檢測β-內(nèi)酰胺抗生素抗性的細(xì)菌的診斷方法
【專利說明】檢測β-內(nèi)醜胺抗生轟抗性的細(xì)菌的診斷方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子診斷、特別是用于確定生物樣品中的β-內(nèi)酷胺抗性細(xì)菌的存在的 領(lǐng)域。
[0002] 發(fā)明背景 細(xì)菌對抗微生物藥諸如抗生素的抗性在全世界是嚴(yán)重且正在發(fā)展的健康問題。在革蘭 氏陰性細(xì)菌間，抗藥性的最突出原因是β-內(nèi)酷胺酶的出現(xiàn)，所述β-內(nèi)酷胺酶破壞β-內(nèi)酷胺 抗生素的β-內(nèi)酷胺環(huán)。超廣譜β-內(nèi)酷胺酶巧SBUW-內(nèi)酷胺酶的重要亞群)能夠賦予對機(jī)構(gòu) 和口診護(hù)理中使用的最常見的β-內(nèi)酷胺抗生素(諸如青霉素類、頭抱菌素類和單環(huán)內(nèi)酷胺 類)的抗性。ESBL也可W賦予對非β-內(nèi)酷胺抗生素諸如哇諾酬類、氨基糖巧類和甲氧節(jié)氨喀 晚的多藥抗藥性，縮小了治療選項(xiàng)。
[0003] 產(chǎn)生ES化的細(xì)菌最初在1980年代早期發(fā)現(xiàn)于住院患者間，特別是重癥監(jiān)護(hù)病房中 的最脆弱的患者，但現(xiàn)在也在基于社區(qū)的患者間傳播。相關(guān)感染癥狀主要包括尿路感 染，其次包括腹腔內(nèi)感染。逃至血流后，產(chǎn)生ES化的細(xì)菌可導(dǎo)致敗血癥或其他嚴(yán)重到足W需 要住院治療的感染。
[0004] 迄今在世界上已經(jīng)鑒定了超過十種不同類型的ES化。到目前為止，TEM和細(xì)V酶已 經(jīng)形成最常見的ES化類型，但從21世紀(jì)開始，已經(jīng)越來越清楚的是，ES化類型的流行率的變 化正在發(fā)生。CTX-M酶已經(jīng)在很大程度上代替且在數(shù)量上超過其他類型的ES化，且現(xiàn)在被認(rèn) 為是臨床上最重要亞類的ES化。
[000引據(jù)推測，編碼CTX-M的blacTX-M基因源自克呂沃爾氏屬種化luyvera SPP)的染色體 編碼的酶，但如今作為具有在不同的細(xì)菌種群之間移動(dòng)的能力的質(zhì)粒綴合基因存在。 blacTX-M的初始載體包括大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌化lebsiella pneumoniae)、鼠傷寒沙口 氏菌（Salmonella typhimurium)和奇異變形桿菌（Proteus mirabilis)，但進(jìn)一步攜帶 blacTx-M的細(xì)菌菌株越來越出現(xiàn)。迄今已經(jīng)報(bào)道了超過124種不同的CTX-M類型。對于CTX-M類 型的精確分類沒有一致意見，但根據(jù)D'Amlrea (Int.J.Med., 2013.印刷前電子出版），主 要的CTX-M組群是CTX-M-1、-2、-8、-9、-25和KLUC。各亞組內(nèi)的氨基酸變化小于5 %，而組群 間的變化為至少10%。
[0006] ES化產(chǎn)生者的檢測和鑒定是至關(guān)重要的，不僅因?yàn)槭芨腥净颊叩难舆t識別和不適 治療已經(jīng)與增加的死亡率相關(guān)，而且還限制運(yùn)些多藥抗性微生物的傳播。廣泛使用的靈敏 性測試諸如紙片擴(kuò)散和稀釋抗微生物敏感性測試W及驗(yàn)證測試(大多基于克拉維酸和頭抱 菌素之間的協(xié)同作用)便宜，且相對容易使用。然而，此類測試是費(fèi)時(shí)的，且受困于有限的靈 敏度。
[0007] 在基因水平測定ES化代表用于鑒定和分型blacTX-M基因的替代方法。為此，已經(jīng)開 發(fā)了許多基于PCR的測定法。此類測定法是精確和靈敏的，但其中許多需要一連串的擴(kuò)增子 特異性測序引物W及PCR產(chǎn)物的勞動(dòng)密集且耗時(shí)的分析，例如通過DNA測序。可W，至少部分 地，通過通用的簡并CTX-M引物或通過采用如Birkett等人于J. Med. Microbiol., 2007, 56:52-55中所公開的基于實(shí)時(shí)PCR的方法(其允許PCR產(chǎn)物的同時(shí)擴(kuò)增和分析)來避免運(yùn)些 缺點(diǎn)。
