專利名稱：白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，尤其是白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是啟動T細胞初始反應(yīng)的最重要抗原提呈細胞，DC可用于腫瘤的免疫治療。傳統(tǒng)的DC制備均采用骨髓造血祖細胞和外周血單核細胞。制備方法是在有血清培養(yǎng)體系中加入?！奘杉毎浯碳ひ蜃?GM-CSF)，白細胞介素4(IL-4)、腫瘤壞死因子(TNF)。此外，在制備過程中還需加入從腫瘤細胞提取的特異性抗原沖擊培養(yǎng)，工藝復雜，培養(yǎng)時間長，約15天。近年來也有從白血病細胞制備DC，此種方法制備DC本身攜帶腫瘤特異性抗原，可激活T細胞的特異性反應(yīng)而產(chǎn)生抗腫瘤作用。因此可省去制備過程中提取腫瘤抗原和加抗原沖擊培養(yǎng)的步驟，簡化工藝。但不足之處是用傳統(tǒng)方法制備白血病DC，抗原共刺激分子表達低，激活T細胞作用差，培養(yǎng)時間仍較長，約13天。為此，縮短培養(yǎng)時間，尋找更好的制備白血病DC的方法顯得十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)時間短的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案為白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，在常規(guī)的白血病細胞無血清培養(yǎng)基中加入當歸多糖。當歸多糖英文為Angelica Polysaccharide簡稱APS。
較優(yōu)的技術(shù)方案有下列當歸多糖濃度為10-800ug/ml。
當歸多糖濃度為50-400ug/ml。
白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，在IMDM培養(yǎng)基中加入5-15％的無血清培養(yǎng)基血清替在物，其中無血清培養(yǎng)基血清替在物主要由牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素組成。
白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液調(diào)配當歸多糖的濃度。
白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為0.5-5×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為50-400ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)1-10天。
白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，置于常規(guī)37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周半量換液2次，補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)3-5天。
白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)的10天后加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)3天，收集細胞。
白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基用于白血病細胞、樹突狀細胞分析檢測。
本發(fā)明的原理和優(yōu)點在于當歸多糖對造血細胞生長有促進作用，能誘導白血病細胞株K562分化，可促進免疫功能，增強單核巨噬細胞的吞噬功能，因此，當歸多糖用于制備DC具有充分的理論依據(jù)。
采用主要由牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素組成的無血清培養(yǎng)基血清替代物制備白血病性DC，制備所需時間與有血清培養(yǎng)相似，但無血清條件下制備的DC激活T細胞作用比有血清制備強，同時，避免了加入血清可能帶來的肝炎病毒、艾滋病病毒感染的可能。
與不加當歸多糖比較，加當歸多糖組制備的DC，其抗原共刺激分子(CD80、CD86)表達明顯升高，制備時間只需3-5天，細胞活性比不加當歸多糖組好。因此，當歸多糖能促進白血病性DC的誘生和成熟，是制備白血病DC良好的誘生劑。
具體實施例方式
實施例1、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，在常規(guī)的白血病細胞無血清培養(yǎng)基中加入當歸多糖。
實施例2、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，當歸多糖濃度為10-800ug/ml。
實施例3、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，當歸多糖濃度為50-400ug/ml。
實施例4、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，在IMDM培養(yǎng)基中加入5-15％的無血清培養(yǎng)基血清替在物，其中無血清培養(yǎng)基血清替在物主要由牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素組成。
實施例5、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液調(diào)配當歸多糖的濃度。
實施例6、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為0.5-5×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為50-400ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)1-10天。
實施例7、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，置于常規(guī)37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周半量換液2次，補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)3-5天。
