專利名稱：魚飼料添加劑的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包含酵母細(xì)胞的生物組合物，所述的酵母細(xì)胞具有能提高養(yǎng)殖魚群的免疫功能的作用。本發(fā)明還同時(shí)涉及該生物組合物的生產(chǎn)方法及作為飼料添加劑的使用方法。
2.發(fā)明背景水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是食品工業(yè)中發(fā)展最快的一個(gè)組成部分，它在很大程度上對(duì)野生魚類和水生植物起到了補(bǔ)充甚至替代的作用。到1996年，人工養(yǎng)殖的長(zhǎng)須鯨、貝類以及水生植物的總重量已經(jīng)達(dá)到了三千四百十二噸，其價(jià)值高達(dá)四百六十五億美元。但是在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高速發(fā)展的同時(shí)，越來越多的感染性及非感染性疾病也隨之而來，從而使得水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)量大大下降。隨著孵化密度及產(chǎn)量的提高，孵化池中的真菌(如鏈壺菌屬(Lagenidium)、高壺菌屬(Sirolpidium))、細(xì)菌(如弧菌(Vibrio)、氣單孢菌(Aeromonas))甚至病毒(如桿狀病毒(Baculovirus))感染也越來越常見。這對(duì)水生動(dòng)物的影響包括對(duì)易感因素易感性的增高、抗病能力的下降、以及生長(zhǎng)速度的減緩。許多引起這些感染的病原體都是全球性分布的，在世界主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)如日本、韓國、臺(tái)灣、菲律賓、印度尼西亞、泰國、馬來西亞、印度、加勒比海地區(qū)、巴西、墨西哥、巴拿馬、厄瓜多爾、哥倫比亞、美國、以及澳大利亞等都已有所發(fā)現(xiàn)。
這些問題的產(chǎn)生主要是由于缺乏類似在陸生養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用的衛(wèi)生步驟，以及對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)控制不足引起的，這主要包括了對(duì)消毒過程、常規(guī)排空措施、每個(gè)容器的獨(dú)立設(shè)備以及各自獨(dú)立的成熟、產(chǎn)卵、孵化間等的控制。
盡管抗真菌藥如氟樂靈(trifluralin)、孔雀綠(Malachite green)以及抗生素的使用也有一定的成效，但是在生產(chǎn)過程中每6到8周就必須將魚池排空一次以除去逐漸耐藥的菌株這一措施對(duì)生產(chǎn)仍具有極大的破壞性。
自二十世紀(jì)四十年代以來，陸生動(dòng)物的飼料中就已經(jīng)開始加入抗生素了。其目的主要在于治療患病動(dòng)物、預(yù)防在同一封閉畜棚或雞舍飼養(yǎng)的動(dòng)物被感染、以及加快動(dòng)物的生長(zhǎng)速度。農(nóng)民通過每天在飼料中加入小劑量抗生素以使得家畜/禽保持健康?？股剡€同時(shí)提高了動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，在減少飼料的同時(shí)加快生長(zhǎng)速度，因而也大大提高了利潤(rùn)。這在密集養(yǎng)殖業(yè)中的好處尤為明顯。但是，在水產(chǎn)養(yǎng)殖，尤其是開放性設(shè)備中預(yù)防性使用抗生素卻不太可行。更為重要的是，抗生素的使用可能會(huì)促使耐藥微生物的產(chǎn)生。
正是出于這種對(duì)產(chǎn)生耐藥微生物的憂慮，美國及歐盟的管理機(jī)構(gòu)已經(jīng)開始禁止或打算禁止在動(dòng)物飼料中添加某些作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用的抗生素。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所占比例的提高以及養(yǎng)殖密度的增加，找出一種減少水生動(dòng)物感染性疾病發(fā)生的替代方法已經(jīng)迫在眉睫。本發(fā)明，即通過使用經(jīng)特殊處理的酵母細(xì)胞來提高水生動(dòng)物的免疫功能，就不失為一種解決之道。
將酵母作為營(yíng)養(yǎng)成分加入到水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料中在過去早已有過記載?，F(xiàn)舉例如下美國專利號(hào)第3,923,279號(hào)所公開的由海生或嗜鹽酵母(球擬酵母屬，紅酵母屬，酵母屬)組成的水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料，這些酵母是在含有廢糖蜜和一種無機(jī)氮化合物的海水中培養(yǎng)出來的。
美國專利號(hào)第5,047,250號(hào)所公開的將面包酵母和魚油混合加熱至80℃，制造出可以直接用于喂養(yǎng)魚苗、貝類及軟體動(dòng)物的飼料的生產(chǎn)方法。
美國專利號(hào)第5,158,788號(hào)所公開的將酵母細(xì)胞的外壁用化學(xué)物質(zhì)或酶水解，使其更易被軟體動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物及其幼體消化的飼料生產(chǎn)方法。
申請(qǐng)人在此引用上述材料并非意味著本發(fā)明與上述任何一種已有的生產(chǎn)工藝相關(guān)，也不意味著上述材料對(duì)于本發(fā)明的權(quán)利要求書能否取得專利具有決定性的影響。申請(qǐng)人所引用的所有內(nèi)容，包括聲明日期或方法描述及材料內(nèi)容都是基于申請(qǐng)人能夠得到的信息總結(jié)而來的，申請(qǐng)人并不對(duì)上述材料的聲明日期或內(nèi)容的正確性負(fù)責(zé)。
3.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種能夠作為飼料成分的生物組合物。該生物組合物能減少養(yǎng)殖魚類感染性疾病的發(fā)病率。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含大量活酵母細(xì)胞的生物組合物，所述的酵母細(xì)胞經(jīng)養(yǎng)殖魚類攝取后可以提高其免疫功能，并/或減少感染性疾病的發(fā)病率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述的生物組合物的生產(chǎn)方法，以及將其作為保持養(yǎng)殖魚類健康的飼料添加劑的使用方法。
具體而言，本發(fā)明的方法包含在一系列的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)酵母細(xì)胞以使其具有代謝活性，并能夠有效地刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)。該生物組合物最多可由四種不同的酵母細(xì)胞成分組成。其生產(chǎn)方法包括在活化條件下酵母細(xì)胞的培養(yǎng)、混合、干燥和包裝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞原料是商品化產(chǎn)品，并/或能夠?yàn)楣娝@得，例如但不限于釀酒酵母。
該生物組合物可直接用于喂養(yǎng)動(dòng)物，也可作為添加劑加入到常規(guī)動(dòng)物飼料中。包含本發(fā)明的活化酵母細(xì)胞的動(dòng)物飼料組合物也屬于本發(fā)明。
4.


