本發(fā)明屬于日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法。

背景技術(shù)：

日本血吸蟲是一種重要的人獸共患性疾病，是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，主要流行于熱帶和亞熱帶的76個國家及地區(qū)，全球血吸蟲感染人數(shù)超2億人，6億人口受其感染威脅。全國共有453個血吸蟲病流行縣(市、區(qū))，總?cè)丝?.52億人；共有29980個流行村，總?cè)丝?861.30萬人。全國453個流行縣(市、區(qū))中，343個(占75.72％)達(dá)到血吸蟲病傳播阻斷標(biāo)準(zhǔn)；110個(占24.28％)達(dá)到傳播控制標(biāo)準(zhǔn)。2015年全國推算血吸蟲病77194例，現(xiàn)存晚期血吸蟲病人30843例。

日本血吸蟲病的診斷包括病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)三大方法，而檢測日本血吸蟲的特異的DNA片段與病原學(xué)檢測具有同樣的確診價值。病原體基因組學(xué)給病原體分子生物學(xué)檢測帶來了新的工作方法和思路。日本血吸蟲全基因組測序已經(jīng)完成，蛋白編碼基因13469個，對尾蚴蛋白質(zhì)組的比較分析，共鑒定出1181個蛋白，將有力地促進(jìn)與這一重要傳染病相關(guān)的診斷、治療和預(yù)防的研究。

傳統(tǒng)的血吸蟲病原學(xué)檢測方法包括改良加藤法、尼龍袋集卵法、毛蚴孵化法與直腸鏡活組織檢查法，雖然都是可以確診的方法，但是由于受到諸多因素的限制，比較耗時費(fèi)力、且存在一定的漏檢率。免疫學(xué)方法包括能夠檢測抗體的環(huán)卵沉淀試驗(yàn)、IHA、ELISA、免疫印記技術(shù)、IFT、乳膠凝集試驗(yàn)和快速試紙條等方法，雖然具有操作簡單、出結(jié)果快和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但不能區(qū)分是現(xiàn)癥患者還是既往感染，針對循環(huán)抗原的檢測方法雖然能夠區(qū)分現(xiàn)癥感染還是既往感染，但由于其在體液中的含量通常都很低，一般難以檢出，其敏感性還需進(jìn)一步加強(qiáng)。

目前，作為一種高效的檢測方法，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)不依賴任何專業(yè)儀器設(shè)備就能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高效快速檢測，能避免傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法對于溫度循環(huán)等條件的特殊要求所帶來的不便，具備實(shí)用性、高效性和簡便性的特點(diǎn)，其使用價值和現(xiàn)場應(yīng)用價值越來越明顯，有望成為較適用于血吸蟲現(xiàn)場調(diào)查的簡易技術(shù)方法。

LAMP方法在寄生蟲病的研究與應(yīng)用主要集中在蠕蟲和原蟲等方面，國內(nèi)外研究人員已對弓形蟲、牛帶絳蟲、細(xì)粒棘球絳蟲等寄生蟲單基因的LAMP檢測做了相關(guān)研究，建立LAMP方法，結(jié)果顯示均有很好的特異性和敏感性。但作為日本血吸蟲，還沒有相關(guān)的報道，并且現(xiàn)有的檢測方法相對復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：旨在提供基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法，用來解決現(xiàn)有對日本血吸蟲檢測不準(zhǔn)確，且檢測特異性和敏感性不高的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法，包括以下步驟：

步驟一，日本血吸蟲動物模型建立及血吸蟲樣本收集：

A.感染性釘螺經(jīng)超純水孵育，肉眼觀察水面有尾蚴逸出，接種環(huán)接尾蚴置于玻片，解剖鏡下觀察尾蚴活力，確定尾蚴活動良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮膚，取蓋玻片置于載玻片上，接種環(huán)接30±5只尾蚴于蓋玻片，棉球擦拭小鼠皮膚，將載有尾蚴的載玻片貼于小鼠腹部皮膚約30sec～5min，建立小鼠感染血吸蟲模型；