實施例8、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)的10天后加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)3天，收集細胞。
實施例9、白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基用于白血病細胞、樹突狀細胞分析檢測。
實施例10、(1)、按傳統(tǒng)方法建立有血清制備人白血病細胞DC方法，取白血病患者(包括急性髓性白血病、慢性粒細胞白血病)骨髓細胞，分離單個細胞，鏡下觀察白血病幼稚細胞占80-90％。調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml。培養(yǎng)方法用IMDM培養(yǎng)基+10％人AB型血清，再補充GM-CSF，IL-4，TNF等細胞因子。置于37℃、5％CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周用含上述細胞因子的新鮮培養(yǎng)基換液兩次。
(2)、建立無血清條件下制備人白血病DC的方法用IMDM培養(yǎng)基+10％無血清培養(yǎng)基血清替在物(主要含牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素等)。
(3)、從中藥當歸(甘肅岷縣產(chǎn))中提取當歸多糖，純度＞98％，將當歸多糖用磷酸鹽緩沖液PBS配制成適當濃度，過濾除菌備用。
(4)、將當歸多糖加入已建立的無血清培養(yǎng)體系中制備白血病DC，觀察不同濃度、不同培養(yǎng)時間制備的DC，采用形態(tài)學，細胞免疫表型和混合淋巴細胞反應(yīng)觀察，當歸多糖對制備白血病DC的影響。
1材料和方法1.1 標本來源6例慢性期CML，經(jīng)bcr/abl融合基因檢測為陽性。
1.2主要藥品和試劑APS由上海中醫(yī)藥大學分離提取，純度＞95％，配制成所需濃度工作液，過濾除菌。GM-CSF購自先靈寶雅公司，IL-4、TNF-α、絲裂霉素C購于Sigma公司，淋巴細胞分離液購于中國科學院血液學研究所。FITC-HLA-DR、FITC-CD80、FITC-CD83、FITC-CD86單抗購于BD公司，完全培養(yǎng)基包括IMDM和胎牛血清購于Gibco公司。
1.3細胞培養(yǎng)CML患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，懸浮于含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，加入濃度為1000u/mlrhGm-CSF，1000u/ml rhIL-4作為對照組，實驗組在上述培養(yǎng)體系中再分別加入終濃度為50-400ug/ml的APS。置于37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周半量換液2次，補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)第10天加入終濃度的100ug/ml的TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)3天，收集細胞，一部分用細胞表型分析，其余在液氮中凍存。
1.4細胞免疫表型鑒定和形態(tài)學觀察見我們已報道的方法[2]。
1.5APS對CML-DC增殖的影響分別在培養(yǎng)第1、3、5、7、10天取樣，進行臺酚藍染色，計數(shù)活細胞數(shù)。
1.6混合淋巴細胞反應(yīng)取健康人(輸血員)和治療后達CR患者外周血，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度2×106/ml加入含5％胎牛血清的IMDM中，置于塑料培養(yǎng)瓶，在37℃靜置60min，收集非吸附細胞。調(diào)整適當細胞濃度備用。在37℃水浴中復蘇DC，洗滌3次，加入含終濃度為25ug/ml絲裂霉素IMDM，在37℃孵育45min，IMDM培養(yǎng)基洗滌3次，用含10％胎牛血清IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度，分別以1×103/孔，3×103/孔，1×104/孔加入96孔培養(yǎng)板，每組接種3個復孔，每孔再加2×105個健康人或患者(CD)外周血淋巴細胞，在37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)和中培養(yǎng)96小時后加入MTT(5ug/ml，10ul/孔，Sigmn公司)，培養(yǎng)結(jié)束后加入二甲基亞砜(DMSO)150ul/孔，用酶標儀檢測波長570nm時的OD值，結(jié)果取均值。
2 結(jié)果
2.1 細胞計數(shù)和細胞成活率觀察以GM-CSF、IL-4為基本誘導DC條件，加入不同APS濃度時培養(yǎng)細胞的計數(shù)和成活率的變化見表1、表2，從表中可以看出，當APS濃度為100ug/ml時，細胞的增殖和成活率為最好，最佳的時間是在培養(yǎng)3-5天時。
表1同APS濃度培養(yǎng)細胞數(shù)的變化(×106/ml)培養(yǎng)時間(天)分組 APS(ug/ml)0 1 3 5 7 101 01.001.100.930.820.430.182 50 1.001.011.080.801.020.833 100 1.001.021.532.021.911.834 200 1.000.891.021.121.231.455 400 1.001.031.021.341.821.35表2同APS濃度培養(yǎng)時細胞成活率的變化(％)培養(yǎng)時間(天)分組APS(ug/ml)0 1 3 5 7 1010 1009582624535250 10090908370603100100969490898742001009476867863540010092918766482.2細胞形態(tài)學觀察6例CML骨髓單個核細胞，經(jīng)GM-CSF、IL-4聯(lián)合誘導培養(yǎng)后可部分出現(xiàn)了細胞體積增大，并伸出突出，隨著培養(yǎng)時間的延長，總細胞數(shù)量減少，大部分細胞死亡，但剩余的細胞在培養(yǎng)時10天時再加入TNF-α，出現(xiàn)樹突樣的DC比例增多。而加入APS后培養(yǎng)的細胞，培養(yǎng)次日即出現(xiàn)了呈樹枝狀突起的細胞，到培養(yǎng)3-5天時出現(xiàn)DC形態(tài)細胞比例明顯增加，且細胞生長狀態(tài)比未加APS好，細胞總數(shù)亦增多。培養(yǎng)10天時細胞總數(shù)也未減少。
