專利名稱：植物抗黃矮病關(guān)鍵蛋白TiRB及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物抗黃矮病關(guān)鍵蛋白TiRB及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥黃矮病是由大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf virus, BYDV)弓丨起的小麥重要病害，小麥一旦感染即無(wú)藥可治，造成小麥減產(chǎn) 和品質(zhì)下降，因此黃矮病也稱為“小麥黃色瘟疫”及“小麥癌癥”。黃矮病在世界各麥區(qū)均有發(fā)生。因小麥黃矮病危害，1978年美國(guó)小麥減產(chǎn)60% 80%，1988年德國(guó)冬小麥減產(chǎn)40%，每年澳大利亞因黃矮病損失約3000萬(wàn)美元。新西蘭、阿根廷、土耳其、突尼斯、匈牙利等40多個(gè)國(guó)家均有黃矮病的發(fā)生。我國(guó)的西北、華北部分地區(qū)和東北曾于1966年、1970年、1973年、1978年、1980年、1987年、1999年大面積發(fā)生黃矮病，僅1999年陜西、山西等麥區(qū)就因黃矮病造成小麥減產(chǎn)20% 30%，個(gè)別嚴(yán)重麥區(qū)減產(chǎn)超過(guò)50%，小麥產(chǎn)量損失達(dá)數(shù)億公斤。近年來(lái)，由于暖冬等氣候變化，傳播大麥黃矮病毒的麥蟲牙在我國(guó)日益嚴(yán)重，小麥黃矮病已遍及陜西、山西、甘肅、四川、寧夏、內(nèi)蒙古、河北和江蘇等多個(gè)小麥產(chǎn)區(qū)。因此，黃矮病的防治對(duì)于保證小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展非常重要，選育抗黃矮病小麥新品種，是防治該病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。大麥黃矮病毒由蚜蟲介導(dǎo)和傳播。根據(jù)病毒血清型及其介體蚜蟲的種類,大麥黃矮病毒被分為BYDV-PAV株系、BYDV-MAV株系、BYDV-GAV株系、BYDV-GPA株系、CYDV-RPV株系、SGV株系和RMV株系。BYDV-GAV株系為我國(guó)主流株系。優(yōu)良可利用的抗病基因是抗病育種的前提。迄今為止，小麥初級(jí)基因庫(kù)中尚未發(fā)現(xiàn)真正有效的抗性基因。中間偃麥草(小麥近緣植物)高抗或免疫大麥黃矮病毒的多個(gè)株系，已作為抗源得到了應(yīng)用和深入研究。中間偃麥草7Ai#l染色體長(zhǎng)臂上攜帶I個(gè)抗黃矮病基因Bdv2。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家利用中國(guó)春ph突變體誘導(dǎo)部分同源染色體配對(duì)和組織培養(yǎng)兩條途徑，將攜帶抗黃矮病基因Bdv2的7Ai#l染色體長(zhǎng)臂端部片段易位到小麥染色體7D長(zhǎng)臂端部，成功地選育、鑒定出一批抗黃矮病的小麥-中間偃麥草T7D · 7Ai#lL易位系，包括 YW642 (H960642)、YW443、YW243 以及 TC5-TC10、TC14 等(Banks, P.，Larkin，P.，Barianaj H.，Lagudahj E.，Appels, R.，Waterhouse, P.，Brettellj R.，Chen, X.，XujH. , Xinj Z. , Qian, Y. , Zhou, M. , Cheng, Z. , and Zhou, G. The use of cell culture forsub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance fromThinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995，38:395-405 ;張?jiān)銎G，馬有志，辛志勇等，1998，應(yīng)用基因組原位雜交技術(shù)鑒定抗黃矮病小麥新種質(zhì)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，31 (3) :1-4;張?jiān)銎G，辛志勇，馬有志等，Mapping of a BYDV resistance gene from Thintermediumintermedium in wheat background by molecular markers, Science in China(SeriesC)，1999,42(6) :663-668 ;張?jiān)銎G、辛志勇、陳孝等，抗黃矮病小麥新品系YW443的分子細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定，遺傳學(xué)報(bào)，2000，27 (7) :614 620 ;謝皓，陳孝，張?jiān)銎G，辛志勇，林志珊，杜麗璞，馬有志，徐惠君，抗黃矮病小麥新品系YW243的選育和細(xì)胞分子生物學(xué)鑒定，作物學(xué)報(bào)，2000，26 (6) :687-691 ;Xin，Z.，Zhang, Z.，Chen, X.，Linj Ζ·，Ma，Y.，Xu，Η.，Banks,P.，and Larkin,P. Development and characterization of common wheat-Thinopyrumntermedium translocation lines with resistance to barley yellow dwarf virus.Euphytica. 