B.感染40～50天后，斷頸處死小鼠，解剖觀察肝脾病理變化，收集日本血吸蟲成蟲，收集病變肝臟及結(jié)腸，置于EP管并在-20℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二，模板DNA制備：收集釘螺孵育后的超純水，轉(zhuǎn)至離心管中，在1000～5000r/min條件下離心5～20min，棄上層清液，沉淀用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取尾蚴基因組DNA，感染性釘螺碾碎，收集螺肉及內(nèi)臟，用軟體動物基因組DNA提取試劑盒提取釘螺基因組DNA，提取后的尾蚴基因組DNA和釘螺基因組DNA均置于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟三，候選基因確定：選擇日本血吸蟲尾蚴期若干個預(yù)測蛋白基因作為目的基因；

步驟四，LAMP引物設(shè)計與合成：依據(jù)Protein ID，在NCBI網(wǎng)站中搜索、下載并保存步驟三中選擇的日本血吸蟲尾蚴期的預(yù)測蛋白核酸序列的TXT文本，利用DNAStar軟件，將核酸序列格式另存為Seq，應(yīng)用軟件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html在線設(shè)計LAMP引物；上傳核酸序列，設(shè)置參數(shù)為默認(rèn)值(Automatic Judgment)，設(shè)計引物(Primer design)，如若未有引物自動生成，則修改參數(shù)值中的長度和Tm值，再次生成LAMP引物；

步驟五，LAMP引物配置(常溫下配置)：

A.引物儲存液配置，將步驟四得到的含有LAMP引物干粉的1.5ml離心管放入離心機(jī)，在12000～16000r/min的條件下離心1～10min，根據(jù)引物干粉物質(zhì)的量溶解干粉，配置內(nèi)引物(FIP/BIP)母液和外引物(F3/B3)母液，配置的母液室溫放置數(shù)分鐘后渦旋儀100～300r/min震蕩混勻，隨后放入離心機(jī)，進(jìn)行離心；

B.引物工作液PM配置：取步驟五A得到的FIP和BIP各4μl、F3和B3各1μl，然后加入10μl超純水制備成20μl工作液備用；

步驟六，尾蚴期及感染性釘螺基因組DNA的LAMP檢測：

尾蚴期和感染性釘螺基因組25μl LAMP反應(yīng)體系：12.5μl 2×RM反應(yīng)液，1μl步驟四得到的引物工作液PM，1μl步驟二得到的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超純水至25μl，混勻后加20μl密封液再次離心，最后將1μl顯色液滴在PCR管蓋中間，蓋緊管蓋，PCR儀內(nèi)反應(yīng)，終止反應(yīng)后顛倒PCR管數(shù)次，使顯色液和反應(yīng)混合液充分混勻，短暫離心后觀察反應(yīng)液顏色變化，若呈現(xiàn)綠色則為陽性(有核酸擴(kuò)增)，呈現(xiàn)棕紅色則為陰性(無核酸擴(kuò)增)。

作為優(yōu)選的，所述步驟二中沉淀用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒為離心柱型，這樣的設(shè)計，可以更方便、快速、準(zhǔn)確的提取沉淀的DNA。

作為優(yōu)選的，所述步驟三中選擇日本血吸蟲尾蚴期16個預(yù)測蛋白基因作為目的基因，這樣的設(shè)計，對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測更加準(zhǔn)確。

作為優(yōu)選的，所述預(yù)測蛋白基因包括被膜抗原、鈣離子結(jié)合蛋白、尿嘧啶核苷磷酸化酶、多巴胺脫羧酶等的編碼基因和編碼數(shù)個假定蛋白的基因，這樣的設(shè)計，可以全方位的檢測日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因，減少誤判。

作為優(yōu)選的，所述預(yù)測蛋白基因分別為：AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、CNUS0000038.1、CNUS0000099824.1、CNUS0000102858.1、CNUS0000103096.1、CNUS0000103598.1、CNUS0000103614.1、CNUS0000105310.1、CNUS0000105798.1、CNUS0000106268.1、CNUS0000106483.1、CNUS0000107348.1、CNUS0000107429.1，這樣的設(shè)計，選擇的基因具有代表性，對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因的檢測更加準(zhǔn)確。

