施方式】
[0030] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一 步地詳細描述。
[0031] 實施例1 [0032]抗菌素的制備
[0033] (1)制備乳酸乳球菌發(fā)酵液：根據(jù)表1的配方配制培養(yǎng)基，在115°C滅菌30min后， 將購買的菌種乳酸乳球菌ATCC11454干粉用0.5mL液體培養(yǎng)基溶解，再以5% (v/v)的比 例接入5mL液體培養(yǎng)基中，在30°C恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24h。待菌種活化后，將25mL固 體培養(yǎng)基倒入平板中，用接種針取少許活化好的菌液劃線接種于平板上，在30°C條件下培 養(yǎng)18h。長出菌種后，挑取單菌落接種于30mL種子液培養(yǎng)基中，在30°〇〖旦溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 20h。然后將培養(yǎng)好的種子液以3% (v/v)的比例接種于新鮮的200mL液體培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C培養(yǎng)16h。培養(yǎng)完畢后，將發(fā)酵液在25°C，12000rpm的條件下離心 30min，取上清液，制得乳酸乳球菌發(fā)酵液。
[0034] 表1乳酸乳球菌ATCC11454培養(yǎng)基配方
[0035]
[0036] (2)制備乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液：準確量取90mL發(fā)酵液，記錄初始發(fā)酵液的pH 值，用濃鹽酸將其pH調(diào)至2以下，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將體積濃縮6倍，再用固體NaOH將濃縮后 的發(fā)酵液pH調(diào)回初始值。將濃縮后的發(fā)酵液在25°C，12000rpm的條件下離心30min后，棄 沉淀用0. 22ym的濾膜過濾一次除菌，制得乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液。
[0037] (3)制備抗菌素：取50mL離心管，加入TritonX-1140.8g，25%的MgS04溶液 〇.48g，乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液12.48g，0.02MPBS6. 24g，配制成20g雙水相體系。在室溫 下混勾30min后，將雙水相放入超速離心機中，在25°C，12000rpm的條件下離心30min，取上 相，用0. 02MPBS稀釋8倍即可獲得抗菌素。
[0038] 實施例2
[0039] 抗菌素的制備
[0040] (1)制備乳酸乳球菌發(fā)酵液：根據(jù)表1的配方配制培養(yǎng)基，在115°C滅菌30min后， 將購買的菌種乳酸乳球菌ATCC11454干粉用0.5mL液體培養(yǎng)基溶解，再以5% (v/v)的比 例接入5mL液體培養(yǎng)基中，在29°C恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24h。待菌種活化后，將25mL固 體培養(yǎng)基倒入平板中，用接種針取少許活化好的菌液劃線接種于平板上，在29°C條件下培 養(yǎng)18h。長出菌種后，挑取單菌落接種于30mL種子液培養(yǎng)基中，在29°0〖旦溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 20h。然后將培養(yǎng)好的種子液以3% (v/v)的比例接種于新鮮的200mL液體培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為29°C培養(yǎng)16h。培養(yǎng)完畢后，將發(fā)酵液在24°C，IlOOOrpm的條件下離心 28min，取上清液，制得乳酸乳球菌發(fā)酵液。
[0041] (2)制備乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液：準確量取90mL發(fā)酵液，記錄初始發(fā)酵液的pH 值，用濃鹽酸將其pH調(diào)至2以下，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將體積濃縮6倍，再用固體NaOH將濃縮后 的發(fā)酵液pH調(diào)回初始值。將濃縮后的發(fā)酵液在24°C，I1000 rpm的條件下離心28min后，棄 沉淀用0. 2ym的濾膜過濾兩次除菌，制得乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液。
[0042] (3)制備抗菌素：取50mL離心管，加入TritonX-1140. 76g，25%的MgSO4溶液 〇. 46g，乳酸乳球菌發(fā)酵濃縮液12. 4g，0. 018MPBS6. 2g，配制成20g雙水相體系。在室溫下 混勾30min后，將雙水相放入超速離心機中，在24°C，IlOOOrpm的條件下離心28min，取上 相，用0. 018MPBS稀釋8倍即可獲得抗菌素。
[0043] 實施例3
[0044] 抗菌素的制備
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