2001,119:161 - 165)，發(fā)現(xiàn)攜帶抗黃矮病基因Bdv2的中間偃麥草染色體7Ai#l長(zhǎng)臂(7Ai#lL)端部小片段易位到小麥染色體7D長(zhǎng)臂端部(張?jiān)銎G，辛志勇，馬有志等，Mapping of a BYDV resistance gene from Thintermedium intermedium in wheatbackground by molecular markers, Science in China(Series C)，1999，42(6) :663-68 ;Banks, P. , Larkin, P. , Bariana, H. , Lagudah, E. , Appels, R. , Waterhouse, P. , BrettelI,R. , Chen, X. , Xu, H. , Xin, Z. , Qian, Y. , Zhou, M. , Cheng, Z. , and Zhou, G. The use of cellculture for sub-chromosomal introgressions of barley yellow dwarf virusresistance from Thinopyrum intermedium to wheat. Genome. 1995, 38:395-405)。石開究發(fā)現(xiàn)，攜帶抗黃矮病基因Bdv2的小麥-中間偃麥草易位系YW642、YW443、YW243、TC14等高抗大麥黃矮病毒，理論上說(shuō)，這些易位系應(yīng)該可以做為抗黃矮病小麥育種中易于利用的抗性種質(zhì)。然而，這些易位系并沒(méi)有成功地育成多少抗黃矮病小麥新品種，可能與攜帶抗黃矮病基因Bdv2的染色體7Ai-#lL片段存在著不利的連鎖累贅有關(guān)。因此，迫切需要從抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系YW642等材料中分離克隆出7Ai-lL上抗黃矮病的重要基因，研究其抗性作用分子機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程育種，以高效地培育抗黃矮病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物抗黃矮病關(guān)鍵蛋白TiRB及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，來(lái)自抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系YW642,從根源上來(lái)說(shuō)來(lái)自中間偃麥草，命名為TiRB蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物黃矮病抗性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物黃矮病抗性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 1)序列表中序列2自5’端第87至第2987位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2自5’端第87至第2990位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列2所示的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子； 5)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到黃矮病抗性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物優(yōu)選為小麥。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將抑制權(quán)利要求2或3所述基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入目的植物中，得到黃矮病抗性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述目的植物為含有權(quán)利要求2或3所述基因的植物。
8.如權(quán)利要求5至7中任一所述的方法,其特征在于所述黃矮病是由黃矮病病毒BYDV-GAV株系引起的。
9.用于抑制權(quán)利要求2或3所示基因表達(dá)的干擾載體，是將TiRB-RIF片段和TiRB-RIR片段插入出發(fā)載體得到的重組質(zhì)粒；所述TiRB-RIF片段為序列表的序列3自5’末端第I至628位核苷酸所示的雙鏈DNA片段，所述TiRB-RIR片段為序列表的序列3自5’末端第783至1170位核苷酸所示的雙鏈DNA片段。
10.如權(quán)利要求9所述的干擾載體，其特征在于所述干擾載體為將序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子插入pAHC25載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物抗黃矮病關(guān)鍵蛋白TiRB及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物黃矮病抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。將TiRB基因?qū)胄←?，該基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)黃矮病的抗性明顯提高，抗病小麥中所述TiRB基因表達(dá)抑制則使該植株喪失對(duì)黃矮病的抗性，說(shuō)明所述TiRB基因是植物黃矮病抗性關(guān)鍵蛋白。植物黃矮病抗性關(guān)鍵蛋白TiRB及其編碼基因可用于提高植物的黃矮病抗性，對(duì)植物育種具有重大價(jià)值。本發(fā)明具有重要的理論及實(shí)際意義，在植物的遺傳改良中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102863523SQ20121035863
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者張?jiān)銎G, 汪信東, 徐惠君, 杜麗璞, 辛志勇 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所