可延展聚合物內(nèi)的核酸的檢測和定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了從粘附于可W在活生物體內(nèi)延展的聚合物、特別是可W在所述活生 物體的口腔中延展的聚合物或俘獲在所述聚合物內(nèi)的微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取核酸的 方法。本發(fā)明還提供了粘附于可延展聚合物例如口香糖或俘獲在其中的微生物的檢測和定 量方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)于口香糖首次使用的描述可W追溯到古希臘，在那里人們使用來自于乳香黃連 木的樹脂來止渴或清新口氣。直至19世紀(jì)晚期，第一塊口香糖才成功上市，在那時(shí)，人屯、果 樹的橡膠狀樹汁形成了 口香糖的基礎(chǔ)。在20世紀(jì)晚期，口香糖不僅被當(dāng)作生活方式的象 征，而且也已報(bào)道了對認(rèn)知表現(xiàn)、情緒、警覺性和食欲控制的影響。此外，口香糖已被更多地 朝向口腔護(hù)理和功能性食品（"營養(yǎng)品"）方向開發(fā)，因?yàn)樗峁┝巳菀讘?yīng)用的藥物遞送介 質(zhì)，對口腔健康具有潛在益處。高達(dá)每人每年2. 5kg的高消費(fèi)率已使其成為數(shù)十億美元的 產(chǎn)業(yè)。
[0003] -般來說，口香糖由被稱為膠基的合成彈性體如聚乙酸乙締醋或聚異下締的水不 溶性混合物構(gòu)成。對膠基材料的重要要求是它們在口中不溶解，并且可W被長時(shí)間巧嚼而 不經(jīng)歷組成變化。在所有可商購的口香糖中，膠基被增補(bǔ)有結(jié)構(gòu)劑、軟化劑和調(diào)味劑，而目 前，糖常常被人造甜味劑例如山梨糖醇、木糖醇或甘露糖醇代替。
[0004] 據(jù)描述，包含木糖醇和其他人造甜味劑能減少牙齒上口腔生物膜的形成。口腔生 物膜是世界上最普遍的感染性疾病、即離齒和牙周病的病因。離齒由牙釉質(zhì)的天然存在的 去礦化與再礦化之間的失衡造成。當(dāng)由于糖被牙齒上口腔生物膜的所選成員發(fā)酵而造成口 腔生物膜的pH下降到低于5. 5時(shí)，發(fā)生去礦化。大多數(shù)人造糖不被或幾乎不被口腔細(xì)菌發(fā) 酵，因此不降低抑。此外，日香糖引起巧嚼增加，其刺激唾液產(chǎn)生，因此提高了日腔中再礦 化所需的巧和憐酸鹽的濃度。已向商品化口香糖添加了氣化物，W防止牙釉質(zhì)去礦化并刺 激再礦化。將巧嚼口香糖當(dāng)作每日口腔衛(wèi)生程序的補(bǔ)充是有吸引力的，特別是因?yàn)楣磐?來大多數(shù)人不能維持預(yù)防疾病所需的口腔生物膜控制水平。運(yùn)導(dǎo)致了向口香糖滲入抗微生 物劑例如氯己定和草藥提取物，并且事實(shí)上已證明口香糖在防止口腔生物膜的重新生長方 面是成功的。盡管已知巧嚼口香糖有助于除去齒間殘?jiān)痑ko化ar等，DentalResearch Journal7:64 - 69, 2011)，并且已向口香糖添加去污劑例如多憐酸鹽W提高它們的清潔 力，但尚不清楚巧嚼口香糖是否真正從口腔除去細(xì)菌。特別是通過口香糖優(yōu)先除去引起疾 病的生物體例如產(chǎn)酸的變異鏈球菌（Streptococcusmutans)或被視為牙釉質(zhì)的初始定植 者的物種，使口香糖變成每日口腔衛(wèi)生程序的有價(jià)值的補(bǔ)充。
[0005] 人類口腔含有不同且大量的菌群，并且胃腸系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的許多疾病可W在口 腔中顯現(xiàn)。還存在許多口腔特有的疾病。除了細(xì)菌生物體之外，口腔微生物可W包括真菌、 原生動(dòng)物和病毒物種，并且許多運(yùn)些微生物粘附于牙齒、銀溝、舌和頰粘膜。每個(gè)位點(diǎn)具有 允許生物體實(shí)現(xiàn)駐留的獨(dú)特方式。許多運(yùn)些微生物可能粘附于它們在口腔中時(shí)接觸的聚合 物，并且運(yùn)些聚合物除了包括如上所述的口香糖之外，還包括牙科和牙周器具和組合物。
[0006] 因此，對于開發(fā)檢測、鑒定和定量粘附于口腔中的聚合物或俘獲在所述聚合物內(nèi) 的微生物、例如在使用后被捕獲在口香糖中的細(xì)菌的新方法，存在著需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 已知口香糖對維持口腔健康有貢獻(xiàn)；然而，尚不清楚口香糖是否能夠?qū)嶋H上從口 腔除去細(xì)菌和其他微生物。本發(fā)明提供了一種使用擴(kuò)增方法例如定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 來檢測和定量來自于微生物的核酸的方法，所述微生物粘附于活生物體口腔內(nèi)的可延展聚 合物例如口香糖的外表面和/或俘獲在所述聚合物的內(nèi)表面中。本文中提供的研究描述了 一種定量和定性被捕獲在巧嚼后的口香糖中的細(xì)菌的數(shù)量的方法（體外或體內(nèi)）。