圖1酵母細(xì)胞的活化和處理。1.酵母細(xì)胞培養(yǎng)物；2.容器；3.電磁場(chǎng)源；4.電極5.具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及一種能夠提高水生動(dòng)物免疫功能，并/或減少感染性疾病發(fā)病率的生物組合物。本發(fā)明提供了該生物組合物的生產(chǎn)方法，以及將其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑的使用方法。此外，包含該生物組合物的改良水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料也是本發(fā)明的內(nèi)容組成部分。
本發(fā)明的生物組合物包含酵母。與將酵母作為水生動(dòng)物飼料主要營(yíng)養(yǎng)成分的傳統(tǒng)方法不同的是，本發(fā)明是將酵母細(xì)胞作為一種補(bǔ)充物加入到飼料中，以達(dá)到替代或減少化學(xué)物質(zhì)以及抗生素用量的目的。這些酵母細(xì)胞以活菌的形式為水生動(dòng)物所攝取，一旦進(jìn)入到動(dòng)物的消化道，即能刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，達(dá)到提高動(dòng)物免疫功能，因而減少感染性疾病發(fā)病率的目的。該生物組合物的使用能減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)防病的總費(fèi)用，并且使得將飼料中的化學(xué)物質(zhì)及抗生素的用量最小化甚至零化成為可能。
盡管下列術(shù)語在本領(lǐng)域中已經(jīng)廣為人知，但為了便于理解，我們?nèi)詫?duì)這些術(shù)語進(jìn)行一些簡(jiǎn)要的解釋。
本文中，“飼料”是指用于給魚類提供營(yíng)養(yǎng)的，以及使得處于幼體、魚苗及發(fā)育中任何一階段的動(dòng)物保持正?；蚣铀偕L(zhǎng)的任何形態(tài)(固、液態(tài)均可)的物質(zhì)。
本文中，“水生動(dòng)物”是指各種海水及淡水魚類。其中包括(但不僅限于)分類學(xué)上軟骨魚綱及硬骨魚綱(具體而言即指硬骨魚)中的許多種類。商業(yè)養(yǎng)殖的長(zhǎng)須鯨就是一個(gè)很好的例子。其他例子還包括但不限于鯉魚科(如建鯉，白鏈，Hypophthalmichthys nobilis，草魚)，鮭科(鮭魚，trout)，Esocidae(梭子魚)，Percidae(河鱸)，洄科(鯰魚)，石斑，鱘魚，鳊魚，鰻魚及羅非魚等。
本文中，“免疫功能”是指水生動(dòng)物的特異性及非特異性免疫反應(yīng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面。動(dòng)物的免疫功能使其具有能在病原體感染后存活并/或恢復(fù)的能力，這些病原體主要包括細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、蠕蟲及其他寄生蟲等。免疫功能還使得動(dòng)物能夠預(yù)防感染，尤其是預(yù)防曾經(jīng)接觸過的病原體的感染。包括某些種類的血細(xì)胞(如無顆粒細(xì)胞，小顆粒細(xì)胞，大顆粒細(xì)胞)在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞都參與了動(dòng)物的免疫功能。關(guān)于魚類免疫系統(tǒng)的具體內(nèi)容請(qǐng)參見J.S.Stolen，D.P.Anderson，W.B.Van Muiswinkel(ed)等編著的《魚類免疫學(xué)》，以及1996年1月的《Elsevier Science》。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生物組合物，所述生物組合物包含至少一種酵母細(xì)胞。每種酵母成分包含一定數(shù)量的該種活酵母細(xì)胞，這些細(xì)胞都是在特定條件下培養(yǎng)出來的，從而具有提高水生動(dòng)物免疫功能的能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含最多四種酵母細(xì)胞成分。
根據(jù)本發(fā)明，在特定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)出來的酵母細(xì)胞能夠具有代謝活性，從而能夠有效地刺激和提高攝入該酵母細(xì)胞的動(dòng)物的免疫功能。發(fā)明者不受任何理論或機(jī)制的束縛，提出該培養(yǎng)條件將酵母細(xì)胞中某一個(gè)或一組基因激活，并/或使其表達(dá)擴(kuò)增，從而使得酵母細(xì)胞能高效地刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)。并且設(shè)想，由于在下文所描述的特定環(huán)境中培養(yǎng)出來的酵母細(xì)胞的基因產(chǎn)物大大增加，該產(chǎn)物與動(dòng)物免疫系統(tǒng)之間的相互作用也隨之大大增加。我們將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)使用該生物組合物的益處進(jìn)行論證。這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都表現(xiàn)出高度的抗病性，或是疾病后的快速恢復(fù)性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物組合物可直接用于喂養(yǎng)動(dòng)物，在另一個(gè)實(shí)施方案中，其也可作為添加劑加入到飼料中。對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，他們可采用多種方法將該生物組合物與飼料進(jìn)行混合。在特定的實(shí)施方案中，可在投放飼料前將本發(fā)明的酵母的肉湯培養(yǎng)物直接加入飼料，或是在投放飼料前加入酵母的干粉制劑，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，還可將該制劑與飼料的原料直接混合以使酵母細(xì)胞能夠完全地與飼料結(jié)合?？偠灾撋锝M合物可用各種不同的自動(dòng)化的機(jī)械方法加入和/或混入飼料。
該生物組合物的用量部分取決于飼料的配方和種類，并且可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)整。例如，該生物組合物與水生動(dòng)物飼料干重比例的有效范圍為0.1％到1％，優(yōu)選地為0.3％到0.8％，最優(yōu)選地為0.5％。該制劑還可與其他添加劑，例如但不限于化學(xué)物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等聯(lián)合使用或輪換使用，但這并不是必需的。
在5.1和5.2中我們將對(duì)本發(fā)明的四種酵母細(xì)胞成分及其制備方法進(jìn)行描述。在5.3中我們將具體描述包含至少一種上述酵母細(xì)胞的生物組合物的生產(chǎn)方法。
5.1.制備酵母細(xì)胞培養(yǎng)物本發(fā)明提供了能夠通過經(jīng)口攝取以提高水生動(dòng)物免疫功能的酵母細(xì)胞?？捎枚噙_(dá)四種不同的酵母細(xì)胞混合成該生物組合物。
所述的生物組合物的每種酵母細(xì)胞成分都是通過培養(yǎng)基培養(yǎng)而得到的，在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基必需置于交變電磁場(chǎng)中。在培養(yǎng)過程中，酵母孢子得以發(fā)芽，酵母細(xì)胞得以生長(zhǎng)和分裂。該過程既可以是批次生產(chǎn)，也可以是連續(xù)培養(yǎng)。在本文中，“交變電磁場(chǎng)”和“電磁場(chǎng)”為同義詞。本發(fā)明中所使用的電磁場(chǎng)可用多種不同的方法產(chǎn)生。圖1就是其中的一種方法的圖解。電磁波源產(chǎn)生具有合適頻率和場(chǎng)強(qiáng)的電磁場(chǎng)，該波源由一個(gè)或多個(gè)信號(hào)發(fā)生器組成，可產(chǎn)生出多種電磁波。我們推薦使用正弦波，頻率范圍為1500MHZ～15000MHZ。波源信號(hào)頻率范圍較窄的信號(hào)發(fā)生器也是可以使用的。如果需要的話，還可通過使用信號(hào)放大器以增加輸出信號(hào)和電磁場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)。
將電磁場(chǎng)加諸于細(xì)胞培養(yǎng)的方式也是多種多樣的，例如可將酵母細(xì)胞放置在與電磁波源相連的信號(hào)發(fā)射器附近，也可將信號(hào)發(fā)射器以電極的形式浸入培養(yǎng)基中(1)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一個(gè)金屬板電極置于非導(dǎo)電容器的底部，而另一個(gè)由導(dǎo)線或?qū)щ姽芙M成的電極以合適的方式置于容器中，以保證電磁場(chǎng)能量均勻地分布于整個(gè)培養(yǎng)基。以直立培養(yǎng)容器為例，導(dǎo)線或?qū)щ姽艿捻敳繎?yīng)置于距容器底部3～30cm的位置(即距容器底部的距離大約應(yīng)為容器高度的2～10％)。導(dǎo)線的數(shù)量取決于培養(yǎng)罐容量和導(dǎo)線直徑。舉例來說，對(duì)于一個(gè)10升或10升以下的培養(yǎng)罐來說，應(yīng)使用2至3根直徑為0.5～2mm的導(dǎo)線。對(duì)于一個(gè)容量在10升至100升之間的培養(yǎng)罐來說，導(dǎo)線或?qū)щ姽艿闹睆娇稍?.0～5.0mm之間。對(duì)于一個(gè)容量在100升至1000升之間的培養(yǎng)罐來說，導(dǎo)線或?qū)щ姽艿闹睆娇稍?.0～15.0mm之間。1000升以上的培養(yǎng)罐可使用直徑在20.0～25.0mm之間的導(dǎo)線或?qū)щ姽堋?br> 根據(jù)不同需要，本發(fā)明的生物組合物可使用的酵母種類包括酵母屬，念珠菌屬，Crebrothecium，地霉屬，漢遜酵母屬，克勒克酵母屬，油脂酵母屬，畢赤酵母屬，紅冬孢屬，紅酵母屬，球擬酵母屬，絲孢酵母屬，以及威克酵母屬。
這些非限制性酵母細(xì)胞株包括釀酒酵母Hansen株，ACCC2034，ACCC2035，ACCC2036，ACCC2037，ACCC2038，ACCC2039，ACCC2040，ACCC2041，ACCC2042，AS2.1，AS2.4，AS2.11，AS2.14，AS2.16，AS2.56，AS2.69，AS2.70，AS2.93，AS2.98，AS2.101，AS2.109，AS2.110，AS2.112，AS2.139，AS2.173，AS2.174，AS2.182，AS2.196，AS2.242，AS2.336，AS2.346，AS2.369，AS2.374，AS2.375，AS2.379，AS2.380，AS2.382，AS2.390，AS2.393，AS2.395，AS2.396，AS2.397，AS2.398，AS2.399，AS2.400，AS2.406，AS2.408，AS2.409，AS2.413，AS2.414，AS2.415，AS2.416，AS2.422，AS2.423，AS2.430，AS2.431，AS2.432，AS2.451，AS2.452，AS2.453，AS2.458，AS2.460，AS2.463，AS2.467，AS2.486，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.516，AS2.535，AS2.536，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，AS2.576，AS2.593，AS2.594，AS2.614，AS2.620，AS2.628，AS2.631，AS2.666，AS2.982，AS2.1190，AS2.1364，AS2.1396，IFFI 1001，IFFI 1002，IFFI1005，IFFI 1006，IFFI 1008，IFFI 1009，IFFI 1010，IFFI 1012，IFFI 1021，IFFI 1027，IFFI 1037，IFFI 1042，IFFI 1043，IFFI 1045，IFFI 1048，IFFI1049，IFFI 1050，IFFI 1052，IFFI 1059，IFFI 1060，IFFI 1063，IFFI 1202，IFFI 