一種基于dna芯片的數字化定量檢測核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法，通過在基片上固定有擴增引物，通過單個核酸分子模版擴增目標核酸，標記探針與擴增核酸雜交檢測標記基團上的信息，或者通過微測序方法讀出擴增核酸分子信息，便可讀出每一個克隆點的信號，每個信號點就代表原始目標DNA分子的數量，統(tǒng)計信號點數量計算出該核酸的數量。為核酸分子定量分析提供一種新方法，建立快速，準確，便宜的核酸檢測技術。
【專利說明】—種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法。

【背景技術】
[0002]一切生命組成都離不開蛋白質，而蛋白質是由核酸編碼的，因此核酸可以說是生命的基礎。核酸(如DNA)包含著所有生物機體的藍圖，對核酸序列的研究對生命科學至關重要。隨著人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的開展和完成，使人類步入了后基因時代，對當代的生物學研究和醫(yī)學研究產生了巨大的影響，分子生物學相關學科得到了迅猛的發(fā)展。人們在對核酸的研究過程中，除了關注它的序列、突變等一些定性的方面以夕卜，還要關注它的量，因為生物體內各種基因mRNA量的變化，會導致翻譯出的蛋白質數量的改變，最終發(fā)生病理變化。故測定mRNA的量可以判斷生理病理變化情況。同樣，在臨床上，通過檢測病毒基因的數量，可以判斷病毒的復制情況。而基因表達研究、藥物篩選、藥效學評價和致病基因檢測診斷等也需要對核酸進行定量檢測。因此，在分子生物學和生物醫(yī)學中基因的定量檢測具有重要意義。
[0003]傳統(tǒng)的核酸定量方法，如化學發(fā)光法、分子光譜分析法以及電化學分析法由于在定量分析上準確度差而且無法對微量樣本做出分析，已不適應如今快速發(fā)展的結構分子生物學、基因組學、蛋白質組學、生物技術藥物代謝動力學等新興生命科學分支的要求。取而代之的是近年發(fā)展起來的具有高靈敏度、高通量和具有自動化分析能力的核酸定量方法，如:定量聚合酶鏈式反應技術、基因表達系列分析(Serial Analysis ofExpress1n, SAGE)、微陣列技術(Microarrays)。
[0004]隨著高量測序技術的應用，對核酸定量分析要求越來越高，目前這些核酸檢測技術，都難以達到數字化精確檢測水平。如果用這些相對落后的定量檢測技術對目前先進的測序數據進行定量分析，明顯不能滿足要求。本發(fā)明的目的就是通過在基片上直接進行單分子擴增技術，然后檢測擴增產物達到對核酸數字化定量分析。為核酸的定量分析提供一種新方法，建立快速，準確，便宜的核酸定量分析技術。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法，該方法利用每個模板DNA分子經過固相擴增后都得到了大量的分子，對這些分子的檢測很容易利用目前的熒光探針或微測序技術檢測，達到絕對定量檢測DNA目的。
[0006]本發(fā)明通過以下技術方案實現:
[0007]—種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法，在核酸的數字化定量檢測是通過在基片上固定有擴增引物，通過單個核酸分子模版擴增目標核酸，標記探針與擴增核酸雜交檢測標記基團上的信息，或者通過微測序方法讀出擴增核酸分子信息，統(tǒng)計信號點數量計算出該核酸的數量。
[0008]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，檢測對像核酸為脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。
[0009]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，所述的基片分成一個或一個以上的分區(qū)，每一個分區(qū)固定有一種引物，各區(qū)域的引物序列相同或不相同，所述的分區(qū)可以采用物理分區(qū)，即把引物固定時，每一個區(qū)域都隔開一定距離。
[0010]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，所述的單個模版核酸分子含有與固定在基片上的一個引物序列互補配對的一段序列，含有與目標核酸上相鄰兩段堿基序列互補配對的兩段序列，含有與標記探針上一段堿基序列互補配對的一段序列。
[0011]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，未知單鏈DNA模板位于溶液、平面基片、96或384孔板或修飾的珠子上，未知單鏈DNA模板通過常規(guī)的PCR，滾環(huán)擴增、固相擴增、橋式擴增以及固相酶連接反應增加其分析用數量，擴增可以是單重的，即一次擴增一個目的片斷，或者是多重的，即一次擴增多個目的片斷。
