專利名稱：乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基因芯片領域，具體地是涉及肽核酸低密芯片及其制備方法，尤其是涉及乙肝突變位點的肽核酸檢測芯片及其制備方法。
肽核酸最早是在1991年由彼得等人合成的一種用于反義、抗基因治療的核酸類似物。它是由N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代DNA分子中的磷酸戊糖骨架，四種堿基通過亞甲基羰基與骨架相連。肽鏈骨架的引入，賦予了PNA獨特的理化和生物學特性。PNA在分子生物學領域前景非常廣闊，它已被用于增強的PCR擴增、PNA膠前雜交(pre-gelhybridization)、PNA輔助剪切(PNA-assisted rare cleavage)、核酸純化、采用PCR發(fā)夾(PCR clamping)分析單堿基突變，用PNA作探針通過毛細管電泳檢測遺傳突變，發(fā)展PNA衍生物，生物傳感器等領域。
肽核酸為非手性分子、不帶電荷，穩(wěn)定性高、不易被蛋白酶和核酸酶所降解、在很寬的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定，與核酸的結(jié)合遵循瓦斯頓-克瑞克(Waston-Crick)堿基互補配對原則。由于PNA含中性骨架，鏈間無排斥作用，它與DNA、RNA所形成的雜交體熱穩(wěn)定性要比相應的RNA-RNA、DNA-DNA、DNA-RNA高。10-mer的PNA與相對應的DNA雜交所形成的反向平行二聚體的Tm值為50℃，15-merPNA的Tm值為70℃。PNA的結(jié)合特異性也要高于DNA和RNA，15-mer PNA/DNA中一個堿基的差異就可使Tm值下降8-20℃(平均為15℃)，而相應的DNA/DNA Tm值下降為4-16℃(平均為11℃)。而且PNA的雜交不依賴于高鹽離子強度，只需低的鹽離子強度?？紤]到PNA的配對、結(jié)合和雜交等特性，PNA探針在識別單堿基突變、微陣列等方面具有廣闊的前景。
肝炎是世界性傳染疾病，我國是公認的肝炎大國，肝炎的患病率和發(fā)病率都居世界前列。乙肝病毒基因不同位點的突變可引起免疫逃避、抗病毒治療逃避，使得臨床檢測出現(xiàn)漏檢、用藥不當，以至延誤治療。本發(fā)明采用標記的RNA和肽核酸芯片雜交來檢測乙肝突變位點，能提高檢測的靈敏度和特異性，至今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容針對上述不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片及其制備方法，并同時公開乙肝已知突變位點的肽核酸檢測探針和陰、陽性對照探針，用于PCR擴增的上、下游引物。該肽核酸檢測芯片具有快速、高效、準確、平行診斷的特點，能為臨床用藥、治療提供重要依據(jù)。
本發(fā)明的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，包括基片和陣列式分布的肽核酸探針與對照的點涂層，基片是玻璃基片，尼龍膜之一。肽核酸探針與對照的點涂層是指在基片上均勻分布的，含有乙肝前核心抗原區(qū)(前C區(qū))和表面抗原區(qū)(S區(qū))已知突變位點和野生位點的24條檢測探針，2條陽性對照探針，1條陰性對照探針及空白點樣液對照。
上述的基片是未經(jīng)任何修飾的玻璃裸片、醛基化玻璃片、氨基化玻片和尼龍膜之一。
上述醛基化玻片采用飽和碳酸氫鈉溶液作為點樣液，氨基化、未經(jīng)任何化學修飾的玻璃裸片和尼龍膜采用雜交液作為點樣液。
上述的肽核酸探針所在陣列與對照的點涂層的大小，可以根據(jù)點的大小，點間距的變化而變化，陣列在基片上的分布數(shù)目可根據(jù)待分析樣品的數(shù)目而變化。
上述的肽核酸探針排列如附圖2所示，肽核酸探針點直徑為100μm，點間距為300μm時，肽核酸探針所在陣列與對應的點涂層大小為1.6mm×1.6mm。
上述的肽核酸檢測探針，包括乙肝表面抗原區(qū)已知的5個突變位點546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原區(qū)已知的7個突變位點1896G-A、1762A-T與1764G-A聯(lián)合突變、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901 G-A；突變位點肽核酸檢測探針12條，野生位點肽核酸檢測探針12條，合計肽核酸檢測探針24條。
上述的2條陽性肽核酸對照探針，分別源于前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)的核酸保守序列。
上述的陰性肽核酸對照探針源于人ATM基因中的17mer核酸序列。
上述的肽核酸探針是長度為14-18mer的肽核酸，均設計在乙肝病毒DNA反義鏈，其氨基末端連有O-連接子(O-1inker，8-amino-3，6-dioxaoctonic acid)，對應著DNA鏈的3′端。