[0008] 與在核巧酸水平鑒定blacTX-M基因型的方法相關(guān)的一個(gè)進(jìn)一步缺點(diǎn)是伴隨檢測高 度同源的非blacTx-M基因序列，特別是產(chǎn)酸克雷伯氏菌的染色體K1基因，引起假陽性結(jié)果，因 此，有必要使用驗(yàn)證測試。
[0009] 專利公開US 2009/0163382公開了用于基于許多不同的抗生素抗性基因檢測抗生 素抗性的細(xì)菌物種的基于微陣列的方法的引物和探針。然而，通過該方法僅檢測到124種不 同的目前已知的CTX-M類型中的一部分。
[0010] 此外，F(xiàn)u等人(J. Microbiol. Methods, 2012，89:110-118)公開了抗藥基因檢 測的DNA微陣列。該陣列含有來自17類抗藥基因的總共115種探針。然而，通過該方法僅檢測 到124種不同的目前已知的CTX-M類型中的一部分。
[0011] 為了確?；颊甙踩浴SMJ勺最佳治療和擴(kuò)散控制，本領(lǐng)域需要用于確定生物樣 品中的ES化的存在的高度靈敏和特異的寬范圍測定法。
[001引發(fā)明概述 在一個(gè)方面，本發(fā)明設(shè)及確定生物樣品中的產(chǎn)生CTX-M的細(xì)菌的存在或不存在的方法。 所述方法包括W下步驟： a) 提供懷疑含有產(chǎn)生CTX-M的細(xì)菌的生物樣品； b) 如果有的話，擴(kuò)增所述樣品中的編碼CTX-M的DNA;和 C)使用至少一個(gè)探針檢測擴(kuò)增的DNA，所述探針與blacTx-M基因的區(qū)域雜交，所述區(qū)域 對應(yīng)于CTX-M-15中的沈Q ID N0:23的核巧酸397-617的區(qū)域，且所述探針包含沈Q ID NO: 24或SEQ ID NO:72中記載的核酸序列的至少10個(gè)連續(xù)核巧酸； 其中步驟b)和C)可W單獨(dú)或同時(shí)進(jìn)行。
[0013] 在本方法的一些實(shí)施方案中，所述探針與blacTX-M基因的區(qū)域雜交，所述區(qū)域?qū)?yīng) 于CTX-M-15中的SEQ ID NO: 23的核巧酸503-539的區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W容易識別其 他CTX-M變體中的對應(yīng)blacTX-M區(qū)域。換言之，本實(shí)施方案不限于與blacTX-M-15雜交的探針，但 涵蓋與任何blacTX-M變體雜交的探針。
[0014] 在本方法的一些其他實(shí)施方案中，所述探針可W二分為5'-探針和3'-探針。在一 些又進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述5'-探針包含SEQ ID N0:34、35、或63中記載的核酸序列，和/ 或所述3'-探針包含SEQ ID NO:44、45、或70中記載的核酸序列。所述探針也可W與本文公 開的序列具有至少80%的序列同一性，只要它們保留它們在正常雜交條件下與blacTx-M基因 雜交的能力。
[0015] 在本方法的一些其他實(shí)施方案中，用包含SEQ ID NO: 1、2、或61中記載的核酸序列 的正向引物和包含SEQ ID NO: 11或12中記載的核酸序列的反向引物進(jìn)行擴(kuò)增步驟。
[0016] 所述引物也可W與本文公開的序列具有至少80%的序列同一性，只要它們保留它 們在正常PCR引物雜交條件下擴(kuò)增blacTX-M基因的能力。
[0017] 在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供分別能夠擴(kuò)增和雜交blacTX-M的寡核巧酸引物和探針。 所述探針可^包含與560 1〇^:34、35、44、45、63、或70中任一者中記載的序列或與560 1〇 NO:24或SEQ ID NO:72的至少10個(gè)連續(xù)核巧酸具有至少80%序列同一性的核酸序列，只要 它們保留它們在正常雜交條件下與blacTx-M基因雜交的能力。在一些實(shí)施方案中，還提供包 含至少Ξ種不同的寡核巧酸分子的寡核巧酸探針混合物，所述寡核巧酸分子彼此獨(dú)立地各 自包含SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:72中包含的核酸序列的至少10個(gè)連續(xù)核巧酸。在一些實(shí) 施方案中，衍生自SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72的探針可W作為二分的雙探針存在。所述 引物，進(jìn)而，可W包含與SEQ ID NO:l、2、ll、12、或61中記載的序列具有至少80%序列同一 性的核酸序列，只要它們保留它們在正常PCR引物雜交條件下擴(kuò)增blacTx-M基因的能力。
