一種將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導劑及誘導分化完全培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于干細胞誘導分化技術(shù)領域，具體涉及一種誘導劑及誘導分化培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1995年首次報道間充質(zhì)干細胞（MSC)應用于臨床試驗以來，現(xiàn)在培養(yǎng)的MSC已 被廣泛的用于臨床試驗研究，包括移植物抗宿主病（GVHD)，充血性心衰，急性心梗，2型糖 尿病，脊髓損傷，軟骨和骨損傷、克羅恩病等等。另一方面，隨著不斷發(fā)現(xiàn)新的間充質(zhì)干細胞 來源，如脂肪、羊水、胎盤、臍帶、臍血等，拓展了間充質(zhì)干細胞的來源途徑，為基于間充質(zhì)干 細胞的各種治療手段提供了更多更好的種子細胞來源。國外干細胞藥物領域的市場化大 門已經(jīng)打開，已有4個干細胞藥物獲批上市，包括韓國批準的3個：急性心肌梗死治療藥物 Hearticellgram-AMI、關節(jié)軟骨缺損治療藥物CartiStem、治療復雜性克隆氏病并發(fā)肛痿的 自體干細胞藥物Cuepistem，以及加拿大批準的治療兒童移植物抗宿主病的非處方間充質(zhì) 干細胞藥物Prochymal。之后新西蘭醫(yī)療管理局和瑞士醫(yī)藥管理局也批準了Prochymal在 這2個國家的上市銷售權(quán)。但是目前，中國尚未批準任何干細胞藥物或產(chǎn)品上市，中國在 2004年、2005年以及2006年共批準了三個干細胞藥物進入臨床試驗階段。根據(jù)中國SFDA 網(wǎng)站的查詢信息，這三個藥物分別是"骨髓原始間充質(zhì)干細胞"、"自體骨髓間充質(zhì)干細胞注 射液"、"間充質(zhì)干細胞心梗注射液"。除此之外，尚未開始受理審批其它任何干細胞項目。因 此，需要加快國內(nèi)干細胞基礎與臨床研究，力爭趕超歐美。神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性病變 如帕金森氏病、阿爾茨海默病、亨廷頓氏病等，一直是困擾人類健康的難題，而細胞移植是 治愈此類疾病的希望。目前用于移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要是胚胎干細胞和神經(jīng)干 細胞，但由于供體來源難，倫理學異議、免疫排斥反應以及移植細胞存活困難等問題，發(fā)展 空間有限。 間充質(zhì)干細胞來源廣泛、取材容易，便于自體移植，具有強大的增殖能力，在體外長期 培養(yǎng)過程中可以始終保持其多向分化潛能，在特定條件誘導下可以分化為成骨、軟骨、肌 腱、肌細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞和肝細胞等，是一種理想的組織工程種子細胞。間充質(zhì)干細 胞已經(jīng)成為干細胞研究的熱點，經(jīng)誘導后分化為神經(jīng)細胞，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的 修復。
[0003] 干細胞的分化是部分基因選擇性地被激活或差異性表達，從而控制細胞表型和蛋 白質(zhì)的特異性分布。間充質(zhì)干細胞分化為特定細胞類型主要取決于基因的激活，而細胞外 微環(huán)境中各種因子類型和濃度則是基因激活的重要因素。間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞的誘導 分化至少具有兩方面的意義：一方面，揭示細胞的基因機制具有可塑性，外環(huán)境的變化能夠 激發(fā)出細胞的多能性，從而超越起源胚層的固有限制，分化為攜帶本胚層/其它胚層標志 物的細胞。另一方面，作為產(chǎn)生移植用神經(jīng)細胞的新途徑，為臨床移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提 供機會。
[0004] 目前文獻報道的運用間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為神經(jīng)細胞的研究報道非常多， 主要有：（1)傳統(tǒng)的化學誘導劑(抗氧化劑）法如：0-ME( 0 -巰基乙醇)、DMSO(二甲基亞 砜)、BHA(丁基羥基茴香醚）聯(lián)合誘導等；（2)生長因子誘導法如：神經(jīng)生長因子NGF，表皮 生長因子EGF，堿性成纖維細胞生長因子bFGF、維甲酸（RA)單獨或者聯(lián)合誘導等；（3)生長 因子與化學誘導劑聯(lián)合；（4)共培養(yǎng)或用接近生理狀態(tài)的條件培養(yǎng)基；（5)基因轉(zhuǎn)染；（6) 中藥丹參、黃芩苷等。
[0005] 傳統(tǒng)的化學誘導劑法雖然可以高效、快速地將間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，但 細胞死亡率較高(化學誘導劑具有一定毒性，BHA、DMS0等可使細胞突變，用于細胞移植存在 致瘤性的危險）；生長因子誘導方法雖然誘導后細胞存活率高，但誘導時間長、誘導效率低。 基因轉(zhuǎn)染誘導因為基因改變存在罹患癌癥的潛在風險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的誘導劑及誘導方法存在的缺陷，提供一種安全無毒、 誘導效率高，誘導時間短的將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導劑和誘導分化完全培養(yǎng) 基。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細 胞的誘導劑，包含白藜蘆醇、淫羊藿苷、氫化可的松、VEGF，IGF-I、EP0。
[0008] -種將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導分化完全培養(yǎng)基，其組成成分為：每 1000ml所述誘導培養(yǎng)基中含有白藜蘆醇30~50ymol、淫羊藿苷5~10ymol、氫化可的 松5~lOnmol、VEGF10~20yg、IGF-I5~10yg、EP0 2~5yg，余量為人間充質(zhì)干細 胞無血清培養(yǎng)基。