本發(fā)明乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片的制備方法包括以下步驟1、肽核酸PNA檢測探針的設計及合成肽核酸探針的長度為14-18mer，均設計在乙肝DNA反義鏈。突變檢測位點盡可能設計在肽核酸探針的中間位置，所有探針的Tm值按GC堿基百分比計算，相差不超過10℃。其氨基末端連有O-連接子，對應著DNA鏈的3′端，即PNA與樣品DNA以反向平行方式結(jié)合。該芯片所用肽核酸探針及其序列見表1。PNA探針由德國麥德堡(MetabionGmbH)公司合成。
2、玻片的修飾與PNA探針的固定用含1％-5％3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液處理玻璃載玻片，即得到氨基化玻片。氨基化玻片經(jīng)5％-25％的戊二醛溶液處理2-5小時后，得到醛基化玻片。肽核酸含有氨基端，通過希佛氏堿反應與醛基化玻璃基片結(jié)合。醛基化玻片采用飽和的NaHCO3溶液作為點樣液，氨基化、未經(jīng)任何化學修飾的玻璃裸片和尼龍膜采用雜交液，即pH7.0的10mM的磷酸鹽緩沖液(0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)作為點樣液。
3、乙肝樣品DNA的提取、PCR擴增和熒光標記1)DNA提取取20-100μl乙肝血清，加入3倍體積的裂解液，混勻。加入等體積的氯仿、異戊醇溶液(24∶1)，離心后向吸取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，冷凍后離心，所得沉淀用70％的乙醇清洗2次。
2)PCR擴增所采用的PCR上下游引物分別為上游引物5′ATTAACCCTCACTAAAGGGGAGGCATACTTCAAAGACTGT 3′T3啟動子序列下游引物5′GATGGGATGGGAATACA 3′上游引物起始于乙肝病毒DNA正義鏈的1700位點(起始位點是以GeneBank號為AF100308的乙肝病毒DNA為參考)，長度為21個堿基，5′端連有19個堿基的T3啟動子序列。下游引物的長度為17個堿基，起始于乙肝病毒DNA正義鏈的601位點。PCR擴增區(qū)域為2133bp，包括了前C區(qū)與S區(qū)所有已知突變位點。
PCR擴增采用美國MJ Research PTC-225PCR擴增儀，擴增體系為25μl。程序如下94℃ 1.5min 1個循環(huán)94℃ 20sec、 55℃ 20sec、72℃ 2.5min共計35個循環(huán)72℃ 8min 1個循環(huán)所得PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)玻璃奶純化。
3)體外轉(zhuǎn)錄標記采用普洛麥格(Promega)公司商用試劑盒，在T3體外轉(zhuǎn)錄中加入Cy3-UTP標記。
4、肽核酸陣列的雜交和檢測，信號分析體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA經(jīng)片段化后與肽核酸陣列雜交。雜交溫度為65℃-85℃，時間為1-3個小時。雜交液采用10mM的磷酸鹽緩沖液pH7.0，內(nèi)含0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS。清洗液采用10mM的磷酸鹽緩沖液洗1次，5mM的磷酸鹽緩沖液洗2次。
雜交后的肽核酸芯片經(jīng)激光掃描儀掃描或熒光顯微鏡觀察并收集信號，依據(jù)掃描分析或熒光定量，陰性對照和點樣液對照無熒光信號，陽性對照探針有熒光信號。根據(jù)各位點野生型和突變型探針熒光信號的強弱來確定該位點是否有突變發(fā)生。表1 乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片中肽核酸探針的序列
表1肽核酸探針序列中黑體標記的堿基是待檢測的位點。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果1)PNA與DNA、RNA雜交所形成的PNA-DNA、PNA-RNA二聚體的Tm值、穩(wěn)定性要高于相應的DNA-DNA、DNA-RNA，存在一個堿基的差異，PNA-DNA的Tm值就會降低8-20℃。因而PNA芯片在識別單堿基差異方面具有獨特的優(yōu)勢。
2)PNA與RNA的雜交二聚體的穩(wěn)定性要高于PNA-DNA，故本發(fā)明采用RNA。長的單鏈RNA經(jīng)片段化后更易于雜交的進行。
3)PNA與DNA、RNA的反向平行結(jié)合(PNA的氨基端對應著DNA的3′端)所形成的二聚體的穩(wěn)定性要高于其正向平行結(jié)合方式(PNA的羧基端對應著DNA的3′端)，本發(fā)明正是采用反向平行結(jié)合方式。


圖1是乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片的示意圖。