[0018] 值得注意的是，關(guān)于本方法所公開的任何特征適用于本引物和探針，反之亦然，如 果適用的話。
[0019] 在W下附圖、詳述、實(shí)例、附表和從屬權(quán)利要求中記載了本發(fā)明的其他方面、具體 實(shí)施方案、目標(biāo)、細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)。
[0020] 附圖概述 W下，將借助參考附圖的優(yōu)選實(shí)施方案更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中 圖1是說明基于馨合物互補(bǔ)的檢測方法的原理的示意圖（Karhunen等人，Anal. 化em.，2010, 82:751-754)。在圖1A中，不存在目標(biāo)寡核巧酸，因此，沒有發(fā)生馨合物互補(bǔ)。 在圖1B中，存在目標(biāo)寡核巧酸，且在銅系元素-離子-載體-馨合物-綴合的探針和天線-綴合 的探針緊密接近結(jié)合至目標(biāo)寡核巧酸之后能夠馨合物互補(bǔ)。圖2說明本引物在基于SYBR? Green I的PCR中的表現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，分別使用SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:12 (正方形）、 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:11 (圓形）、SEQ ID N0:1 和沈Q ID N0:12 (S角形）和SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 11 (菱形）的正向和反向引物混合物擴(kuò)增初始10000個(gè)基因組拷貝的 CTX-M-9-組群-陽性巧屯、符號)或CTX-M-陰性(實(shí)屯、符號)大腸桿菌。無模板DNA的對照用上 面解釋的符號顯示于虛線中。顯示用Ξ個(gè)平行反應(yīng)獲得的平均結(jié)果。RFU，相對巧光單位。 [0021 ] 圖3說明K1擴(kuò)增與blacTX-M擴(kuò)增的區(qū)別。圖3A顯示用0(圓形）、1000(Ξ角形)或10000 (正方形)個(gè)基因組拷貝的CTX-M-1-組群-陽性的大腸桿菌或10000個(gè)基因組拷貝的產(chǎn)酸克 雷伯氏菌(叉形）的代表性反應(yīng)的PCR擴(kuò)增圖。圖3Β顯示對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線。疊加用 初始1000或10000個(gè)基因組拷貝的CTX-M陽性大腸桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物的曲線。R即，相對巧光單 位。
[0022] 圖4顯示當(dāng)兩個(gè)獨(dú)立的CTX-M-1-組群（圓形）、CTX-M-2-組群角形）或CTX-M-9- 組群-陽性(正方形）大腸桿菌樣品、Ξ個(gè)獨(dú)立的產(chǎn)酸克雷伯氏菌樣品（叉形）和一個(gè)CTX-M- 陰性大腸桿菌樣品（叉形）Wl〇〇〇〇個(gè)基因組拷貝/反應(yīng)的量用作模板時(shí)作為Ξ個(gè)平行反應(yīng) 的平均值的基于馨合物互補(bǔ)的PCR擴(kuò)增圖。在本實(shí)驗(yàn)中，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:11的引 物混合物與Eu-探針(SEQ ID NO:35)和天線-探針(SEQ ID NO:45)混合物(0.05 μΜ的各個(gè) 別探針)一起使用。僅CTX-M-陽性樣品提供與背景信號可區(qū)別的信號。