[0008] 本發(fā)明提供了從可W在活生物體內(nèi)延展的聚合物提取核酸的方法，所述方法包 括：a)將所述聚合物與i)有機(jī)溶劑和ii)緩沖溶液相接觸，W及b)分離所述有機(jī)溶劑和 緩沖溶液，其中從所述聚合物提取的核酸被包含在所述緩沖溶液內(nèi)。本發(fā)明設(shè)想了在所述 聚合物與活生物體相接觸后執(zhí)行所述從聚合物提取核酸的方法。所述方法可W在體外或所 述活生物體外部執(zhí)行。
[0009] 運(yùn)些方法還可W包括鑒定從所述聚合物提取的核酸的來源的步驟，和/或?qū)乃?述聚合物提取的核酸進(jìn)行定量的步驟。使用擴(kuò)增方法例如聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換、連接酶鏈 反應(yīng)、解旋酶依賴性擴(kuò)增、等溫逆轉(zhuǎn)錄-嗜熱性解旋酶依賴性擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增和基于序列的擴(kuò)增來進(jìn)行鑒定步驟或定量步驟。
[0010] 本發(fā)明的方法從可W在活生物體中延展、例如可W在活生物體的口腔中延展的聚 合物提取核酸。術(shù)語"可W在活生物體中延展"是指在活生物體中的溫度和抑下是柔性和 初性的聚合物，但在暴露于由所述生物體施加的不同力和條件（例如溫度、pH、酶）時(shí)聚合 物的組成是穩(wěn)定的。例如，本發(fā)明的方法包括對由生物體施加的力（例如牙齒或牙銀的巧 嚼、研磨或咬切）、生物體中的溫度（例如生物體口腔的溫度）或化學(xué)條件（例如由生物體 產(chǎn)生的酶、活生物體口腔的pH)做出響應(yīng)可W延展的聚合物。運(yùn)些可延展聚合物可能是有 機(jī)的（具有碳基（carbonbase))，因此運(yùn)些聚合物將溶解在本發(fā)明的方法的有機(jī)溶劑中。 運(yùn)樣的聚合物的實(shí)例包括口香糖、泡泡糖或膠基。
[0011] 在一種實(shí)施方式中，在本發(fā)明的任何方法中使用的可延展聚合物是彈性體，例如 聚乙酸乙締醋、聚下締、聚異下締、異下締-異戊二締共聚物（下基彈性體）、苯乙締-下 二締、苯乙締-下二締共聚物、聚乙酸乙締醋、聚異戊二締、聚乙締、乙酸乙締醋-月桂酸 乙締醋共聚物，娃酬、節(jié)路頓膠、糖膠樹膠、索馬膠（sorva)和己拉塔樹膠（massaran化ba balata)或其組合。
[0012] 在另一種實(shí)施方式中，在本發(fā)明的任何方法中使用的可延展聚合物在牙科或牙周 組合物、器具或裝置內(nèi)。例如，所述可延展聚合物可W是包含在牙髓（牙科）或牙周器械 或組合物上或其內(nèi)的牙科樹脂或聚合物，例如在牙套、填料、義齒、牙橋、牙冠、根管、牙科內(nèi) 嵌體、牙科外嵌體和鑲蓋中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科裝置（例如支架或 承載物）、頌面器具例如聘裂板、上頌支架和正崎矯治器上或其中。運(yùn)些可延展聚合物是甲 基丙締酸甲醋、聚甲基丙締酸甲醋（PMM)、聚甲基丙締酸乙醋（PEM)、甲基丙締酸甘油醋 (GMA)、二甲基丙締酸S乙二醇醋燈EGDMA)、雙酪A-甲基丙締酸甘油醋度IS-GMA)、古塔波 膠（guttapercha)和聚下締，包括a-下締、順下締、P-下締、反P-下締、異下締、尼龍 和可生物降解聚合物例如聚丙交醋（PLA)或其組合。
[0013]在本發(fā)明的任一方法中，使用有機(jī)溶劑和緩沖溶液從聚合物提取核酸。術(shù)語"有機(jī) 溶劑"是指能夠溶解或分散一種或多種其他物質(zhì)的基于碳的溶劑?？蒞使用有機(jī)溶劑例如 氯仿、二甲苯、甲苯、1,2-二氯苯、己燒、四氨巧喃、二氯甲燒或丙酬來進(jìn)行本發(fā)明的任一方 法。
[0014] 術(shù)語"緩沖溶液"是指由弱酸及其共輛堿或弱堿及其共輛酸的混合物構(gòu)成W便 保持溶液的抑幾乎恒定的水性溶液?？蒞使用分子生物學(xué)領(lǐng)域中常規(guī)的并且核酸在其 中穩(wěn)定的任何緩沖溶液，例如Tris緩沖液、TBE緩沖液燈ris-棚酸-EDTA)和TAE緩沖液 燈ris-乙酸-EDTA)來進(jìn)行本發(fā)明的任一方法。在特定實(shí)施方式中，緩沖溶液是包含S(徑 甲基）氨基甲燒的化is緩沖液?；痠s緩沖液也被稱為化is堿、T;rizma、T;risamine、THAM、 氨下S醇、氨基下S醇和緩血酸胺燈romethane)。
