一種間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于干細胞技術領域，涉及一種間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是具有明顯可塑性和多向分化潛能的一種成體干細胞，在不同生長因子的調節(jié)下，可分化成來源于3個胚層的不同組織細胞類型，如脂肪細胞、成骨細胞、肝樣細胞、心肌樣細胞、神經膠質細胞、神經元細胞和胰島樣細胞等。除此，人間充質干細胞不表達主要組織相容性II類抗原，微量表達主要組織相容性I類抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫調節(jié)功效，移植后的人羊膜間充質干細胞分泌的營養(yǎng)因子，具有促血管生成、促細胞生長、抗炎癥和抗纖維化等作用，在干細胞治療、組織工程治療和再生醫(yī)學研宄應用中具有重要意義。
[0003]為了驗證體外培養(yǎng)的間充質干細胞的成脂分化潛能，必須將間充質干細胞用成脂誘導培養(yǎng)基進行誘導分化。目前的成脂誘導培養(yǎng)基組分一般為DMEM/F12，10%FBS，1%谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素溶液，200剛吲哚美辛，1剛地塞米松，100nM胰島素，250剛3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine，IBMX)。但現(xiàn)有的成脂誘導分化培養(yǎng)基存在誘導效率不夠理想、成脂誘導分化的專一性不強的問題。

【發(fā)明內容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術中存在的誘導效率不夠理想的問題，發(fā)明人通過大量試驗篩選，預料不到的發(fā)現(xiàn):通過添加一定濃度的鹽酸法舒地爾，得到一種新的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的誘導效率大大提高，提高了成脂誘導分化的專一性，通過該培養(yǎng)基的誘導可以獲得大量成脂細胞。
[0005]本發(fā)明的目的將通過下面的詳細描述來進一步體現(xiàn)和說明。
[0006]本發(fā)明提供一種間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，包括DMEM/F12培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:FBS 5~50%體積百分比、谷氨酰胺0.5~5%體積百分比、抗生素0.5~5%體積百分比、吲哚美辛50~500 yM、胰島素50~500 nM、地塞米松5~50 nM、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5-5 y M和鹽酸法舒地爾0.05-0.5 y M。
[0007]采用上述技術方案的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，可以實現(xiàn)各種間充質干細胞向成脂細胞的誘導分化，提高了成脂誘導分化的專一性，產生更多的成脂細胞，成脂相關基因FABP4的表達水平更高，成脂誘導分化效率大大提高。
[0008]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，包括DMEM/F12培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:FBS 5~20%體積百分比、谷氨酰胺0.5~2%體積百分比、抗生素0.5~2%體積百分比、吲哚美辛100~300 yM、胰島素50~200 nM、地塞米松5~20 nM、3_異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5-3 y M和鹽酸法舒地爾0.1-0.3 y M。
[0009]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，包括DMEM/F12培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:FBS 10%體積百分比、谷氨酰胺1%體積百分比、抗生素1%體積百分比、吲哚美辛200 yM、胰島素100 nM、地塞米松10 nM、3_異丁基-1-甲基黃嘌呤1y M和鹽酸法舒地爾0.1 y M。
[0010]優(yōu)選地，所述間充質干細胞選自骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞或羊膜間充質干細胞。
[0011]優(yōu)選地，所述抗生素包括青霉素和鏈霉素。
[0012]本發(fā)明提供的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基還可根據(jù)實際需要添加其他成分，如1%體積百分比的非必須氨基酸，但添加后并未提高成脂誘導分化效率。
[0013]相應地，本發(fā)明還提供了間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:向DMEM/F12培養(yǎng)基中，按所述濃度加入FBS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛母液、胰島素母液、地塞米松母液、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤母液和鹽酸法舒地爾母液，攪拌均勻，過膜除菌即得。
[0014]相應地，本發(fā)明還提供間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基在間充質干細胞成脂誘導分化中的用途。
[0015]此外，本發(fā)明還提供一種間充質干細胞成脂誘導分化方法，包括如下步驟:a)培養(yǎng)間充質干細胞山)待細胞匯合度符合要求時，棄去所述步驟a)中的培養(yǎng)基，加入權利要求1至5中任一項所述的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2~4周。細胞匯合度符合要求通常是指細胞長至70~90%匯合度。
[0016]優(yōu)選地，所述間充質干細胞選自骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞或羊膜間充質干細胞。
[0017]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基，可以實現(xiàn)包括骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞和羊膜間充質干細胞在內的各種間充質干細胞向成脂細胞的誘導分化，產生更多的成脂細胞，提高了成脂誘導分化的專一性，避免了向成骨細胞等其他組織細胞的分化，成脂相關基因FABP4的表達水平高，成脂誘導分化效率大大提高。此外，本發(fā)明提供的制備方法簡單，制得的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基可以實現(xiàn)穩(wěn)定、高效的成脂誘導分化。
【附圖說明】
[0018]圖1不同配方的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基對成脂誘導分化相關基因FABP4的表達影響。
[0019]圖2含不同濃度鹽酸法舒地爾的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基對成脂誘導分化相關基因FABP4的表達影響。
[0020]圖3 P3代骨髓間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成脂誘導分化染色結果圖。
[0021]圖4 P3代骨髓間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成脂誘導分化相關基因FABP4的表達結果圖。
[0022]圖5 P3代臍帶間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成脂誘導分化染色結果圖。
[0023]圖6 P3代臍帶間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成脂誘導分化相關基因FABP4的表達結果圖。
[0024]圖7 P3代羊膜間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成脂誘導分化染色結果圖。
[0025]圖8 P3代羊膜間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成脂誘導分化相關基因FABP4的表達結果圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0027]本發(fā)明中的各組分均為常規(guī)市售產品。誘導培養(yǎng)基1:本發(fā)明實施例二提供的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基2:Life Tecnology公司的成脂誘導分化培養(yǎng)基，貨號A10070-01。誘導培養(yǎng)基3:與誘導培養(yǎng)基1相比，不包括鹽酸法舒地爾。誘導培養(yǎng)基4:與誘導培養(yǎng)基1相比，鹽酸法舒地爾的濃度變?yōu)?.4 y M。誘導培養(yǎng)基5:與誘導培養(yǎng)基1相比，鹽酸法舒地爾的濃度變?yōu)?.5 y M。
[0028]實施例一間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基的配方篩選發(fā)明人對間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基進行了試驗篩選。取P3代骨髓間充質干細胞，以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，并用含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞匯合度達80%時，棄去培養(yǎng)基，分別加入誘導培養(yǎng)基1和誘導培養(yǎng)基3，每3天換液一次。誘導培養(yǎng)3周后，用qPCR鑒定成脂細胞相關基因FABP4的表達水平，結果如圖1所示。
[0029]從圖1可知:向現(xiàn)有技術中的間充質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基中添加一定濃度的鹽酸法舒地爾，可以大幅提高成脂相關基因FABP4的表達水平(與誘導培養(yǎng)基3相比，P〈0.01)，且未檢出成骨相關基因0PN的表達。
[0030]進一步地，發(fā)明人還對鹽酸法舒地爾的添加濃度進行了考察。取P3代骨髓間充質干細胞，以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，并用含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞匯合度達80%時，棄去培養(yǎng)基，分別加入誘導培養(yǎng)基1、誘導培養(yǎng)基4和誘導培養(yǎng)基5，每3天換液一次。誘導培養(yǎng)3周后，用qPCR鑒定成脂細胞相關基因FABP4的表達水平，結果如圖2所示。從圖2可知，當鹽酸法舒地爾的濃度高于0.3 y M時，隨著鹽酸法舒地爾濃度的增加，