[0023] 圖5表明作為Ξ個(gè)獨(dú)立反應(yīng)的平均值的本診斷的基于馨合物互補(bǔ)的PCR方法的分 析靈敏度。來自CTX-M-1-組群-陽性（圖5A)、CTX-M-2-組群-陽性（圖5B)或CTX-M-9-組群-陽 性（圖5C)大腸桿菌樣品的DNAW10000(圈形）、1000(Ξ角形）、100(正方形）、10(菱形）、1(減 號）、〇.1(加號）、〇.〇1(無符號的線)或〇(叉形)個(gè)基因組拷貝/PCR反應(yīng)用作模板。闊值循環(huán) 是其中反應(yīng)信號超過闊值水平(信號背景比1.5)的PCR循環(huán)。
[0024] 圖6呈現(xiàn)作為Ξ個(gè)獨(dú)立反應(yīng)的平均值的用SEQ ID NO:63的Eu-探針混合物和SEQ ID NO:70的天線-探針混合物用延伸的CTX-M變體目標(biāo)種類的基于馨合物互補(bǔ)的PCR的分析 特異性的結(jié)果。Ξ十個(gè)CTX-M-陽性樣品（叉形）W100個(gè)基因組拷貝/反應(yīng)的量用作模板。二 十五個(gè)CTX-M-陰性樣品（Ξ角形）W100 000個(gè)基因組拷貝/反應(yīng)的量用作模板。僅CTX-M-陽 性樣品產(chǎn)生與背景信號可區(qū)別的信號。
[002引圖7說明作為Ξ個(gè)獨(dú)立反應(yīng)的平均值的用SEQ ID N0:63的Eu-探針混合物和SEQ ID NO:70的天線-探針混合物用延伸的CTX-M變體目標(biāo)種類的基于馨合物互補(bǔ)的PCR的分析 靈敏度。來自CTX-M-2-組群-陽性樣品的DNAW100 000(無符號的線）、10000(圈形）、1000 (Ξ角形）、100(正方形）、10(菱形）、1(減號）、0.1(加號）或0(叉形)個(gè)基因組拷貝/PCR反應(yīng) 用作模板。用CTX-M-1-組群、CTX-M-8-組群、CTX-M-9-組群或CTX-M-25-組群-陽性樣品獲得 了類似的結(jié)果。
[0026] 圖8表明使用CTX-M-2-陽性細(xì)胞作為模板用細(xì)菌細(xì)胞的用SEQ ID ^:63的611-探 針混合物和SEQ ID N0:70的天線-探針混合物用延伸的CTX-M變體目標(biāo)種類的基于馨合物 互補(bǔ)的PCR的表現(xiàn)。該圖的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表Ξ個(gè)獨(dú)立反應(yīng)的平均值。在分析之前不從細(xì)菌細(xì)胞分 離DNA，但將細(xì)胞W300 000 (無符號的線）、30000(圈形）、3 000(Ξ角形）、300 (正方形）、30 (菱形）、3(減號）、0.3(加號）或0(叉形)個(gè)菌落形成單位/PCR反應(yīng)完整地作為模板添加至 PCR反應(yīng)。
[0027] 發(fā)明詳述 本發(fā)明設(shè)及用于確定生物樣品中的產(chǎn)生0-內(nèi)酷胺酶、尤其是超廣譜0-內(nèi)酷胺酶巧SBL) 的細(xì)菌的存在的方法和裝置。更具體地，產(chǎn)生ES化的細(xì)菌是產(chǎn)生CTX-M的細(xì)菌。
[0028] 如本文所使用，術(shù)語"超廣譜β-內(nèi)酷胺酶"或巧SBL"是指能夠通過降解所有β-內(nèi)酷 胺抗生素共有的β-內(nèi)酷胺環(huán)結(jié)構(gòu)提供對β-內(nèi)酷胺抗生素諸如青霉素類、頭抱菌素類(例如， 頭抱嚷朽、頭抱曲松、頭抱他晚、頭抱化朽和氧基亞氨基-單酷胺氨曲南)和單環(huán)內(nèi)酷胺的抗 菌特性的抗性或使0-內(nèi)酷胺抗生素諸如青霉素類、頭抱菌素類(例如，頭抱嚷朽、頭抱曲松、 頭抱他晚、頭抱化朽和氧基亞氨基-單酷胺氨曲南）和單環(huán)內(nèi)酷胺的抗菌特性失活的任何 酶。
[0029] 如本文所使用，術(shù)語乂ΤΧ-Μ"是指ES化的亞組的任何成員，即比其他氧基亞氨基頭 抱菌素具有顯著更大的針對頭抱嚷目虧的活性的質(zhì)粒編碼的酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，術(shù)語 乂 ΤΧ-Μ"