1203，IFFI 1206，IFFI 1209，IFFI 1210，IFFI 1211，IFFI 1212，IFFI1213，IFFI 1215，IFFI 1220，IFFI 1221，IFFI 1224，IFFI 1247，IFFI 1248，IFFI 1251，IFFI 1270，IFFI 1277，IFFI 1287，IFFI 1289，IFFI 1290，IFFI1291，IFFI 1292，IFFI 1293，IFFI 1297，IFFI 1300，IFFI 1301，IFFI 1302，IFFI 1307，IFFI 1308，IFFI 1309，IFFI 1310，IFFI 1311，IFFI 1331，IFFI1335，IFFI 1336，IFFI 1337，IFFI 1338，IFFI 1339，IFFI 1340，IFFI 1345，IFFI 1348，IFFI 1396，IFFI 1397，IFFI 1399，IFFI 1411，IFFI 1413；Saccharomyces cerevisiae Hansen Var.ellipsoideus(Hansen)Dekker，ACCC2043，AS2.2，AS2.3，AS2.8，AS2.53，AS2.163，AS2.168，AS2.483，AS2.541，AS2.559，AS2.606，AS2.607，AS2.611，AS2.612；Saccharomyces chevalieri Guillermond，AS2.131，AS2.213；Saccharomyces delbrueckii，AS2.285；Saccharomyces delbrueckiiLindner var.mongolicus Lodder et van Rij，AS2.209，AS2.1157；Saccharomyces exiguous Hansen，AS2.349，AS2.1158；Saccharomycesfermentati(Saito)Lodder et van Rij，AS2.286，AS2.343；Saccharomyceslogos van laer et Denamur ex Jorgensen，AS2.156，AS2.327，AS2.335；Saccharomyces mellis Lodder et Kreger Van Rij，AS2.195；Saccharomyces microellipsoides Osterwalder，AS2.699；Saccharomycesoviformis Osterwalder，AS2.100；Saccharomyces rosei(Guilliermond)Lodder et kreger van Rij，AS2.287；Saccharomyces rouxii Boutroux，AS2.178，AS2.180，AS2.370，AS2.371；Saccharomyces sake Yabe，ACCC2045；Candida arborea，AS2.566；Candida Krusei(Castellani)Berkhout，AS2.1045；Candida lambica(Lindner et Genoud)van.Uden etBuckley，AS2.1182；Candida lipolytica(Harrison)Diddens et Lodder，AS2.1207，AS2.1216，AS2.1220，AS2.1379，AS2.1398，AS2.1399，AS2.1400；Candida parapsilosis(Ashford)Langeron et Talice，AS2.590；Candida parapsilosis(Ashford)et Talice Var.intermedia VanRij et Verona，AS2.491；Candida pulcherriman(Lindner)Windisch，AS2.492；Candida rugousa(Anderson)Diddens et Loddeer，AS2.511，AS2.1367，AS2.1369，AS2.1372，AS2.1373，AS2.1377，AS2.1378，AS2.1384；Candida tropicalis(Castellani)Berkout，ACCC2004，ACCC2005，ACCC2006，AS2.164，AS2.402，AS2.564，AS2.565，AS2.567，AS2.568，AS2.617，AS2.1387；Candida utilis HennebergLodder et Kreger Van Rij，AS2.120，AS2.281，AS2.1180；Crebrotheciumashbyii(Guillermond)Routein，AS2.481，AS2.482，AS2.1197；Geotrichum candidum Link，ACCC2016，AS2.361，AS2.498，AS2.616，AS2.1035，AS2.1062，AS2.1080，AS2.1132，AS2.1175，AS2.1183；Hansenula anomala(Hansen)H et P sydow，ACCC2018，AS2.294，AS2.295，AS2.296，AS2.297，AS2.298，AS2.299，AS2.300，AS2.302，AS2.338，AS2.339，AS2.340，AS2.341，AS2.470，AS2.592，AS2.641，AS2.642，AS2.635，AS2.782，AS2.794；Hansenula arabitolgens Fang，AS2.887；Hansenula jadinii Wickerham，ACCC2019；Hansenulasaturnus(Klocker)H et P sydow，ACCC2020；Hansenula schneggii(Weber)Dekker，AS2.304；Hansenula subpelliculosa Bedford，AS2.738，AS2.740，AS2.760，AS2.761，AS2.770，AS2.783，AS2.790，AS2.798，AS2.866；Kloeckera apiculata(Reess emend.Klocker)Janke，ACCC2021，ACCC2022，ACCC2023，AS2.197，AS2.496，AS2.711，AS2.714；Lipomyces starkeyi Lodder et van Rij，ACCC2024，AS2.1390；Pichia farinosa(Lindner)Hansen，ACCC2025，ACCC2026，AS2.86，AS2.87，AS2.705，AS2.803；Pichia membranaefaciens Hansen，ACCC2027，AS2.89，AS2.661，AS2.1039；Rhodosporidium toruloidesBanno，ACCC2028；Rhodotorula glutinis(Fresenius)Harrison，ACCC2029，AS2.280，ACCC2030，AS2.102，AS2.107，AS2.278，AS2.499，AS2.694，AS2.703，AS2.704，AS2.1146；Rhodotorula minuta(Saito)Harrison，AS2.277；Rhodotorula rubar(Demme)Lodder，ACCC2031，AS2.21，AS2.22，AS2.103，AS2.105，AS2.108，AS2.140，AS2.166，AS2.167，AS2.272，AS2.279，AS2.282；Saccharomycescarlsbergensis Hansen，AS2.113，ACCC2032，ACCC2033，AS2.312，AS2.116，AS2.118，AS2.121，AS2.132，AS2.162，AS2.189，AS2.200，AS2.216，AS2.265，AS2.377，AS2.417，AS2.420，AS2.440，AS2.441，AS2.443，AS2.444，AS2.459，AS2.595，AS2.605，AS2.638，AS2.742，AS2.745，AS2.748，AS2.1042；Saccharomyces uvarum Beijjer，IFFI1023，IFFI 1032，IFFI 1036，IFFI 1044，IFFI 1072，IFFI 1205，IFFI 1207；Saccharomyces willianus Saccardo，AS2.5，AS2.7，AS2.119，AS2.152，AS2.293，AS2.381，AS2.392，AS2.434，AS2.614，AS2.1189；Saccharomyces sp.，AS2.311；Saccharomyces ludwigii Hansen，ACCC2044，AS2.243，AS2.508；Saccharomyces sinenses Yue，AS2.1395；Schizosaccharomyces octosporus Beijerinck，ACCC 2046，AS2.1148；Schizosaccharomyces pombe Linder，ACCC2047，ACCC2048，AS2.248，AS2.249，AS2.255，AS2.257，AS2.259，AS2.260，AS2.274，AS2.994，AS2.1043，AS2.1149，AS2.1178，IFFI 1056；Sporobolomyces roseusKluyver et van Niel，ACCC 2049，ACCC 2050，AS2.619，AS2.962，AS2.1036，ACCC2051，AS2.261，AS2.262；Torulopsis candida(Saito)Lodder，ACCC2052，AS2.270；Torulopsis famta(Harrison)Lodder et vanRij，ACCC2053，AS2.685；Torulopsis globosa(Olson et Hammer)Lodderet van Rij，ACCC2054，AS2.202；Torulopsis inconspicua Lodder et vanRij，AS2.75；Trichosporon behrendii Lodder et Kreger van Rij，ACCC2055，AS2.1193；Trichosporon capitatum Diddens et Lodder，ACCC2056，AS2.1385；Trichosporon cutaneum(de Beurm et al.)Ota，ACCC2057，AS2.25，AS2.570，AS2.571，AS2.1374；Wickerhamiafluoresens(Soneda)Soneda，ACCC2058，AS2.1388。在上述種類中，酵母屬類的酵母細(xì)胞通常是優(yōu)選的，其中又優(yōu)選釀酒酵母Hansen株。
本發(fā)明所使用的酵母細(xì)胞株都可從包括下列機(jī)構(gòu)在內(nèi)的各私立或公共實(shí)驗(yàn)室，以及公共細(xì)胞培養(yǎng)庫中獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209；和中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，中國科學(xué)院微生物研究所，北京市海淀區(qū)，郵政信箱2714，郵編100080。
盡管用純化的酵母細(xì)胞株來制備酵母細(xì)胞成分是優(yōu)選的，但本發(fā)明所使用的酵母細(xì)胞成分仍可從不同種類的酵母或同種不同株的酵母細(xì)胞混合培養(yǎng)而產(chǎn)生。所獲細(xì)胞成分的組成可通過本領(lǐng)域所熟知的酵母細(xì)胞鑒定技術(shù)進(jìn)行鑒定。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，本發(fā)明都使用標(biāo)準(zhǔn)的酵母細(xì)胞操作、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存技術(shù)。盡管無菌條件或清潔環(huán)境并不是必需的，我們?nèi)匀煌扑]在生產(chǎn)過程中能達(dá)到該兩者的要求。生產(chǎn)過程中還需要使用動(dòng)物體液及免疫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)操作技術(shù)，以及動(dòng)物免疫功能標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)。具體上述技術(shù)詳情請(qǐng)參閱《魚類免疫學(xué)技術(shù)》(J.S.Stolen(ed)，SOS出版社1995年2月出版)及《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(Coligan等(ed)，John Wiley & Sons，Inc.1991年出版)，上述文獻(xiàn)的全文已收入本申請(qǐng)作為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一種酵母細(xì)胞成分是在至少一個(gè)交變電磁場(chǎng)(EM)存在的環(huán)境下培養(yǎng)得到的，該電磁場(chǎng)頻率范圍為7630～7650MHZ。也可使用在規(guī)定范圍內(nèi)具有不同頻率、不同場(chǎng)強(qiáng)、或不同頻率及場(chǎng)強(qiáng)的一系列的電磁場(chǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。盡管只要頻率和場(chǎng)強(qiáng)在規(guī)定范圍之內(nèi)，電磁場(chǎng)數(shù)目可以任意決定，但優(yōu)選地將該酵母培養(yǎng)物置于總數(shù)為2～10(含)個(gè)的系列電磁場(chǎng)中，其可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式產(chǎn)生，其頻率可為7630～7650MHZ(含)中的任意整數(shù)值。