[0012]本發(fā)明所述的檢測核酸的方法，定量檢測DNA模板數量為一個或多個同時進行。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:1)本發(fā)明的最大優(yōu)點是實現對核酸分子的數字化定量分析，由于模板核酸分子通過引物固定在DNA芯片上進行固相擴增，得到的分子量大，對這些分子的檢測很容易利用目前的熒光探針或微測序技術檢測，所以操作簡單、可行性高；2)本發(fā)明的所需要的試劑和儀器均為常用，無需特殊購買，相比較傳統(tǒng)的數字化定量檢測核酸的方法PCR而言，擴增效率特異性高，節(jié)省擴增時間，避免了熱循環(huán)對擴增的影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是用于連接成環(huán)的DNA序列結構示意圖；
[0015]圖2是圖1所示序列在連接酶體系和模板e ；
[0016]圖3是圖1所示序列在連接酶體系和模板e連接成閉環(huán)結構；
[0017]圖4是固定有引物序列的DNA芯片；
[0018]圖5是DNA聚合酶及其反應體系和圖3的閉環(huán)DNA存在下進行滾環(huán)擴增后圖示；
[0019]圖6是突光標記探針識別圖示。

【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內容，依據本發(fā)明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內。
[0021]實例I熒光探針雜交法檢測疼痛相關基因BDNF在VTA區(qū)的表達
[0022]設計以下序列:
[0023]Bdnf-P:5’ P-GCGTGCAAATTG CCCTATAGTGAGTCGTATTACTATAGTGTCACCGGCAAAGGATCG3，；
[0024]Gapdh-P:5’ P GTTATCGTGTAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTTAGTCACTACTGCACAACTGGTT3，；
[0025]IM-primer:5’ amino_TTTTTTTTTTTTTTAATACGACTCACTATAGGG3’ ；
[0026]Probel:5’ cy3_CTATAGTGTCACC3’ ；
[0027]Probe2:5， cy5_GTTAGTCACTACT3，；
[0028]T18:TTTTTTTTTTTTTTTTTT。
[0029]提取小鼠VTA區(qū)總RNA，利用反轉錄引物T18及反轉錄試劑盒，把RNA轉為cDNA。在連接反應體系中加入反轉錄好的cDNA，Bdnf-P和Gapdh-P混合在一起進行連接反應使Bdnf-P和Gapdh-P連接成環(huán)狀單鏈DNA (此時環(huán)狀單鏈DNA的量就代表著cDNA模板量的多少)；同時制備醒基修飾的DNA芯片,把氨基修飾的引物IM-primer固定到醒基修飾的DNA芯片上(可以按照成熟的傳統(tǒng)DNA芯片制備方法獲得，也可以通過商業(yè)途徑獲得)；phi29DNA聚合酶(也可以選用Bst DNA聚合酶)以及相應的反應體系中加入之前連接產物作為模板，在芯片上進行單分子固相擴增。然后利用Probel和Probe2探針進行雜交，在芯片掃描儀或共聚焦顯微鏡下觀察熒光，Probel所攜帶熒光cy3信號代表Bdnf基因在VTA區(qū)的表達量，Probe2所攜帶熒光cy5信號代表Gapdh基因在VTA區(qū)的表達量，計算熒光點數目即為BDNF和GAPDH基因的表達量。
[0030]實例2微測序法檢測疼痛相關基因BDNF，NNAT以及內參基因GAPDH在VTA區(qū)的表達。
[0031]設計以下序列:
[0032]Bdnf-P:5’ P-GCGTGCAAATTG CCCTATAGTGAGTCGTATTACTATAGTGTCACCGGCAAAGGATCG3，；
[0033]Gapdh-P:5’ PGTTATCGTGTAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTTAGTCACTACTGCACAACTGGTT3，；
[0034]Nnat-P:5’ PGCTGCAGGTGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTATTGATCCATGAGACTTCCGCGTGCT3，；
[0035]IM-primer:5’ amino_TTTTTTTTTTTTTTAATACGACTCACTATAGGG3’ ；
[0036]T18 ;TTTTTTTTTTTTTTTTTT.