2.3細胞表型變化由于從動態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)加入100ug/ml APS時，細胞增殖和成活率達到最佳，因此，我們選擇加入100ug/ml APS組的DC細胞作表型分析，并與不加APS相對比(見表3)。從表3中可提示加入APS組，細胞DC相關(guān)表而分子表達率明顯升高，且在培養(yǎng)后的第一天就開始上升，其中在3-5天時升高最為明顯。如CD83為40.6％，CD80 44.6％，CD86 50.6％，HLA-DR 60.3％；而未加APS組，DC相關(guān)表而分子升高不明顯，到第10天時CD83才為18.6％，CD80 14.1％，CD86 15.1％，HLA-DR 21.8％。此時，在未加APS組中再加入TNT-α后繼續(xù)培養(yǎng)3天，則CD83的比率可升高到36.4％，但培養(yǎng)體系中大部分細胞死亡，細胞總數(shù)明顯減少。
表3 APS對培養(yǎng)DC的細胞表型變化(％)細胞表培養(yǎng)時間(天)APS(ug/ml)型0 1 35 710CD83 0 1.2±0.41.8±0.84.6±2.3 6.8±2.19.1±1.9 18.6±2.4CD83 100 1.2±0.419.3±1.9 36.4±5.240.6±7.0 39.8±6.635.5±10.1CD80 0 3.4±1.12.9±1.141.1±1.38.3±2.910.1±2.314.1±3.4CD80 100 3.4±1.116.2±2.2 42.3±6.444.6±5.9 42.1±7.039.7±12.1CD86 0 2.8±0.93.4±1.25.3±1.8 9.1±2.211.8±2.315.1±3.7CD86 100 2.8±0.917.3±3.4 39.4±4.250.6±11.6 48.1±10.6 45.1±7.6HLA-DR0 6.6±2.27.6±2.518.4±2.919.6±2.4 20.8±7.221.8±3.1HLA-DR100 6.6±2.220.1±4.1 45.1±6.360.3±11.8 55.4±14.8 49.3±10.12.4 APS對CML-DC刺激淋巴細胞增殖的影響我們收集培養(yǎng)第10天的未加APS組CML-DC和收集培養(yǎng)第5天加入APS的CML-DC用于混合淋巴細胞反應(yīng)(見表4)，結(jié)果提示兩組CML-DC故能刺激自體或同種異體淋巴細胞增殖，但加入APS組誘導的CML-DC激活淋巴細胞增殖的能力比未加APS組強。
表4 APS對CML-DC刺激淋巴細胞增殖的影響(OD)培養(yǎng)時間(天)分組APS(ug/ml)1×103/孔3×103/孔1×104/孔自體淋巴細胞自體淋巴細胞 0 0.32±0.100.53±0.140.81±0.17正常人淋巴細100 0.48±0.120.81±0.111.19±0.18胞 0 0.36±0.150.67±0.180.89±0.16正常人淋巴細100 0.50±0.200.93±0.141.34±0.20胞3討論CML患者的白血病細胞可以誘導生成樹突狀細胞。由于CML-DC攜帶腫瘤特異性抗原，若其具有正常DC相似的抗原功能，則可激活特特異性T細胞免疫反應(yīng)，從而達到特異性殺傷的白血細胞的作用。但采用以往方法培養(yǎng)的CML-DC抗原共刺激分子表達較低，且培養(yǎng)誘導時間較長，因此，其刺激T細胞反應(yīng)能力受限，同時難以短期獲得成熟的CML-DC。而培養(yǎng)時間延長，則細胞成活率明顯降低。
當歸多糖(APS)是中醫(yī)藥學補血要藥當歸的重要有效成分。APS對造血有促進作用，且能誘導白血病細胞株K562分化；APS也能增強免疫功能，可增強單核巨噬細胞的吞噬功能。我們在以往加IL-4、GM-CSF誘導培養(yǎng)CML-DC的基礎(chǔ)上，再加入APS培養(yǎng)誘導CML-DC，結(jié)果顯示細胞增殖能力和成活率與未加APS組明顯提高，以APS濃度為100ug/ml、培養(yǎng)3-5天時為最好。細胞表型分析加入APS組培養(yǎng)第1天的細胞CD83、CD86、CD80、HLA-DR表達比率明顯增多，且在第3-5天時升高到高峰?；旌狭馨图毎磻?yīng)提示加入APS組誘生的CML-DC，刺激淋巴細胞增殖能力強于未加APS組。本研究結(jié)果證明APS能促進CML-DC的誘生和成熟，且能提高抗原共刺激分子的表達，增強CML-DC激活T細胞的能力。
實施例11、1、2％當歸多糖注射正常小鼠和(4Gy鈷60照射)貧血小鼠，取各組小鼠骨髓培養(yǎng)，觀察當歸多糖對單核-巨噬細胞生成的影響。
注射當歸多糖對?！獑渭毎浼毎纬傻挠绊?/5×104BMC)組別n 對照組(X±S)n 當歸多糖組(X±S)P正常鼠 20 108.7±16.0 20 146.7±15.7 ＜0.01貧血鼠 15 17.5±1.6 14 39.5±3.8 ＜0.01證明當歸多糖能促進粒細胞、單核細胞生成。
2、當歸多糖促進骨髓細胞增殖(MTT法)當歸多糖濃度/mg·mL-1分組 1 0.50.250對照組(加溶劑)0.107±0.007當歸多糖組0.767±0.5010.697±0.5460.842±0.6013、當歸多糖對骨髓有核細胞DNA合成影響(3H-TdR標記法)藥物濃度分組 1 0.50.250對照組(加溶劑)80.41±48.21當歸多糖組 881.87±376.23 981.39±481.05 686.03±193.224、當歸多糖對小鼠樹突狀細胞的影響。
5％當歸多糖皮下注射正常小鼠后，對照實驗表明①脾重量增加；②脾小體生發(fā)中心反應(yīng)減弱；③樹突狀細胞增多；④腹腔單核-巨噬細胞對雞紅細胞吞噬能力顯著增強。實施例11、下面是一組技術(shù)參數(shù)當歸多糖濃度為2ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為1000ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為1500ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為800ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為50ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為25ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為400ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為200ug/ml。其余同實施例10。