其中，1為基片，2為肽核酸探針與對照的點涂層。
圖2是肽核酸檢測芯片中肽核酸探針分布圖。
其中，A1、A6、F1、F6均代表陽性對照PCS，B1、B6、F1、F6均代表陽性對照PCCC1與C6均代表陰性對照NC；D1與D6為點樣液對照；A2、3、4、5分別代表探針S1、S3、S5、S7；B2、3、4、5分別代表探針S2、S4、S6、S8；C2、3、4、5分別代表探針S9、C1、C3、C5；D2、3、4、5分別代表探針S10、C2、C4、C6；E2、3、4、5分別代表探針C7、9、11、13；F2、3、4、5分別代表探針C8、10、12、14。
圖3是上、下游引物擴增乙肝DNA所得到的PCR產(chǎn)物電泳圖譜。
其中，泳道1的白色條帶是目的擴增片段，長度為2136bp。泳道2是TaKaRaDL-2000分子量Marker，白色條帶從上到下長度分別為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，1OObp。
圖4是部分固定在醛基化玻片上的部分肽核酸檢測探針雜交后經(jīng)激光共聚焦掃描儀Scanarray4000(激光強度為80，PMT增益為80)掃描結(jié)果圖。
上排的三個點分別為1896、1762與1764聯(lián)合位點、1862三個位點的野生探針雜交后掃描結(jié)果。下排的三個點是與上排位點相對應的突變探針雜交后的掃描結(jié)果。根據(jù)熒光信號的強弱，可以斷定檢測樣品的1896與1862位點未發(fā)生突變，1762與1764聯(lián)合位點發(fā)生突變。
(五)
具體實施例方式
實施例1結(jié)構(gòu)如附圖1所示在基片1上陣列式均勻分布有肽核酸探針與對照的點涂層2，其中含有乙肝前C區(qū)和S區(qū)已知突變位點和野生位點的24條檢測探針，2條陽性對照探針，1條陰性對照探針及空白點樣液對照。陽性探針均位于陣列的四周，它不僅是陽性對照的作用，同時可以作為陽性信號，定位陣列。乙肝DNA樣品PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄標記后與肽核酸陣列雜交，由激光共聚焦掃描儀掃描得出結(jié)果，并進行分析與判斷。
實施例2玻片的修飾與肽核酸探針的固定1、玻片的修飾將空白玻璃載片用10％NaOH清洗，再用1％HCI酸液洗，水洗后甩干，即得到干凈的玻璃裸片。用1％3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液中處理30分鐘，然后用丙酮清洗3次，每次5分鐘，80℃烘烤15分鐘，得到的氨基化玻片。繼續(xù)用10％的戊二醛水溶液處理30分鐘，然后用雙蒸水清洗，真空干燥后得到醛基化修飾的玻片。
2、肽核酸探針的固定(以醛基化玻片為例)肽核酸探針的設計與選擇見表1所示。
肽核酸探針在醛基化玻片上的固定，用飽和的NaHCO3溶液作為點樣液。肽核酸探針濃度均為50μM，經(jīng)點樣儀點到相對應的玻片上(肽核酸探針在基片上的分布圖見附圖2)，點直徑為100μm，點間距為300μm。肽核酸陣列的大小為1.6mm×1.6mm。將點樣后得到的肽核酸芯片放到濕盒里，37℃水合2個小時。然后進行以下處理1)將玻片用0.2％的SDS溶液清洗兩次，每次5分鐘，以除去未結(jié)合的肽核酸。
2)將玻片浸于純水中清洗兩次，每次5分鐘。
3)將玻片用0.26％的硼氫化鈉溶液(用75％的磷酸鹽，25％的乙醇溶液配置)處理5分鐘，封閉未反應的醛基。
4)將玻片用0.2％的SDS溶液處理3次，每次1分鐘。
5)將玻片用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的純水清洗兩次，每次1分鐘。
6)用平板離心機，800rpm 10分鐘，甩干玻片，以雜交使用。
實施例3乙肝樣品DNA的提取、PCR擴增和標記1、乙肝樣品DNA的提取1)取100μl乙肝血清，加入3倍體積的裂解液(4M硫氰酸胍、巰基乙醇、0.1MTris-CI，pH7.5)，混勻。
2)加入等體積的氯仿、異戊醇溶液(24∶1)，充分混勻。室溫下12000rpm離心15分鐘。
3)小心將上清液移入另一1.5ml離心管中，加入2倍體積的無水乙醇。-20℃放置2個小時。4℃，12000rpm離心15分鐘。
4)離心后所得沉淀用70％的乙醇清洗2次，每次在4℃，12000rpm離心10分鐘。
5)沉淀自然干燥后溶于16μl純水中。
2、PCR目的片段的擴增和純化1)PCR擴增體系為25μl，其中包括10×PCR緩沖液 2.5μl2mM dNTP 2.5μl
上游引物(5μM) 2.0μl下游引物(5μM) 2.0μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl乙肝DNA 16.0μl25.0μl其中10×PCR緩沖液的成分為500mM Tris-CI(pH8.3)，20mM MgCI2、0.75％牛血清白蛋白。