[0015] 在本發(fā)明的任一方法中，所述聚合物可W被有機(jī)溶劑部分或完全溶解。
[0016] 在本發(fā)明的任一方法中，從所述聚合物的內(nèi)表面提取核酸。本發(fā)明還提供了從所 述聚合物提取核酸的方法，其中至少約99%的粘附于所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的 核酸被提取，至少約98%的粘附于所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的核酸被提取，至少 約95%的粘附于所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的核酸被提取，至少約90%的粘附于 所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的核酸被提取，至少約85 %的粘附于所述聚合物或俘獲 在所述聚合物中的核酸被提取，至少約80 %的粘附于所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的 核酸被提取，至少約75%的粘附于所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的核酸被提取，至少 約60%的粘附于所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的核酸被提取，至少約55%的粘附于 所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的核酸被提取，或至少約50 %的粘附于所述聚合物或俘 獲在所述聚合物中的核酸被提取。
[0017] 在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了從粘附于所述聚合物或俘獲在所述聚合物中的 微生物、包括俘獲在所述聚合物的內(nèi)表面中的微生物或粘附于所述聚合物的外表面或俘 獲在所述聚合物的外表面中的微生物提取核酸的方法。例如，本發(fā)明提供了其中核酸的 來源是細(xì)菌、病毒、真菌或原生動(dòng)物的方法。具體來說，核酸的來源可W是口腔的病原細(xì) 菌或共生細(xì)菌，例如變異鏈球菌（Streptococ州Smutans)、口腔鏈球菌（Streptococ州S oralis)、內(nèi)氏放線菌（Actinomycesnaeslundii)、血鏈球菌（Streptococcussanguinis)、 牙銀化P林單胞菌任orphyromomasgingivalis)、中間化P林單胞菌（Po巧hymomas intermedia)、福氏擬桿菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直月易 彎曲桿菌（Camp}dobacterrectus)、糾纏真桿菌巧ubacteriumnodatum)、微小消化鏈 球菌(Peptostreptococcusmicros)、中間型鏈球菌(Streptococcusintermedius)、 Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齒垢密螺旋體（Treponemadenticola)、曬蝕 艾肯菌巧：ikenellacorrodens)、牙銀二氧化碳嗜纖維菌（Capno巧to地agagingivalis)、 格氏鏈球菌（Streptococ州sgordonii)、小韋榮氏球菌（Veillonellaparvula)、核粒梭桿 菌（F'usobacteriumnucleatum)、中間普雷沃菌（Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞桿 菌(Xactobacillussalivarius)、唾液鏈球菌（Str巧tococ州Ssalivarius)和遠(yuǎn)源鏈球菌 (Streptococcussobrinus)。
[0018] 在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了從哺乳動(dòng)物細(xì)胞提取核酸的方法，所述哺乳 動(dòng)物細(xì)胞例如人類細(xì)胞、犬類細(xì)胞、貓類細(xì)胞、鼠類細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、牛類細(xì)胞、馬類細(xì)胞、綿 羊細(xì)胞、山羊細(xì)胞、靈長類細(xì)胞、來自于水生哺乳動(dòng)物例如嫁和海豚的細(xì)胞W及來自于其他 外來哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。例如，本發(fā)明提供了其中核酸的來源是上皮細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞、成纖維 細(xì)胞、干細(xì)胞或角膜細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了從癌細(xì)胞提取核酸的方法。