當歸多糖濃度為500ug/ml。其余同實施例10。
在IMDM培養(yǎng)基中加入5％的無血清培養(yǎng)基血清替在物，其中無血清培養(yǎng)基血清替在物主要由牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素組成。其余同實施例10。
在IMDM培養(yǎng)基中加入15％的無血清培養(yǎng)基血清替在物，其中無血清培養(yǎng)基血清替在物主要由牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素組成。其余同實施例10。
在IMDM培養(yǎng)基中加入12％的無血清培養(yǎng)基血清替在物，其中無血清培養(yǎng)基血清替在物主要由牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素組成。其余同實施例10。
白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為0.5-5×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為400ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)1天。其余同實施例10。
白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為5×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為50ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)3天。其余同實施例10。
白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為3×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為300ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)10天。其余同實施例10。
白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為0.5-5×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為50-400ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)4天。其余同實施例10。
白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為0.5-5×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為50-400ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)5天。其余同實施例10。
權(quán)利要求
1.白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，其特征在于在常規(guī)的白血病細胞無血清培養(yǎng)基中加入當歸多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，其特征在于當歸多糖濃度為10-800ug/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，其特征在于當歸多糖濃度為50-400ug/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，其特征在于在IMDM培養(yǎng)基中加入5-15％的無血清培養(yǎng)基血清替在物，其中無血清培養(yǎng)基血清替在物主要由牛血清白蛋白，過氧化氫酶，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，膽固醇，胰島素組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基，其特征在于使用磷酸鹽緩沖液調(diào)配當歸多糖的濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于白血病患者抗凝骨髓，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為0.5-5×106/ml，懸浮于IMDM培養(yǎng)基中，加入終濃度為50-400ug/ml的當歸多糖，置于常規(guī)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，和常規(guī)補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)1-10天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于置于常規(guī)37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周半量換液2次，補充新鮮培養(yǎng)基及相應(yīng)的細胞因子，培養(yǎng)3-5天。
8.根據(jù)權(quán)利要求6述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)的10天后加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)3天，收集細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6述的白血病細胞誘導生成樹突狀細胞的培養(yǎng)基用于白血病細胞、樹突狀細胞分析檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白血病細胞誘導生成樹突狀細胞DC的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案為是在常規(guī)的白血病細胞無血清培養(yǎng)基中加入當歸多糖。當歸多糖濃度為10－800ug/ml。當歸多糖濃度為50－400ug/ml。當歸多糖對造血細胞有促進作用，能誘導白血病細胞株K
文檔編號C12Q1/02GK1517435SQ0311849
公開日2004年8月4日 申請日期2003年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月17日
發(fā)明者陳國安, 袁利亞, 肖希斌, 高琳琳, 戎吉平 申請人:江西醫(yī)學院