2)PCR擴增采用MJ Research PTC-225PCR擴增儀，程序為94℃ 1.5min 1個循環(huán)94℃ 20sec、55℃ 20sec、72℃ 2.5min共計35個循環(huán)72℃ 8min 1個循環(huán)3)取5μl PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。如附圖3所示。
4)PCR產(chǎn)物的純化采用玻璃奶純化。
3、PCR產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)錄熒光標記采用Promega公司T3轉(zhuǎn)錄試劑盒，體外轉(zhuǎn)錄反應體系為10μl，Cy3-UTP購于安法瑪西亞(Amersham Phamacia)公司。具體步驟如下1)T3轉(zhuǎn)錄反應包括T3 5×轉(zhuǎn)錄緩沖液 2μl100mM的ATP、CTP、GTP 各0.75μl100mM的UTP 0.5μl100mM Cy3-UTP， 0.25μlPCR純化產(chǎn)物 4μl(5-50ng)T7酶混合物 1μl10μl2)將反應混合物混勻，37℃溫育1小時。
3)體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA經(jīng)調(diào)整濃度，使之溶于30mM的MgCI2溶液，于94℃孵育30分鐘從而得到片段化的RNA。
實施例4肽核酸陣列的雜交和檢測，信號分析1.肽核酸陣列的雜交1)將1μl片段化標記的RNA稀釋到10μl事先預熱到雜交溫度的經(jīng)DEPC處理過的肽核酸雜交液中(10mM的磷酸鹽緩沖液pH7.0，內(nèi)含0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)，混勻。
2)將上述熒光標記的RNA樣品滴到肽核酸芯片探針所在區(qū)域的中央，在陣列區(qū)域蓋上蓋玻片。
3)將該玻片放入預熱到雜交溫度、盛有純水的濕盒(購于西格瑪Sigma公司)中，以避免陣列干燥。
4)將玻片置于雜交爐中，雜交溫度為75℃，時間為1.5個小時。
5)雜交結(jié)束后將玻片放入10mM的經(jīng)DEPC處理的磷酸鹽緩沖液清洗5分鐘。
6)然后放入5mM的經(jīng)DEPC處理的磷酸鹽緩沖液2次。每次5分鐘。
7)在室溫下，使用平板離心機在800rpm下離心5分鐘，將玻片甩干。
2.肽核酸陣列的檢測和結(jié)果分析雜交后的肽核酸芯片經(jīng)激光共聚焦掃描儀ScanArray4000掃描探針所在的陣列區(qū)域并收集信號，分析檢測結(jié)果。掃描結(jié)果顯示陰性對照和點樣液對照無熒光信號，陽性對照有熒光信號，根據(jù)對比相對應的正常和突變探針的熒光信號強弱來區(qū)別該位點是否有突變的發(fā)生。附圖4是前C區(qū)1896、1762與1764聯(lián)合位點、1862三個位點共計6條肽核酸探針雜交后經(jīng)激光共聚焦掃描儀Scanarray4000掃描(激光強度為80，PMT增益為80)后的結(jié)果圖。上排的三個點分別是1896、1762與1764聯(lián)合位點、1862三個位點的野生探針雜交后掃描結(jié)果。下排的三個點是與上排位點相對應的突變探針的雜交后掃描結(jié)果。根據(jù)熒光信號的強弱，可以斷定檢測樣品的1896與1862位點未發(fā)生突變，1762與1764位點由原來的1762A、1764G聯(lián)合突變?yōu)?762T、1764A。
實施例5以玻璃裸片、氨基化玻片或尼龍膜之一為基片的乙肝病毒突變位點的肽核酸檢測芯片以玻璃裸片、氨基化玻片或尼龍膜之一為基片的乙肝病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，玻璃裸片和氨基化玻片的制備如實施例2步驟1玻片的修飾。氨基化和未經(jīng)化學修飾的裸片、尼龍膜采用雜交液pH7.0的10mM的磷酸鹽緩沖液(0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)作為點樣液。肽核酸探針濃度均為50μM，經(jīng)點樣儀點到相對應的玻片上(肽核酸探針在基片上的分布圖見附圖2)，點直徑為100μm，點間距為300μm。肽核酸陣列的大小為1.6mm×1.6mm。點樣后的玻璃裸片、氨基化玻片或尼龍膜，經(jīng)紫外交聯(lián)5分鐘后可直接用于雜交。乙肝樣品DNA的提取、PCR擴增和標記同實施例3，肽核酸陣列的雜交和檢測，信號分析見實施例4。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，包括基片和陣列式分布的肽核酸探針與對照的點涂層，其特征在于，所述的基片是玻璃基片，尼龍膜之一；所述的肽核酸探針與對照的點涂層是指在基片上均勻分布的，含有乙肝前核心抗原區(qū)、表面抗原區(qū)已知突變位點和野生位點的24條檢測探針，2條陽性對照探針，1條陰性對照探針及空白點樣液對照。