作為優(yōu)選的，所述步驟五A中內(nèi)引物(FIP/BIP)母液濃度為200pmol/μl，這樣的設(shè)計，可以使對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測更精確。

作為優(yōu)選的，所述步驟五A中外引物(F3/B3)母液濃度為100pmol/μl，這樣的設(shè)計，可以使對日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因檢測更精確。

作為優(yōu)選的，所述步驟五A中配置好的母液室溫放置3至10min，然后震蕩混勻后12000至16000r/min的條件下離心30sec至1min，這樣的設(shè)計，可以使得到母液的純度更高，減小母液不純對檢測結(jié)果的影響。

作為優(yōu)選的，所述步驟六中PCR儀內(nèi)反應(yīng)溫度為60℃～65℃，這樣的設(shè)計，能夠使檢測效果更明顯。

作為優(yōu)選的，所述步驟六中PCR儀內(nèi)反應(yīng)時間為0～90min，這樣的設(shè)計，可以減少反應(yīng)不充分對檢測結(jié)果的影響。

本發(fā)明的有益效果：

采用本發(fā)明能夠有效快速的檢測日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因，能夠?yàn)樵缙诘难x預(yù)警提供技術(shù)支持；且能夠用于日本血吸蟲疫區(qū)水樣本及釘螺樣本的流行病學(xué)調(diào)查。

附圖說明

本發(fā)明可以通過附圖給出的非限定性實(shí)施例進(jìn)一步說明；

圖1為本發(fā)明基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法實(shí)施例的檢測結(jié)果示意圖；

圖2為本發(fā)明基于日本血吸蟲尾蚴期基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法實(shí)施例中感染性釘螺期編碼蛋白基因的LAMP檢測結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)一步說明。

實(shí)施例

步驟一，日本血吸蟲動物模型建立及血吸蟲樣本收集：

A.感染性釘螺經(jīng)超純水孵育，肉眼觀察水面有尾蚴逸出，接種環(huán)接尾蚴置于玻片，解剖鏡下觀察尾蚴活力，確定尾蚴活動良好，取昆明小鼠10只，腹部剪毛至裸皮膚，取蓋玻片置于載玻片上，接種環(huán)接30±5只尾蚴于蓋玻片，棉球擦拭小鼠皮膚，將載有尾蚴的載玻片貼于小鼠腹部皮膚約1min，建立小鼠感染血吸蟲模型；

B.感染45天后，斷頸處死小鼠，解剖觀察肝脾病理變化，收集日本血吸蟲成蟲，收集病變肝臟及結(jié)腸，置于EP管并在-20℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二，模板DNA制備：收集釘螺孵育后的超純水，轉(zhuǎn)至離心管中，在3000r/min條件下離心10min，棄上層清液，沉淀用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取尾蚴基因組DNA，感染性釘螺碾碎，收集螺肉及內(nèi)臟，用軟體動物基因組DNA提取試劑盒提取釘螺基因組DNA，提取后的尾蚴基因組DNA和釘螺基因組DNA均置于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟三，候選基因確定：選擇日本血吸蟲尾蚴期16個預(yù)測蛋白基因作為目的基因，包括被膜抗原、鈣離子結(jié)合蛋白、尿嘧啶核苷磷酸化酶、多巴胺脫羧酶等的編碼基因和編碼數(shù)個假定蛋白的基因，候選基因見表1；

步驟四，LAMP引物設(shè)計與合成：依據(jù)Protein ID，在NCBI網(wǎng)站中搜索、下載并保存步驟三中選擇的日本血吸蟲尾蚴期的預(yù)測蛋白核酸序列的TXT文本，利用DNAStar軟件，將核酸序列格式另存為Seq，應(yīng)用軟件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html在線設(shè)計LAMP引物；上傳核酸序列，設(shè)置參數(shù)為默認(rèn)值(Automatic Judgment)，設(shè)計引物(Primer design)，如若未有引物自動生成，則修改參數(shù)值中的長度和Tm值，再次生成LAMP引物，候選基因所篩選的LAMP引物見表1；

