tetA基因在檢測土壤抗生素抗性污染水平中的應(yīng)用與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于土壤環(huán)境污染物的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及tetA基因在檢測土壤抗 生素抗性污染水平中的應(yīng)用與方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在人類醫(yī)學(xué)和家畜飼養(yǎng)中，抗生素被廣泛用于治療或預(yù)防疾病發(fā)生和促進(jìn)家畜生 長提高產(chǎn)量。然而，攝入人體或動物體內(nèi)的抗生素很少能被人和動物吸收，大部分抗生素會 排出人和動物體外并隨著處理后污水的排放和人畜糞便作為肥料使用而擴(kuò)散到土壤中，使 土壤環(huán)境成為一個巨大的潛在的抗生素抗性基因 （Antibiotic Resistance Genes，ARGs) 儲存庫。越來越多的證據(jù)表明抗生素在環(huán)境中的釋放和擴(kuò)散會對土壤微生物施加選擇性壓 力，從而導(dǎo)致攜帶ARGs的微生物數(shù)量顯著增長。最近發(fā)表的世界衛(wèi)生組織的研究警告說 "抗生素抗性細(xì)菌正在全世界的許多地方尤其是中國流行，這將可能導(dǎo)致人和動物罹患腦 膜炎和使皮膚、血液、腎臟和其他器官受到感染"。
[0003] 攜帶ARGs的微生物菌株死亡后，包含ARGs的DNA分子可釋放到環(huán)境中長期存在， 并可能通過直接接觸或食物鏈迀移等多種途徑進(jìn)入人體，增加人體的抗生素耐藥性，使細(xì) 菌感染性疾病的治療更為困難。此外，由于基因污染比較特殊，它可以通過可移動遺傳元件 介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移機(jī)制在相似細(xì)菌以及病原菌和非病原菌間無限制地傳播，而且具遺傳 性，很難控制和消除，一旦形成將對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)安全造成長期、不可逆的危害。因 此，評價土壤抗生素抗性污染水平已成為國際關(guān)注的熱點。
[0004] 由于ARGs主要由土壤中的各類耐藥微生物所攜帶，因此檢測土壤抗生素抗性污 染水平可從抗性微生物數(shù)量和抗性基因豐度兩方面進(jìn)行檢測，對應(yīng)的檢測方法分別為：抗 性微生物培養(yǎng)法和抗性基因定量PCR擴(kuò)增法?？剐晕⑸锱囵B(yǎng)法評價土壤抗生素污染水 平主要通過抗性微生物占總可培養(yǎng)微生物的比例來表示；抗性基因定量PCR擴(kuò)增法，主要 通過抗性基因占總細(xì)菌16S rRNA基因豐度的比例來表示。由于土壤中只有0. 1~10%的 微生物是可培養(yǎng)的，因此抗性微生物培養(yǎng)法評價土壤抗生素抗性污染水平的準(zhǔn)確性受到質(zhì) 疑?？剐曰蚨縋CR擴(kuò)增法能夠避開微生物培養(yǎng)法的缺陷，通過直接從土壤中提取DNA， 并對目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和根據(jù)擴(kuò)增過程中的熒光強(qiáng)度對基因豐度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，從而 在抗生素抗性污染分析中受到了廣泛采用。然而土壤中的抗生素抗性污染常常涉及多種 抗生素，因此要想準(zhǔn)確評價總的土壤抗生素抗性污染，需要通過高通量定量PCR的方法對 數(shù)十種乃至幾百種基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過對擬評價土壤與對照土壤中經(jīng)細(xì)菌豐度校正后的各 類ARGs的豐度進(jìn)行比較分析，分別計算出擬評價土壤中每一種抗性基因的富集倍數(shù)，所有 ARGs富集倍數(shù)的加和可反應(yīng)土壤總的抗生素抗性污染水平。但這種檢測方法涵蓋的抗性基 因數(shù)量巨大，因此花費成本高，且耗時耗力，不利于大規(guī)模推廣。
[0005] -種省時、廉價和準(zhǔn)確的土壤抗生素抗性污染水平檢測方法對于評價人類所面臨 的潛在抗生素抗性污染風(fēng)險和實施阻止抗生素抗性傳播的策略是非常關(guān)鍵的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供tetA基因在檢測土壤抗生素抗性污 染水平中的應(yīng)用與方法。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 基因 tetA在檢測土壤抗生素抗性污染水平中的應(yīng)用。
[0009] 上述的應(yīng)用是通過基因 tetA的富集倍數(shù)與ARGs總富集倍數(shù)之間的正相關(guān)體現(xiàn) 的。
[0010] 所述基因 tetA的富集倍數(shù)與ARGs總富集倍數(shù)之間的關(guān)系：y = 569. 635+4. 671x， 其中X為tetA富集倍數(shù)，y為ARGs總富集倍數(shù)。
[0011] -種利用基因 tetA檢測土壤抗生素抗性污染水平的方法，具體包括以下的步驟：
[0012] (1)選用正向引物序列如SEQIDNo. 1和反向引物序列如SEQIDNo. 2, tetA-F 5' -CTCACCAGCCTGACCTCGAT-3' /tetA-R 5' -CACGTTGTTATAGAAGCCGCATAG-3' 對目的抗性基 因 tetA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] ⑵切膠回收純化擴(kuò)增后的目的抗性基因，將抗性基因連接在T載體上，然后轉(zhuǎn)化 感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板后挑選陽性克隆子，通過基因測序確定 攜帶目的基因的陽性克隆子，并用含有氨芐的LB培養(yǎng)液對其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0014] (3)檢測從含有氨芐的LB培養(yǎng)菌液中提取的質(zhì)粒的濃度，換算出單位體積質(zhì)粒所 攜帶抗性基因的拷貝數(shù)，將含有目的基因的質(zhì)粒按10倍梯度進(jìn)行系列稀釋，作為抗性基因 標(biāo)準(zhǔn)品；