電磁場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)范圍為4.5～200mV/cm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，系列電磁場(chǎng)中前一個(gè)電場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)低于隨后的電磁場(chǎng)，這使得加諸于酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的場(chǎng)強(qiáng)可逐漸增大。比如，先將酵母細(xì)胞在較低場(chǎng)強(qiáng)(如60～80mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)32至84小時(shí)，再將其置于較高場(chǎng)強(qiáng)(如120～200mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)22至64小時(shí)。在改變電磁場(chǎng)時(shí)，并不需要更換培養(yǎng)容器，也不需要更換電磁波發(fā)生器及信號(hào)發(fā)射器。
開始培養(yǎng)時(shí)，可將1ml酵母細(xì)胞種液接種入100ml培養(yǎng)基中，使得酵母細(xì)胞密度在105/ml左右。在將該培養(yǎng)瓶置于電磁場(chǎng)中之前，應(yīng)先在25～35℃(優(yōu)選地在29℃)培養(yǎng)24至48小時(shí)。培養(yǎng)基中的氧氣濃度應(yīng)該在0.025～0.08mol/m3之間(優(yōu)選地在0.04mol/m3)。氧氣濃度的控制方法可為包括攪拌法和/或通入法在內(nèi)的本領(lǐng)域的任何常規(guī)方法。
所使用的培養(yǎng)基最優(yōu)選含有動(dòng)物血清及酵母細(xì)胞可同化營(yíng)養(yǎng)素的液態(tài)培養(yǎng)基。表1為培養(yǎng)該生物組合物第一種酵母細(xì)胞成分可使用的一個(gè)培養(yǎng)基范例。表1
在這里必須說明的是，表1中列出的培養(yǎng)基成分并不受任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)需要將培養(yǎng)基成分按比例增減，以對(duì)培養(yǎng)水平進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。
培養(yǎng)基中的碳源可為包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖、糖類似物及淀粉在內(nèi)的各種碳水化合物。碳水化合物的用量部分取決于培養(yǎng)基中的其他成分，但總的來說碳水化合物的量應(yīng)為培養(yǎng)基總重量的0.1％～5％，優(yōu)選為0.5％～2％，最優(yōu)選為0.8％左右。上述碳源既可單獨(dú)使用，也可數(shù)種合用。培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽可使用各種常用的鈉鹽、鈣鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。
魚類體液是將魚在銳緣(如竹刀)上刮擦，收集其產(chǎn)生的分泌物而獲得的。用10到20條重500～1000g的鯉魚可獲得10至20ml體液。用同樣的方法也可制得海魚的體液。如一條重700～1500g的比目魚可獲得10～20ml體液。在使用前，魚類體液可根據(jù)需要進(jìn)行混合、稀釋或是濃縮。
盡管酵母細(xì)胞在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)即可得到活化，但是也可以將其在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)一段時(shí)間(如一至數(shù)周)。培養(yǎng)結(jié)束后，作為本發(fā)明第一種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞可用多種不同的方法進(jìn)行收獲，并在0～4℃的條件下保存。收獲的酵母細(xì)胞也可進(jìn)行干燥并以干粉的形式進(jìn)行保存。
下文中的第6節(jié)即對(duì)以熱帶念珠菌Berkout株AS2.617作為第一種酵母細(xì)胞成分的培養(yǎng)過程進(jìn)行了詳細(xì)的說明。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞也是在至少一個(gè)交變電磁場(chǎng)存在的環(huán)境下培養(yǎng)得到的，該電磁場(chǎng)頻率范圍為6800～6825MHZ。也可使用在規(guī)定范圍內(nèi)具有不同頻率、不同場(chǎng)強(qiáng)、或不同頻率及場(chǎng)強(qiáng)的一系列的電磁場(chǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。盡管只要頻率和場(chǎng)強(qiáng)在規(guī)定范圍之內(nèi)，電磁場(chǎng)數(shù)目可以任意決定，但優(yōu)選地將該酵母培養(yǎng)物置于總數(shù)為2～10(含)個(gè)的系列電磁場(chǎng)中，其可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式產(chǎn)生，其頻率可為6800～6825MHZ(含)中的任意整數(shù)值。
電磁場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)范圍為5.5～215mV/cm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，系列電磁場(chǎng)中前一個(gè)電場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)低于隨后的電磁場(chǎng)，這使得加諸于酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的場(chǎng)強(qiáng)可逐漸增大。比如，先將酵母細(xì)胞在較低場(chǎng)強(qiáng)(如80～100mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)24至68小時(shí)，再將其置于較高場(chǎng)強(qiáng)(如130～215mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)20至64小時(shí)。在改變電磁場(chǎng)時(shí)，并不需要更換培養(yǎng)容器，也不需要更換電磁波發(fā)生器及信號(hào)發(fā)射器。
開始培養(yǎng)時(shí)，可將1ml酵母細(xì)胞種液接種入100ml培養(yǎng)基中，使得酵母細(xì)胞密度在105/ml左右。在將該培養(yǎng)瓶置于電磁場(chǎng)中之前，應(yīng)先在25～35℃培養(yǎng)24至48小時(shí)。培養(yǎng)過程中的氧氣濃度優(yōu)選在0.025～0.08mol/m3之間(優(yōu)選地在0.04mol/m3)。氧氣濃度的控制方法可為包括攪拌法和/或通入法在內(nèi)的本領(lǐng)域的任何常規(guī)方法。
培養(yǎng)最優(yōu)選地在含有動(dòng)物血清及酵母細(xì)胞可同化營(yíng)養(yǎng)素的液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行。表2為培養(yǎng)本發(fā)明的第二種酵母細(xì)胞成分可使用的一個(gè)培養(yǎng)基范例。表2
在這里必須說明的是，表2中列出的培養(yǎng)基成分并不受任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)需要將培養(yǎng)基成分按比例增減，以對(duì)培養(yǎng)水平進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。
培養(yǎng)基中的碳源可為包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖、糖類似物及淀粉在內(nèi)的各種碳水化合物。碳水化合物的用量部分取決于培養(yǎng)基中的其他成分，但總的來說碳水化合物的量應(yīng)為培養(yǎng)基總重量的0.1％～5％，優(yōu)選地為0.5％～2％，最優(yōu)選地為0.8％左右。上述碳源既可單獨(dú)使用，也可數(shù)種合用。培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽可使用各種常用的鈉鹽、鈣鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。魚類體液的制備方法如前述。
盡管酵母細(xì)胞在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)即可得到活化，但是也可以將其在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)一段時(shí)間(如一至數(shù)周)。培養(yǎng)結(jié)束后，作為本發(fā)明的第二種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞可用多種不同的方法進(jìn)行收獲，并在0～4℃的條件下保存。收獲的酵母細(xì)胞也可進(jìn)行干燥并以干粉的形式進(jìn)行保存。
下文中的第6節(jié)即對(duì)以釀酒酵母IFFI1345株作為第二種酵母細(xì)胞成分的培養(yǎng)過程進(jìn)行了詳細(xì)的說明。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第三種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞同樣是在至少一個(gè)交變電磁場(chǎng)存在的環(huán)境下培養(yǎng)得到的，該電磁場(chǎng)頻率范圍為8280～8305MHZ。也可使用在規(guī)定范圍內(nèi)具有不同頻率、不同場(chǎng)強(qiáng)、或不同頻率及場(chǎng)強(qiáng)的一系列的電磁場(chǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。盡管只要頻率和場(chǎng)強(qiáng)在規(guī)定范圍之內(nèi)，電磁場(chǎng)數(shù)目可以任意決定，但優(yōu)選地將該酵母培養(yǎng)物置于總數(shù)為2～10(含)個(gè)的系列電磁場(chǎng)中，其可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式產(chǎn)生，其頻率可為8280～8305MHZ(含)中的任意整數(shù)值。