2.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，所述的基片是未經(jīng)任何修飾的玻璃裸片、醛基化玻片、氨基化玻片和尼龍膜之一。
3.如權(quán)利要求2所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，醛基化玻璃片采用飽和碳酸氫鈉溶液作為點樣液，氨基化、未經(jīng)任何化學修飾的玻璃裸片和尼龍膜采用雜交液作為點樣液。
4.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，所述的肽核酸探針所在陣列與對照的點涂層的大小，可以根據(jù)肽核酸探針點的大小，點間距的變化而變化；陣列在基片上的排列和分布數(shù)目可以根據(jù)待分析樣品的數(shù)目而變化。
5.如權(quán)利要求1或4所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，所述的肽核酸探針點直徑為100μm，點間距為300μm時，肽核酸探針所在陣列與對應的點涂層大小為1.6mm×1.6mm。
6.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，所述的肽核酸檢測探針，包括乙肝表面抗原區(qū)已知的5個突變位點546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原區(qū)已知的7個突變位點1896G-A、1762A-T與1764G-A聯(lián)合突變、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901 G-A；突變位點肽核酸檢測探針12條，野生位點肽核酸檢測探針12條，合計肽核酸檢測探針24條。
7.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，所述的2條陽性肽核酸對照探針，分別源于前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)的核酸保守序列。
8.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，所述的陰性肽核酸對照探針源于人ATM基因中的17mer核酸序列。
9.如權(quán)利要求1、6或7所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片，其特征在于，所述的肽核酸探針是長度為14-18mer的肽核酸，均設計在乙肝病毒DNA反義鏈，其氨基末端連有O-linker，對應著DNA鏈的3′端。
10.一種如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片的制備方法，包括(1)肽核酸探針的設計及合成，(2)玻片的修飾與肽核酸探針的固定，(3)乙肝樣品DNA的提取、PCR擴增和標記，(4)肽核酸陣列的雜交和檢測，信號分析等步驟；其特征在于，PCR擴增區(qū)域為2133bp，所采用的上游引物起始于乙肝病毒DNA正義鏈的1700位點，序列為5′GAGGCATACTTCAAAGACTGT 3，其5′末端連有T3啟動子序列ATTAACCCTCACTAAAGGG；下游引物起始于乙肝病毒DNA正義鏈的601位點，序列為5′GATGGGATGGGAATACA 3′；PCR產(chǎn)物是利用T3啟動子，通過體外轉(zhuǎn)錄進行熒光標記；轉(zhuǎn)錄后得到的單鏈RNA經(jīng)片段化后與肽核酸陣列雜交。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒突變位點的肽核酸檢測芯片及其制備方法，芯片包括基片和陣列式分布的肽核酸探針與對照的點涂層，基片是玻璃基片，尼龍膜之一；肽核酸探針與對照的點涂層是指含有乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知突變位點和野生位點的24條檢測探針，2條陽性對照探針，1條陰性對照探針及空白點樣液對照；乙肝病毒DNA樣品的PCR擴增利用帶有T3啟動子的引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄進行熒光標記，所得單鏈RNA經(jīng)片段化與肽核酸芯片雜交，由雜交信號的強弱來分析突變位點。本芯片同時平行檢測乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的突變位點，具有快速、高效、診斷精確的特點。
文檔編號C12Q1/68GK1431318SQ0213562
公開日2003年7月23日 申請日期2002年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者韓金祥, 魯艷芹 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心