[0015] (4)提取土壤DNA，土壤DNA和抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增tetA基因， 根據(jù)tetA基因的富集倍數(shù)和公式y(tǒng) = 569. 635+4. 671x，其中X為tetA富集倍數(shù)，y為ARGs 總富集倍數(shù)，進(jìn)而得出土壤抗生素抗性污染水平。
[0016] 所述目的抗性基因長度分別為：tetA基因的長度是71bp。
[0017] 所述步驟（1)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L，其中包括2 μ L的模板 DNA (I-IOng)，各 0.5 yL 的正、反向引物（10 μ Μ)，12.5 yL 的 2 XPremix Ex Taq?(大連寶 生物公司）和9. 5 μ L的無菌雙蒸水；PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性IOmin ;40個循環(huán)的95°C 保持20s (變性），57°C保持20s (退火）和72°C保持30s (延伸）；72°C保持5min(完全延 伸）。
[0018] 所述步驟（2)中的轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞具體步驟為：從-80°C冰箱取出感受 態(tài)細(xì)胞，冰上解凍5min，輕敲混勻后轉(zhuǎn)移40 μ L感受態(tài)細(xì)胞至連接反應(yīng)管，輕擊離心管混勻 并于冰上放置20min，之后在42°C水浴45-50s，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰上放置2min，加入950 μ L 的SOC培養(yǎng)液至連接反應(yīng)管，在37°C振蕩培養(yǎng)（150轉(zhuǎn)/分）1. 5小時，然后將每個轉(zhuǎn)化培養(yǎng) 基100 μ L涂到兩個LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，將平板于37°C過夜培養(yǎng)（16-24小時）， 取出平板后放4°C顯色10h，挑選白斑菌落。
[0019] 所述步驟⑶中，質(zhì)粒濃度換算成每yL質(zhì)粒溶液中目的基因的拷貝數(shù)的公式為： 質(zhì)粒濃度（ng/μ L) X 6. 02 X IO23/[(插入片段長度+3015) X 660 X IO9]。
[0020] -種檢測土壤抗生素抗性污染水平的試劑盒，包含正向引物序列如SEQIDNo. 1和 反向引物序列如SEQIDNo. 2,將土壤DNA和抗性基因標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增tetA基 因，根據(jù)tetA基因的富集倍數(shù)和公式y(tǒng) = 569. 635+4. 671x，進(jìn)而得出土壤抗生素抗性污染 水平。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] 根據(jù)特定抗性基因 tetA富集倍數(shù)與ARGs總富集倍數(shù)間具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系 (P〈0. 001)，根據(jù)土壤中這種基因的富集水平對土壤抗生素抗性污染的水平進(jìn)行檢測和評 價，極大地節(jié)約了人力、物力，并能較好地反應(yīng)土壤抗生素抗性污染水平。
【附圖說明】
[0023] 圖1為tetA基因富集倍數(shù)與ARGs總富集倍數(shù)之間的關(guān)系。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0025] 從14個地點采取公園土，其中6個公園是用污水處理廠出水進(jìn)行灌溉的，6個公 園是用新鮮水灌溉的，2個未受到人類干擾的國家公園土作為對照。每個公園采集3份土 壤。采集的土壤樣品立即放入冰盒中，帶回實驗室后將每份土壤去除樹根、石子和昆蟲等雜 質(zhì)并充分混合均勻，然后存儲在_20°C冰箱中，并在一周內(nèi)利用MoBio PowerSoil DNA提取 試劑盒從土壤中直接提取DNA。
[0026] 選用引物對正向引物序列如SEQIDNo. 1和反向引物序列如SEQIDNo. 2, tetA-F 5' -CTCACCAGCCTGACCTCGAT-3' /tetA-R 5' -CACGTTGTTATAGAAGCCGCATAG-3' 對四環(huán)素 (Tetracycline)類抗性基因 tetA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0027] 上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L，其中包括2 μ L的模板DNA(I-IOng)，各0. 5 μ L 的正、反向引物（10 μΜ)，12.5 yL的2 XPremix Ex Taq?(大連寶生物公司）和9.5 yL的 無菌雙蒸水。
[0028] 上述PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性IOmin ;40個循環(huán)的95°C保持20s (變性），57°C 保持20s (退火）和72°C保持30s (延伸）；72°C保持5min (完全延伸）。
[0029] 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物通過1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并根據(jù)DNA marker對基 因片段長度進(jìn)行比對，tetA基因的長度是71bp。將瓊脂糖凝膠中對應(yīng)的電泳條帶進(jìn)行切膠 回收，并用Promega公司的膠純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收。
[0030] 純化后的PCR產(chǎn)物用來構(gòu)建克隆文庫，首先是將純化后的PCR產(chǎn)物和Promega公 司的pGEM-T easy載體進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為10 μ L，其中包括：5 μ L的連接緩沖液、 1 μ L的T載體、1 μ L的T