[0037]Seq-primer:CCCTATAGTGAGTCGTATTA。
[0038]按實例I方法,把Bdnf-P、Gapdh-P和Nnat-Ρ連接成單鏈DNA環(huán),單分子固相擴增后，把Seq-primer與擴增模板進行雜交，然后把熒光標記的cy3_dCTP，Cy5_dGTP，fam-dUTP以及相應的聚合酶體系一起進行延伸反應，在芯片掃描儀或共聚焦顯微鏡下觀察熒光熒光信號，cy3-dCTP, cy5-dGTP, fam-dUTP所對應的信號分別為Bdnf, Gapdh和Nnat基因，計算熒光點數目即為BDNF、GAPDH和Nnat基因的表達量。
[0039]實例3微測序法檢測疼痛相關基因BDNF，NNAT以及內參基因GAPDH在不同處理小鼠VTA區(qū)的表達。
[0040]與實例2所用試劑和方法相同，差異之處在于所制備的固定有IM-primer通過阻水筆或其他手段把一張DNA芯片畫分為不同區(qū)域，不同區(qū)域對不同處理樣本進行擴增。
[0041]如圖1所示，被檢測核酸分子e，其中a與d互補，b是能與固定在DNA芯片上的引物序列反向互補序列，c是任一段DNA序列，可通過DNA互補配對雜交原則被熒光標記探針所檢測或通過微測序列方法檢測，如圖2所示，連接酶體系和模板e，該序列在連接酶體系和模板e存在時，可以連接成環(huán)(圖3)，在DNA聚合酶及其反應體系和圖3的閉環(huán)DNA存在下，在固有芯片(圖4)上進行滾環(huán)擴增，擴增后如圖5所示，然后利用Probel和Probe2探針進行雜交，在芯片掃描儀或共聚焦顯微鏡下觀察熒光，如圖6所示，被熒光標記探針識別。
【權利要求】
1.一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法，其特征在于:通過在基片上固定有擴增引物，通過單個核酸分子模版擴增目標核酸，標記探針與擴增核酸雜交檢測標記基團上的信息，或者通過微測序方法讀出擴增核酸分子信息，統(tǒng)計信號點數量計算出該核酸的數量。
2.根據權利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:該方法檢測對像核酸為脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。
3.根據權利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:所述的基片分成一個或一個以上的分區(qū)，每一個分區(qū)固定有一種引物，各區(qū)域的引物序列相同或不相同。
4.根據權利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:所述的單個模版核酸分子含有與固定在基片上的一個引物序列互補配對的一段序列，含有與目標核酸上相鄰兩段堿基序列互補配對的兩段序列，含有與標記探針上一段堿基序列互補配對的一段序列。
5.根據權利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:未知單鏈DNA模板位于載體上，通過PCR，滾環(huán)擴增、固相擴增、橋式擴增以及固相酶連接反應增加其分析用數量。
6.根據權利要求5所述的檢測核酸的方法，其特征在于:所述的載體為溶液、平面基片、孔板或修飾的珠子。
7.根據權利要求1所述的檢測核酸的方法，其特征在于:該方法定量檢測DNA模板數量為一個或多個同時進行。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357549SQ201410500400
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權日:2014年9月25日
【發(fā)明者】李燕強, 韓文燦, 潘志強, 夏靜, 許可 申請人:徐州醫(yī)學院