電磁場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)范圍為6.5～220mV/cm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，系列電磁場(chǎng)中前一個(gè)電場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)低于隨后的電磁場(chǎng)，這使得加諸于酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的場(chǎng)強(qiáng)可逐漸增大。比如，先將酵母細(xì)胞在較低場(chǎng)強(qiáng)(如80～100mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)24至62小時(shí)，再將其置于較高場(chǎng)強(qiáng)(如140～220mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)24至64小時(shí)。在改變電磁場(chǎng)時(shí)，并不需要更換培養(yǎng)容器，也不需要更換電磁波發(fā)生器及信號(hào)發(fā)射器。
開始培養(yǎng)時(shí)，可將1ml酵母細(xì)胞種液接種入100ml培養(yǎng)基中，使得酵母細(xì)胞密度在105/ml左右。在將該培養(yǎng)瓶置于電磁場(chǎng)中之前，應(yīng)先在25～35℃培養(yǎng)24至48小時(shí)。優(yōu)選地，培養(yǎng)在氧氣濃度為0.025～0.08mol/m3之間(優(yōu)選為0.04mol/m3)進(jìn)行。氧氣濃度的控制方法可為包括攪拌法和/或通入法在內(nèi)的本領(lǐng)域的任何常規(guī)方法。
培養(yǎng)最優(yōu)選地是在含有動(dòng)物血清及酵母細(xì)胞可同化營(yíng)養(yǎng)素的液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行。表3為培養(yǎng)本發(fā)明的第三種酵母細(xì)胞成分可使用的一個(gè)培養(yǎng)基范例。表3
在這里必須說明的是，表3中列出的培養(yǎng)基成分并不受任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)需要將培養(yǎng)基成分按比例增減，以對(duì)培養(yǎng)水平進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。
培養(yǎng)基中的碳源可為包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖、糖類似物及淀粉在內(nèi)的各種碳水化合物。碳水化合物的用量部分取決于培養(yǎng)基中的其他成分，但總的來說碳水化合物的量應(yīng)為培養(yǎng)基總重量的0.1％～5％，優(yōu)選地為0.5％～2％，最優(yōu)選為0.8％左右。上述碳源既可單獨(dú)使用，也可數(shù)種合用。培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽可使用各種常用的鈉鹽、鈣鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。魚類體液的制備方法如前述。
盡管酵母細(xì)胞在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)即可得到活化，但是也可以將其在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)一段時(shí)間(如一至數(shù)周)。培養(yǎng)結(jié)束后，作為本發(fā)明的第三種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞可用多種不同的方法進(jìn)行收獲，并在0～4℃的條件下保存。收獲的酵母細(xì)胞也可進(jìn)行干燥并以干粉的形式進(jìn)行保存。
下文中的第6節(jié)即對(duì)以釀酒酵母AS2.11株作為第三種酵母細(xì)胞成分的培養(yǎng)過程進(jìn)行了詳細(xì)的說明。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第四種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞仍然是在至少一個(gè)交變電磁場(chǎng)存在的環(huán)境下培養(yǎng)得到的，該電磁場(chǎng)頻率范圍為8430～8450MHZ。也可使用在規(guī)定范圍內(nèi)具有不同頻率、不同場(chǎng)強(qiáng)、或不同頻率及場(chǎng)強(qiáng)的一系列的電磁場(chǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。盡管只要頻率和場(chǎng)強(qiáng)在規(guī)定范圍之內(nèi)，電磁場(chǎng)數(shù)目可以任意決定，但優(yōu)選地將該酵母培養(yǎng)物置于總數(shù)為2～10(含)個(gè)的系列電磁場(chǎng)中，其可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式產(chǎn)生，其頻率可為8430～8450MHZ(含)中的任意整數(shù)值。
電磁場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)范圍為8.5～250mV/cm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，系列電磁場(chǎng)中前一個(gè)電場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)低于隨后的電磁場(chǎng)，這使得加諸于酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的場(chǎng)強(qiáng)可逐漸增大。比如，先將酵母細(xì)胞在較低場(chǎng)強(qiáng)(如123mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)20至52小時(shí)，再將其置于較高場(chǎng)強(qiáng)(如180～250mV/cm)的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)20至68小時(shí)。在改變電磁場(chǎng)時(shí)，并不需要更換培養(yǎng)容器，也不需要更換電磁波發(fā)生器及信號(hào)發(fā)射器。
開始培養(yǎng)時(shí)，可將1ml酵母細(xì)胞種液接種入100ml培養(yǎng)基中，使得酵母細(xì)胞密度在105/ml左右。在將該培養(yǎng)瓶置于電磁場(chǎng)中之前，應(yīng)先在25～35℃培養(yǎng)24至48小時(shí)。優(yōu)選地，培養(yǎng)在氧氣濃度為0.025～0.08mol/m3之間(優(yōu)選為0.04mol/m3)進(jìn)行。氧氣濃度的控制方法可為包括攪拌法和/或通入法在內(nèi)的本領(lǐng)域的任何常規(guī)方法。
培養(yǎng)最優(yōu)選地是在含有動(dòng)物血清及酵母細(xì)胞可同化營(yíng)養(yǎng)素的液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行。表4為培養(yǎng)本發(fā)明的第四種酵母細(xì)胞成分可使用的一個(gè)培養(yǎng)基范例。表4
在這里必須說明的是，表4中列出的培養(yǎng)基成分并不受任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)需要將培養(yǎng)基成分按比例增減，以對(duì)培養(yǎng)水平進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)。
培養(yǎng)基中的碳源可為包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖、糖類似物及淀粉在內(nèi)的各種碳水化合物。碳水化合物的用量部分取決于培養(yǎng)基中的其他成分，但總的來說碳水化合物的量應(yīng)為培養(yǎng)基總重量的0.1％～5％，優(yōu)選地為0.5％～2％，最優(yōu)選地為0.8％左右。上述碳源既可單獨(dú)使用，也可數(shù)種合用。培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽可使用各種常用的鈉鹽、鈣鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。魚類體液的制備方法如前述。
盡管酵母細(xì)胞在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)即可得到活化，但是也可以將其在電磁場(chǎng)中培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)一段時(shí)間(如一至數(shù)周)。培養(yǎng)結(jié)束后，作為本發(fā)明的第四種酵母細(xì)胞成分的酵母細(xì)胞可用多種不同的方法進(jìn)行收獲，并在0～4℃的條件下保存。收獲的酵母細(xì)胞也可進(jìn)行干燥并以干粉的形式進(jìn)行保存。
下文中的第6節(jié)即對(duì)以釀酒酵母AS2.173株作為第四種酵母細(xì)胞成分的培養(yǎng)過程進(jìn)行了詳細(xì)的說明。
5.2酵母細(xì)胞的馴化培養(yǎng)在本發(fā)明的另一方面，若能在培養(yǎng)基中加入所需養(yǎng)殖動(dòng)物消化道提取物，則活化酵母細(xì)胞能夠更好地適應(yīng)和耐受該類動(dòng)物的消化道環(huán)境，因而也能夠取得更好的效果。
按照前文5.1中所述方法培養(yǎng)得到的活化酵母細(xì)胞可在表5列舉的成分所組成的培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步的混合培養(yǎng)。表5(每1000ml培養(yǎng)基)
各成分可根據(jù)需要進(jìn)行增減。
野棗汁的制備方法為按照每個(gè)研碎的野棗中加入5ml水的比例，將水與野棗混合，再進(jìn)行過濾得到的。用同樣的方法可制得野山楂汁。
魚類消化道提取物是將魚的消化道成分與蒸餾水混合而制成的。20至50條重1000～2500g的鯉魚可得到100～300g的消化道成分，可與1000至2000ml蒸餾水混合?；旌衔锝?jīng)過濾后儲(chǔ)存于4℃或-20℃條件下。
混合酵母細(xì)胞應(yīng)在一系列的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)48～96小時(shí)。根據(jù)所含酵母細(xì)胞株的不同，每個(gè)電磁場(chǎng)的頻率可在5.1中所列舉的4個(gè)頻率范圍中的任意一個(gè)之間。如果混合酵母細(xì)胞中含有所有4種酵母細(xì)胞成分，則下列4個(gè)電磁場(chǎng)頻率范圍都可供使用7630～7650MHZ、6800～6825MHZ、8280～8305MHZ、8430～8450MHZ。不同的電磁場(chǎng)可同時(shí)使用，也可序貫使用。其場(chǎng)強(qiáng)范圍為85mV/cm～320mV/cm。
在酵母細(xì)胞暴露于電磁場(chǎng)的同時(shí)，培養(yǎng)溫度應(yīng)在5～35℃之間循環(huán)，使得酵母細(xì)胞得以進(jìn)行孵化。舉例來說，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)可從35℃開始，培養(yǎng)溫度逐漸下降至5℃，然后再逐漸上升至35℃，開始另一個(gè)循環(huán)。每次循環(huán)大約耗時(shí)3小時(shí)，如此周而復(fù)始直到酵母細(xì)胞收獲。所收獲的酵母細(xì)胞可儲(chǔ)存在4℃的條件下。
5.3生物組合物的生產(chǎn)本發(fā)明的內(nèi)容還包括了包含上述酵母細(xì)胞成分的生物組合物的生產(chǎn)方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的生物組合物所包含的酵母細(xì)胞用5.1中所述的方法進(jìn)行活化，并用5.2中所述的方法進(jìn)行馴化適應(yīng)性培養(yǎng)。最優(yōu)選地，所述的生物組合物包含了所有4種酵母細(xì)胞成分。
如想大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明的生物組合物，細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)按照比例相應(yīng)放大。下文即以生產(chǎn)1000kg的所述的生物組合物為例對(duì)此進(jìn)行說明。