[0019] 本發(fā)明的另一方面是粘附于可W在活生物體內(nèi)延展的聚合物或俘獲在所述聚合 物內(nèi)的微生物的檢測方法，所述方法包括：a)將至少一部分所述聚合物溶解在有機(jī)溶劑和 緩沖溶液中，b)分離所述有機(jī)溶劑和緩沖溶液，其中從所述微生物提取的核酸被包含在所 述緩沖溶液內(nèi)，W及C)使用至少一種對所述微生物特異的寡核巧酸引物擴(kuò)增所述核酸。此 夕F，所述方法可W使用兩種或更多種引物、=種或更多種引物來進(jìn)行。在運(yùn)種方法中，所檢 測的微生物可能粘附于所述聚合物的外表面或俘獲在所述聚合物的外表面中或俘獲在所 述聚合物的內(nèi)表面中。本發(fā)明設(shè)想了在將聚合物與活生物體相接觸后執(zhí)行檢測粘附于所述 聚合物或俘獲在所述聚合物中的微生物的方法。所述方法在體外或所述活生物體的外部進(jìn) 行。運(yùn)些方法的執(zhí)行可用于質(zhì)量控制目的，例如在食品安全、食品腐敗和發(fā)酵領(lǐng)域中工作， 并用于與食品相接觸的聚合物例如包裝物中的聚合物的微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。運(yùn)些方法的執(zhí)行 也可用于診斷對象口腔的感染、疾病、障礙或病癥，用于確定對象發(fā)生疾病、障礙或病癥的 易感性，或用于產(chǎn)生對象的微生物分布情況（profile)。
[0020] 可W使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來進(jìn)行運(yùn)些方法的擴(kuò)增步驟。例如，可W使用 聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換、連接酶鏈反應(yīng)、解旋酶依賴性擴(kuò)增、等溫逆轉(zhuǎn)錄-嗜熱性解旋酶依 賴性擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、基于序列的擴(kuò)增或基于序列的擴(kuò)增來擴(kuò)增粘附于聚 合物或俘獲在聚合物中的微生物的核酸。
[0021] 運(yùn)些方法還可W包括對粘附于聚合物或俘獲在聚合物中的微生物的數(shù)量進(jìn)行定 量的步驟。使用擴(kuò)增方法例如聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換、連接酶鏈反應(yīng)、解旋酶依賴性擴(kuò)增、等 溫逆轉(zhuǎn)錄-嗜熱性解旋酶依賴性擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增或基于序列的擴(kuò)增來進(jìn) 行鑒定步驟或定量步驟。
[0022] 本發(fā)明提供了粘附于可W在活生物體內(nèi)延展的聚合物例如口香糖、泡泡糖或膠基 或俘獲在所述聚合物中的微生物的檢測方法。運(yùn)些可延展聚合物可能是有機(jī)的（具有碳 基），因此運(yùn)些聚合物將溶解在本發(fā)明的方法的有機(jī)溶劑中。在一種實(shí)施方式中，所述可延 展聚合物是彈性體例如聚乙酸乙締醋、聚下締、聚異下締、異下締-異戊二締共聚物（下基 彈性體）、苯乙締-下二締共聚物、聚乙酸乙締醋、聚異戊二締、聚乙締、乙酸乙締醋-月桂酸 乙締醋共聚物、娃酬、節(jié)路頓膠、糖膠樹膠、索馬膠和己拉塔樹膠或其組合。
[0023] 在另一種實(shí)施方式中，微生物粘附或俘獲在其中的可延展聚合物可W在牙科或牙 周組合物、器具或裝置內(nèi)。例如，可延展聚合物可W是包含在牙髓（牙科）或牙周器械或組 合物上或其內(nèi)的牙科樹脂或聚合物，例如在填料、義齒、牙橋、牙冠、根管、牙科內(nèi)嵌體、牙科 外嵌體和鑲蓋中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科裝置（例如支架或承載物）、頌 面器具例如聘裂板、上頌支架和正崎矯治器上或其中。運(yùn)些可延展聚合物是甲基丙締酸甲 醋、聚甲基丙締酸甲醋（PMMA)、聚甲基丙締酸乙醋（PEMA)、甲基丙締酸甘油醋（GMA)、二甲 基丙締酸S乙二醇醋（TEGDMA)、雙酪A-甲基丙締酸甘油醋度IS-GMA)、古塔波膠和聚下締， 包括a-下締、順下締、0-下締、反P-