表1日本血吸蟲尾蚴期編碼蛋白基因LAMP引物

步驟五，LAMP引物配置：

A.引物儲存液配置，將步驟四得到的含有LAMP引物干粉的1.5ml離心管放入離心機(jī)，，在12000r/min的條件下離心1min，根據(jù)引物干粉物質(zhì)的量溶解干粉，配置內(nèi)引物(FIP/BIP)母液且其濃度為200pmol/μl和外引物(F3/B3)母液且其濃度為100pmol/μl，將配置好的母液室溫下放置5min，配置的母液室溫放置數(shù)分鐘后渦旋儀100～300r/min震蕩混勻，震蕩混勻后在12000r/min下離心1min。

B.引物工作液PM配置：取步驟五A得到的FIP和BIP各4μl、F3和B3各1μl，然后加入10μl超純水制備成20μl工作液備用；

步驟六，尾蚴期及感染性釘螺基因組DNA的LAMP檢測

尾蚴期和感染性釘螺基因組25μl LAMP反應(yīng)體系：12.5μl 2×RM反應(yīng)液，1μl步驟四得到的引物工作液PM，1μl步驟二得到的DNA模板，1μl Bst DNA Polymerase，加超純水至25μl，混勻后加20μl密封液再次離心，最后將1μl顯色液滴在PCR管蓋中間，蓋緊管蓋，PCR儀內(nèi)在63℃下反應(yīng)60min，，終止反應(yīng)后顛倒PCR管數(shù)次，使顯色液和反應(yīng)混合液充分混勻，短暫離心后觀察反應(yīng)液顏色變化，若呈現(xiàn)綠色則為陽性(有核酸擴(kuò)增)，呈現(xiàn)棕紅色則為陰性(無核酸擴(kuò)增)。

根據(jù)設(shè)計的LAMP引物序列尾蚴期DNA的LAMP檢測見圖1；

圖1中，1～16、N、P分別為AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、Sjp_0029100、Sjp_0047050、Sjp_0079350、Sjp_008184、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0105400、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0130580、Sjp_0131430基因、陰性對照和陽性對照；

根據(jù)圖1可以看出，尾蚴期DNA的LAMP檢測結(jié)果顯示：Sjp_0079350、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0130580、Sjp_0131430等8個編碼蛋白基因的檢測管顯色反應(yīng)為綠色，判斷為陽性；其余8個基因檢測顯色反應(yīng)為棕紅色，判斷為陰性。

根據(jù)設(shè)計的LAMP引物序列感染性釘螺期DNA的LAMP檢測見圖2；

圖2中，1～16、N、P分別為AY813605.1、AY814178.1、AY815661.1、FN314484.1、Sjp_0029100、Sjp_0047050、Sjp_0079350、Sjp_008184、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0105400、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0130580、Sjp_0131430蛋白、陰性對照和陽性對照；

根據(jù)圖2可以看出，感染性釘螺期DNA的LAMP檢測結(jié)果顯示：Sjp_0029100、Sjp_0079350、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0131430等8個基因的檢測管顯色反應(yīng)為綠色，判斷為陽性；其余8個基因檢測顯色反應(yīng)為棕紅色，判斷為陰性.

由圖1和圖2可以看出，日本血吸蟲尾蚴作為感染期，分布于水體及感染性釘螺體內(nèi)，采用LAMP方法檢測16組尾蚴基因組及16組釘螺基因組DNA編碼蛋白基因，顯示有7個蛋白基因Sjp_0079350、Sjp_0087160、Sjp_0087340、Sjp_0110590、Sjp_0115600、Sjp_0118170、Sjp_0131430檢測都為陽性，具有很好的檢測一致性，提示該7個基因具備潛在LAMP檢測靶基因的應(yīng)用價值，能夠有效的用于日本血吸蟲疫區(qū)水樣本及釘螺樣本的流行病學(xué)調(diào)查。

上述實(shí)施例僅示例性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。