先將每一種經(jīng)活化和馴化的酵母細(xì)胞1000ml各接種于含有100kg淀粉、250升潔凈水(儲(chǔ)存于20～45℃的條件下)以及其他活化酵母細(xì)胞所需成分(即表1、2、3、4中所列舉的培養(yǎng)基成分20～40g)的培養(yǎng)基中。再將這4種培養(yǎng)基混合在一起，在35～37℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)還要使用頻率在5.1中所列舉的4個(gè)頻率范圍中的電磁場(chǎng)，電磁場(chǎng)的場(chǎng)強(qiáng)范圍為75～450mV/cm。這4種不同頻率的電磁場(chǎng)可同時(shí)使用，也可序貫使用。這個(gè)培養(yǎng)過程可持續(xù)48至96小時(shí)，或是持續(xù)到酵母細(xì)胞密度大于等于2×109/ml的時(shí)候。此時(shí)的酵母細(xì)胞應(yīng)儲(chǔ)存于15～20℃的條件下。如果不立即使用的話，則應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行干燥以便儲(chǔ)存。
制備好的酵母細(xì)胞和生物組合物可分兩步進(jìn)行干燥。第一步是將酵母細(xì)胞在溫度不超過65℃的干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，時(shí)間不超過10分鐘，這樣使得酵母細(xì)胞迅速進(jìn)入休眠期。第二步是將酵母細(xì)胞在溫度不超過70℃的干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，時(shí)間不超過30分鐘，以進(jìn)一步除去其中的水分。經(jīng)過這兩個(gè)步驟以后，水分含量應(yīng)小于5％。優(yōu)選地，在上述兩個(gè)干燥步驟中，溫度及時(shí)間應(yīng)保持恒定，以免酵母細(xì)胞失去活性和功能。經(jīng)干燥的酵母細(xì)胞冷卻至室溫后，即可進(jìn)行分裝。在分裝前，還可用分離器對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行篩選，以獲得所需大小的酵母細(xì)胞。
6.實(shí)施例在下文中，我們就實(shí)施例說明這種可作為飼料添加劑的生物組合物的生產(chǎn)方法。
該生物組合物包含以下四種酵母細(xì)胞成分熱帶念珠菌BerkoutAS2.617株，釀酒酵母IFFI1345株，AS2.11株，及AS2.173株。其中的任何一種酵母都具有加快魚類生長(zhǎng)速度，和/或改善魚類健康狀況的能力。比如中國鯉魚在食用了添加上述任一酵母的飼料后，平均體重均有了明顯的增長(zhǎng)。上述四種酵母細(xì)胞成分的具體制備方法如下將細(xì)胞密度為105/ml的AS2.617種液加入如圖1所示的容器中(2)，并加入按表1配制的培養(yǎng)基。首先，將酵母細(xì)胞在沒有電磁場(chǎng)存在的情況下，在28℃的條件下培養(yǎng)33小時(shí)。然后在不更換培養(yǎng)基、不改變培養(yǎng)溫度的前提下，按照下列順序?qū)⒔湍讣?xì)胞在8個(gè)不同的電磁場(chǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)頻率為7633MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為78mV/cm，時(shí)間為32小時(shí)；頻率為7635MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為78mV/cm，時(shí)間為32小時(shí)；頻率為7645MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為78mV/cm，時(shí)間為10小時(shí)；頻率為7649MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為78mV/cm，時(shí)間為10小時(shí)；頻率為7633MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為196mV/cm，時(shí)間為22小時(shí)；頻率為7635MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為196mV/cm，時(shí)間為22小時(shí)；頻率為7645MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為196mV/cm，時(shí)間為10小時(shí)；頻率為7649MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為196mV/cm，時(shí)間為10小時(shí)。接下來再按5.2中所述的方法對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行馴化培養(yǎng)，即將酵母細(xì)胞接種于含有魚類消化道提取物和野棗汁的培養(yǎng)基中，先后在頻率為7633MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為186mV/cm和頻率為7635MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為196mV/cm的兩個(gè)電磁場(chǎng)中分別培養(yǎng)22小時(shí)。在上述最后一個(gè)培養(yǎng)步驟完成后，酵母細(xì)胞可在24小時(shí)內(nèi)直接用于制備所述的生物組合物，也可按5.3中所述方法進(jìn)行干燥和儲(chǔ)存。
我們通過下述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)所制備的第一種酵母細(xì)胞成分對(duì)動(dòng)物的益處進(jìn)行了驗(yàn)證。選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國鯉魚，平均起始體重為85±5g/條。每次實(shí)驗(yàn)使用4個(gè)魚池，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，即一共使用了12個(gè)魚池。每個(gè)魚池中放養(yǎng)1600尾魚苗，每池魚苗總重量相差小于等于1％。魚池的容量為120m3，水深為2.5m。第一個(gè)魚池的魚苗(A組)的飼料中添加了按表6A配制的抗生素，且養(yǎng)殖用水中也用表6B中所列的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了處理。表6A含抗生素的魚飼料配方
表6B用于清潔水環(huán)境的傳統(tǒng)化學(xué)物質(zhì)
B組魚苗的飼料中加入了活化的AS2.617酵母細(xì)胞株。將干燥的活化酵母細(xì)胞與小于200孔的沸石粉按照109～1010個(gè)酵母細(xì)胞1g沸石粉的比例進(jìn)行混合，制成添加劑。然后在每995kg飼料中加入5kg添加劑，使添加劑占飼料重量的0.5％，即每1000kg飼料中含有5×1012～5×1013個(gè)酵母細(xì)胞。C組魚苗的飼料中同樣加入了按照B組所用方法制得的添加劑，但是該添加劑使用的AS2.617酵母細(xì)胞株是未經(jīng)活化的。D組魚苗僅用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其中既不加入抗生素，也不加入酵母細(xì)胞添加劑。B、C、D組魚苗所使用的魚池或養(yǎng)殖用水都沒有用表6B中所列舉的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行處理。經(jīng)過18個(gè)月的養(yǎng)殖后，4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況如表7所示。表7不同飼料喂養(yǎng)的魚產(chǎn)量比較
第二種酵母細(xì)胞成分的制備方法為將細(xì)胞密度為105/ml的IFFI1345種液加入如圖1所示的容器中(2)，并加入按表2配制的培養(yǎng)基。首先，將酵母細(xì)胞在沒有電磁場(chǎng)存在的情況下，在31℃的條件下培養(yǎng)32小時(shí)。然后在不更換培養(yǎng)基、不改變培養(yǎng)溫度的前提下，按照下列順序?qū)⒔湍讣?xì)胞在8個(gè)不同的電磁場(chǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)頻率為6802MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為86mV/cm，時(shí)間為24小時(shí)；頻率為6807MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為86mV/cm，時(shí)間為24小時(shí)；頻率為6815MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為86mV/cm，時(shí)間為10小時(shí)；頻率為6823MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為86mV/cm，時(shí)間為10小時(shí)；頻率為6802MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為215mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)；頻率為6807MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為215mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)；頻率為6815MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為215mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)；頻率為6823MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為215mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)。接下來再按5.2中所述的方法對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行馴化培養(yǎng)，即將酵母細(xì)胞接種于含有魚類消化道提取物、野棗汁及野山楂汁的培養(yǎng)基中，先后在頻率為6802MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為215mV/cm和頻率為6807MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為215mV/cm的兩個(gè)電磁場(chǎng)中分別培養(yǎng)16小時(shí)。在上述最后一個(gè)培養(yǎng)步驟完成后，酵母細(xì)胞可在24小時(shí)內(nèi)直接用于制備所述的生物組合物，也可按5.3中所述方法進(jìn)行干燥和儲(chǔ)存。
我們通過下述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)所制備的第二種酵母細(xì)胞成分對(duì)動(dòng)物的益處進(jìn)行了驗(yàn)證。選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國鯉魚，平均起始體重為85±5g/條。每次實(shí)驗(yàn)使用4個(gè)魚池，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，即一共使用了12個(gè)魚池。每個(gè)魚池中放養(yǎng)1600尾魚苗，每池魚苗總重量相差小于等于1％。魚池的容量為120m3，水深為2.5m。第一個(gè)魚池的魚苗(A組)的飼料中添加了按表6A配制的抗生素，且養(yǎng)殖用水中也用表6B中所列的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了處理。