[0009] 所述的將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導分化完全培養(yǎng)基，其組成成分為： 每1000ml所述誘導分化完全培養(yǎng)基中含有白藜蘆醇40ymol、淫羊藿苷8ymol、氫化可的 松8nmol、VEGF15yg、IGF-I7yg、EP0 4yg，余量為人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基。
[0010] 所述的將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導分化完全培養(yǎng)基，將上述組分按配 比混勻后過濾除菌即可。
[0011] 本發(fā)明的將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導劑及誘導分化完全培養(yǎng)基，采用 中藥成分白藜蘆醇、淫羊藿苷聯(lián)合氫化可的松及生長因子VEGF、IGF-I、EP0協(xié)同誘導間充 質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，所選用的誘導成分均無毒，誘導效率高，誘導時間短，誘導獲得 細胞活性好，細胞移植后無排斥，無倫理問題，安全性高。
【附圖說明】
[0012] 圖1是人脂肪來源間充質(zhì)干細胞形態(tài)圖（X100); 圖2是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后出現(xiàn)的神經(jīng)細胞形態(tài)圖（X200); 圖3是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后NeuN陽性表達細胞免疫細胞化學染色結(jié)果圖 (X400)； 圖4是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后0-TubulinIII陽性表達細胞免疫細胞化學染色結(jié) 果圖（X400); 圖5采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后GFAP陽性表達細胞免疫細胞化學染色結(jié)果圖 (X400)； 圖6是采用本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導后P-TubulinIII陽性表達細胞免疫熒光染色結(jié)果圖 (X200);圖中：a示0-TubulinIII陽性細胞，呈紅色熒光；b示Hoechst33258復染的胞核， 呈藍色熒光；c為a與b的合成。
【具體實施方式】
[0013] 下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實驗所用器具儀器試劑 皆可通過商業(yè)途徑獲得。
[0014] 實施例1 一種將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導劑，包含白藜蘆醇、淫羊藿 苷、氫化可的松、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)，胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、促紅細胞生成 素（EP0)。
[0015] 實施例2本實施例的將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導分化完全培養(yǎng)基，將 下列原料按其各自特性進行溶解，以人間充質(zhì)干細胞無血清完全培養(yǎng)基為基質(zhì)（L0NZA，貨 號00190632)，使各組分含量如下列定容至1000ml:白藜蘆醇（Sigma,R5010-100MG) 36g、 淫羊藿苷（上海微晶生物，489-32-7,2011^)7 11111〇1、氫化可的松（31811^，113160)611111〇1、 VEGF(PeproTech，96-100-20-2) 10yg、IGF-I(PeproTech，96-100-1卜20) 6yg、EP0 (PeproTech,CYT-201)3yg〇
[0016] 實施例3 本實施例的將間充質(zhì)干細胞誘導成神經(jīng)細胞的誘導分化完全培養(yǎng)基， 將下列原料按其各自特性進行溶解，以人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基為基質(zhì)（L0NZA，貨號 00190632)，使各組分含量如下列定容至1000ml:白藜蘆醇（Sigma,R5010-100MG)40g、淫 羊藿苷(上海微晶生物，489-32-7, 20mg) 8ymol、氫化可的松（Sigma,H3160)8nmol、VEGF (PeproTech，96-100-20-2)15yg、IGF-I(PeproTech，96-100-11-20)7yg、EP0(PeproTech ，CYT-201)4yg〇
[0017] 實施例4 采用實施例3制備的誘導培養(yǎng)基，對人脂肪來源間充質(zhì)干細胞 (AD-MSC)進行神經(jīng)細胞誘導分化實驗，步驟如下： 一、人脂肪間充質(zhì)干細胞制備： 1、 接收脂肪組織，用75%的酒精擦拭裝脂肪組織的容器外壁； 2、 分裝脂肪組織，每一個T175培養(yǎng)瓶分裝脂肪組織為50ml。10ml移液管，去吸頭，于 脂肪采集瓶先吸取下層紅色液體棄掉，剩余上層脂肪混勻后進行分裝。
[0018] 3、洗滌脂肪組織，除去血細胞。向T175培養(yǎng)瓶中加入100ml氯化鈉注射液，擰緊 蓋子，劇烈晃動3分鐘以充分洗滌脂肪組織，接著靜止3~5分鐘，使不同相分離，吸去下層 水相；重復以上操作三次，直到下層液較為清澈。
[0019] 4、膠原酶I消化：加入等量新配制的預熱(提前半小時于37°C的氣浴搖床預熱） 的膠原酶I溶液（0. 1%膠原酶I配制方法：稱取0.lg膠原