B組魚苗的飼料中加入了活化的IFFI1345酵母細(xì)胞株。將干燥的活化酵母細(xì)胞與小于200孔的沸石粉按照1×109個(gè)酵母細(xì)胞1g沸石粉的比例進(jìn)行混合，制成添加劑。然后在每995kg飼料中加入5kg添加劑，使添加劑占飼料重量的0.5％。C組魚苗的飼料中同樣加入了按照B組所用方法制得的添加劑，但是該添加劑使用的IFFI1345酵母細(xì)胞株是未經(jīng)活化的。D組魚苗僅用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其中既不加入抗生素，也不加入酵母細(xì)胞添加劑。經(jīng)過18個(gè)月的養(yǎng)殖后，4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況如表8所示。表8不同飼料喂養(yǎng)的魚產(chǎn)量比較
第三種酵母細(xì)胞成分的制備方法為將細(xì)胞密度為105/ml的AS2.11種液加入如圖1所示的容器中(2)，并加入按表3配制的培養(yǎng)基。首先，將酵母細(xì)胞在沒有電磁場(chǎng)存在的情況下，在29℃的條件下培養(yǎng)26小時(shí)。然后在不更換培養(yǎng)基、不改變培養(yǎng)溫度的前提下，按照下列順序?qū)⒔湍讣?xì)胞在8個(gè)不同的電磁場(chǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)頻率為8282MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為97mV/cm，時(shí)間為12小時(shí)；頻率為8290MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為97mV/cm，時(shí)間為12小時(shí)；頻率為8295MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為97mV/cm，時(shí)間為19小時(shí)；頻率為8301MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為97mV/cm，時(shí)間為19小時(shí)；頻率為8282MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為184mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)；頻率為8290MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為184mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)；頻率為8295MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為184mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)；頻率為8301MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為184mV/cm，時(shí)間為16小時(shí)。接下來再按5.2中所述的方法對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行馴化培養(yǎng)，即將酵母細(xì)胞接種于含有魚類消化道提取物、野棗汁及野山楂汁的培養(yǎng)基中，先后在頻率為8295MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為184mV/cm和頻率為8301MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為184mV/cm的兩個(gè)電磁場(chǎng)中分別培養(yǎng)16小時(shí)。在上述最后一個(gè)培養(yǎng)步驟完成后，酵母細(xì)胞可在24小時(shí)內(nèi)直接用于制備所述的生物組合物，也可按5.3中所述方法進(jìn)行干燥和儲(chǔ)存。
我們通過下述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)所制備的第三種酵母細(xì)胞成分對(duì)動(dòng)物的益處進(jìn)行了驗(yàn)證。選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國鯉魚，平均起始體重為85±5g/條。每次實(shí)驗(yàn)使用4個(gè)魚池，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，即一共使用了12個(gè)魚池。每個(gè)魚池中放養(yǎng)1600尾魚苗，每池魚苗總重量相差小于等于1％。魚池的容量為120m3，水深為2.5m。第一個(gè)魚池的魚苗(A組)的飼料中添加了按表6A配制的抗生素，且養(yǎng)殖用水中也用表6B中所列的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了處理。
B組魚苗的飼料中加入了活化的AS2.11酵母細(xì)胞株。將干燥的活化酵母細(xì)胞與小于200孔的沸石粉按照1×109個(gè)酵母細(xì)胞1g沸石粉的比例進(jìn)行混合，制成添加劑。然后在每995kg飼料中加入5kg添加劑，使添加劑占飼料重量的0.5％。C組魚苗的飼料中同樣加入了按照B組所用方法制得的添加劑，但是該添加劑使用的AS2.11酵母細(xì)胞株是未經(jīng)活化的。D組魚苗僅用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其中既不加入抗生素，也不加入酵母細(xì)胞添加劑。經(jīng)過18個(gè)月的養(yǎng)殖后，4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況如表9所示。表9不同飼料喂養(yǎng)的魚產(chǎn)量比較
第四種酵母細(xì)胞成分的制備方法為將細(xì)胞密度為105/ml的AS2.173種液加入如圖1所示的容器中(2)，并加入按表4配制的培養(yǎng)基。首先，將酵母細(xì)胞在沒有電磁場(chǎng)存在的情況下，在32℃的條件下培養(yǎng)18小時(shí)。然后在不更換培養(yǎng)基、不改變培養(yǎng)溫度的前提下，按照下列順序?qū)⒔湍讣?xì)胞在8個(gè)不同的電磁場(chǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)頻率為8433MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為123mV/cm，時(shí)間為13小時(shí)；頻率為8438MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為123mV/cm，時(shí)間為13小時(shí)；頻率為8440MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為123mV/cm，時(shí)間為13小時(shí)；頻率為8448MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為123mV/cm，時(shí)間為13小時(shí)；頻率為8433MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為226mV/cm，時(shí)間為17小時(shí)；頻率為8438MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為226mV/cm，時(shí)間為17小時(shí)；頻率為8440MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為226mV/cm，時(shí)間為17小時(shí)；頻率為8448MHZ，場(chǎng)強(qiáng)為226mV/cm，時(shí)間為17小時(shí)。接下來再按5.2中所述的方法對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行馴化培養(yǎng)，即將酵母細(xì)胞接種于含有魚類消化道提取物、野棗汁及野山楂汁的培養(yǎng)基中，先后在頻率為8433MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為226mV/cm和頻率為8438MHZ、場(chǎng)強(qiáng)為226mV/cm的兩個(gè)電磁場(chǎng)中分別培養(yǎng)16小時(shí)。在上述最后一個(gè)培養(yǎng)步驟完成后，酵母細(xì)胞可在24小時(shí)內(nèi)直接用于制備所述的生物組合物，也可按5.3中所述方法進(jìn)行干燥和儲(chǔ)存。
我們通過下述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)所制備的第四種酵母細(xì)胞成分對(duì)動(dòng)物的益處進(jìn)行了驗(yàn)證。選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國鯉魚，平均起始體重為85±5g/條。每次實(shí)驗(yàn)使用4個(gè)魚池，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，即一共使用了12個(gè)魚池。每個(gè)魚池中放養(yǎng)1600尾魚苗，每池魚苗總重量相差小于等于1％。魚池的容量為120m3，水深為2.5m。第一個(gè)魚池的魚苗(A組)的飼料中添加了按表6A配制的抗生素，且養(yǎng)殖用水中也用表6B中所列的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了處理。
B組魚苗的飼料中加入了活化的AS2.173酵母細(xì)胞株。將干燥的活化酵母細(xì)胞與小于200孔的沸石粉按照1×109個(gè)酵母細(xì)胞1g沸石粉的比例進(jìn)行混合，制成添加劑。然后在每995kg飼料中加入5kg添加劑，使添加劑占飼料重量的0.5％。C組魚苗的飼料中同樣加入了按照B組所用方法制得的添加劑，但是該添加劑使用的AS2.173酵母細(xì)胞株是未經(jīng)活化的。D組魚苗僅用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其中既不加入抗生素，也不加入酵母細(xì)胞添加劑。經(jīng)過18個(gè)月的養(yǎng)殖后，4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況如表10所示。表10不同飼料喂養(yǎng)的魚產(chǎn)量比較
為了進(jìn)一步提高酵母細(xì)胞在體內(nèi)的活性，還需將按上述方法制備的四種活化酵母細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的馴化。將四種酵母細(xì)胞培養(yǎng)基各取10ml(細(xì)胞密度均為4×106/ml)，加入至500ml按表5配制的培養(yǎng)基中去。將該混合物(13)置于如圖2所示的容器(11)中，并在四個(gè)具有不同頻率范圍的電磁場(chǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)。這四個(gè)電磁場(chǎng)的頻率范圍分別為7630～7650MHZ、6800～6825MHZ、8280～8305MHZ、8430～8450MHZ，其場(chǎng)強(qiáng)范圍均為260mV/cm～320mV/cm。將該混合物在孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)，孵箱溫度設(shè)定為在5℃、室溫、35℃之間進(jìn)行循環(huán)。每次循環(huán)歷時(shí)3小時(shí)，周而復(fù)始直至48小時(shí)結(jié)束為止。然后再將活化酵母細(xì)胞進(jìn)行分離，并在0～4℃的條件下儲(chǔ)存。
將四種干燥的活化酵母細(xì)胞與小于200孔的沸石粉按照1×109個(gè)酵母細(xì)胞1g沸石粉的比例進(jìn)行混合，制成含有四種酵母細(xì)胞成分的生物添加劑。然后在每995kg飼料中加入5kg該種添加劑，使添加劑占飼料重量的0.5％。這次選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國魚類中的一種，平均起始魚體長(zhǎng)度為1.6±0.1cm。每次實(shí)驗(yàn)使用4個(gè)魚池，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，即一共使用了12個(gè)魚池。每個(gè)魚池中放養(yǎng)1600尾魚苗，每池魚苗總重量相差小于等于1％。魚池的容量為120m3，水深為2.5m。第一個(gè)魚池的魚苗(A組)的飼料中添加了按表6A配制的抗生素，且養(yǎng)殖用水中也用表6B中所列的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了處理。
B組魚苗的飼料中加入了按上述方法制備的生物添加劑。C組魚苗的飼料中同樣加入了按照B組所用方法制得的添加劑，但是該添加劑使用的酵母細(xì)胞是未經(jīng)活化的。D組魚苗僅用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其中既不加入抗生素，也不加入酵母細(xì)胞添加劑。經(jīng)過18個(gè)月的養(yǎng)殖后，4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況如表11所示。表11不同飼料喂養(yǎng)的魚產(chǎn)量比較
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的生物組合物一種極其有效的飼料添加劑，其作用包括使養(yǎng)殖動(dòng)物保持健康，以及使養(yǎng)殖動(dòng)物在被感染后盡快恢復(fù)。
本發(fā)明并不局限于上述特定的實(shí)施方案的范圍內(nèi)，上述實(shí)施方案僅僅是為了能夠?qū)Ρ景l(fā)明的生產(chǎn)過程進(jìn)行詳細(xì)地說明，而具有相等功能的生產(chǎn)方法和成分也是屬于本發(fā)明內(nèi)容的一部分。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前文的描述和附圖，就能夠根據(jù)各自需要找到很多不同的調(diào)整方法。這些調(diào)整都應(yīng)在本文所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生物組合物，其包含至少一種下列酵母細(xì)胞成分(a) 第一種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在7630～7650MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在4.5～200mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞；(b) 第二種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在6800～6825MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在5.5～215mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞；(c) 第三種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在8280～8305MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在6.5～220mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞；以及(d) 第四種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在8430～8450MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在8.5～250mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的生物組合物，其包含(a)、(b)、(c)和(d)的酵母細(xì)胞成分。
3.權(quán)利要求1或2的生物組合物，其中所述的酵母細(xì)胞為酵母屬或念珠菌屬細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1或2的生物組合物，其中所述的酵母細(xì)胞成分為釀酒酵母或熱帶念珠菌細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1或2的生物組合物，其中所述的酵母細(xì)胞為干燥酵母細(xì)胞。
6.一種動(dòng)物飼料組合物，其包含權(quán)利要求1或2的生物組合物及水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。
7.權(quán)利要求6的動(dòng)物飼料組合物，其中所述的生物組合物進(jìn)一步包含沸石粉，所述的沸石粉的比例為大約每109個(gè)酵母細(xì)胞中添加1g沸石粉。
8.權(quán)利要求7的動(dòng)物飼料組合物，其中權(quán)利要求1或2的生物組合物和沸石粉所占的重量比例為0.5％。
9.制備生物組合物的方法，所述方法包含在一個(gè)或一系列的頻率在7630～7650MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在4.5～200mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中進(jìn)一步包含在一個(gè)或一系列的電磁場(chǎng)中，用包含魚類消化道提取物、野山楂汁和野棗汁的培養(yǎng)基培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
11.制備生物組合物的方法，所述方法包含在一個(gè)或一系列的頻率在6800～6825MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在5.5～215mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中進(jìn)一步包含在一個(gè)或一系列的電磁場(chǎng)中，用包含魚類消化道提取物、野山楂汁和野棗汁的培養(yǎng)基培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
13.制備生物組合物的方法，所述方法包含在一個(gè)或一系列的頻率在8280～8305MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在6.5～220mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中進(jìn)一步包含在一個(gè)或一系列的電磁場(chǎng)中，用包含魚類消化道提取物、野山楂汁和野棗汁的培養(yǎng)基培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
15.制備生物組合物的方法，所述方法包含在一個(gè)或一系列的頻率在8430～8450MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在8.5～250mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中進(jìn)一步包含在一個(gè)或一系列的電磁場(chǎng)中，用包含魚類消化道提取物、野山楂汁和野棗汁的培養(yǎng)基培養(yǎng)大量的酵母細(xì)胞。
17.生產(chǎn)魚飼料組合物的方法，所述的方法包含(a)培養(yǎng)權(quán)利要求1的一種或多種酵母細(xì)胞成分，(b)將(a)得到的酵母細(xì)胞成分進(jìn)行干燥，以及(c)將干燥的酵母細(xì)胞與沸石粉及魚飼料進(jìn)行混合。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的干燥步驟包含(i)將酵母細(xì)胞在不超過65℃的條件下干燥一段時(shí)間，以使所述酵母細(xì)胞進(jìn)入休眠期；以及(ii)將酵母細(xì)胞在不超過70℃的條件下干燥一段時(shí)間，以使所述酵母細(xì)胞中所含水分少于5％。
19.減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中感染性疾病發(fā)生率的方法，其包含使用魚飼料組合物喂養(yǎng)魚一段時(shí)間，所述的魚飼料組合物包含至少一種下列酵母細(xì)胞成分(a)第一種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在7630～7650MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在4.5～200mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞；(b)第二種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在6800～6825MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在5.5～215mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞；(c)第三種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在8280～8305MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在6.5～220mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞；以及(d)第四種酵母細(xì)胞成分，其包含在一個(gè)或一系列的頻率在8430～8450MHZ之間、場(chǎng)強(qiáng)在8.5～250mV/cm之間的電磁場(chǎng)中培養(yǎng)而制備的大量酵母細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中的動(dòng)物飼料組合物包含(a)、(b)、(c)和(d)的酵母細(xì)胞成分和沸石粉。
21.權(quán)利要求19的方法，其中的酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
22.權(quán)利要求19的方法，其中酵母細(xì)胞成分和沸石粉占所述動(dòng)物飼料組合物的重量比例為0.5％。
23.權(quán)利要求1或2的組合物，其中用于制備第一種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含熱帶念珠菌Berkout AS2.617株的細(xì)胞，其中用于制備第二種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含釀酒酵母IFFI1345株的細(xì)胞，其中用于制備第三種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含釀酒酵母AS2.11株的細(xì)胞，以及其中用于制備第四種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含釀酒酵母AS2.173株的細(xì)胞。
24.權(quán)利要求6的動(dòng)物飼料組合物，其中用于制備第一種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含熱帶念珠菌Berkout AS2.617株的細(xì)胞，其中用于制備第二種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含釀酒酵母IFFI1345株的細(xì)胞，其中用于制備第三種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含釀酒酵母AS2.11株的細(xì)胞，以及其中用于制備第四種酵母細(xì)胞成分的大量酵母細(xì)胞包含釀酒酵母AS2.173株的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的主要涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中所使用的魚飼料添加劑。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)包含酵母細(xì)胞的生物組合物的方法，所述的酵母細(xì)胞具有改善養(yǎng)殖魚類免疫功能的作用。本發(fā)明還涉及該生物組合物的生產(chǎn)方法，及將其作為飼料添加劑的使用方法。
文檔編號(hào)C12N13/00GK1475136SQ0314913
公開日2004年2月18日 申請(qǐng)日期2003年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月18日
發(fā)明者張令玉 申請(qǐng)人:歐亞生物科技有限公司