專利名稱：核酸芯片、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶、微生物或者核酸分子的檢測領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及可用于細(xì)
胞遷移、細(xì)胞增值、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等功能基因篩選的核酸芯片、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interfering, RNAi)是由雙鏈RNA (double-stranded RNA， dsRNA) 誘發(fā)引起同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是生物界一種古老而且進化上高度保守的基 因表達(dá)調(diào)控機制。1998年研究者發(fā)現(xiàn)在C. elegans或果蠅中注入dsRNA可特異性抑制基因 表達(dá)，并將這種由dsRNA引發(fā)的抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象成為RNAi。隨后RNAi的基礎(chǔ)研究 和應(yīng)用迅速成為生命科學(xué)的熱點領(lǐng)域之一。RNAi研究取得了突破性進展，被《Science》雜 志評為2001年的十大科學(xué)進展之一，并名列2002年十大科學(xué)進展之首。兩位科學(xué)家也因 此獲得了 2006年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基 因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng) 域。 RNA干擾技術(shù)沉默基因具備簡單、高效、快速等特點。根據(jù)實驗的要求，實現(xiàn)特定 基因的沉默，可以使用化學(xué)合成的siRNA，也可以使用esiRNA，或者shRNA表達(dá)質(zhì)粒，或者表 達(dá)shRNA的病毒等不同形式核酸分子。因為絕大多數(shù)模式生物和人的全基因組序列完全已 知，所以針對每一條基因，都可以方便地合成幾條對應(yīng)的siRNA或構(gòu)建幾個對應(yīng)的shRNA質(zhì) 粒。近年來，有不同規(guī)模和形式的siRNA文庫已建立起來。Dharmacon， Ambion以及Sigma 等公司甚至提供人、小鼠等生物的全基因組siRNA文庫，這使得大規(guī)模使用RNA干擾技術(shù)成 為現(xiàn)實。近年來，利用siRNA文庫在全基因組篩選功能基因已經(jīng)取得一些令人矚目的結(jié)果。 但是，由于其昂貴的篩選成本和繁瑣的操作過程，大大限制了 RNA干擾技術(shù)的進一步推廣 和應(yīng)用。 在研究如何降低siRNA生產(chǎn)成本的同時，科學(xué)家和企業(yè)家也致力于開發(fā)新的方 法來降低siRNA文庫的使用成本。例如，幾個課題組最近開發(fā)一種所謂的反向轉(zhuǎn)染技 術(shù) (Wheeler， D. et al.Nature Genetics Supplement,2005 ;Bailey， S. et al. Nature Methods, 2006 ;Erfle，H.et al. Nature Protocols, 2007)。簡單i井，這種方f去就是^H七學(xué)合 成的siRNA，或者將shRNA質(zhì)粒，或者將表達(dá)shRNA的病毒通過點樣的方式固定在玻片表面， 形成一個點陣列，然后直接在玻片表面上鋪長細(xì)胞。由于陣列中每個siRNA或者shRNA只能 特異地轉(zhuǎn)染到一定區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)，不會形成相互污染。這樣使得在一個io厘米見方的玻璃 片上制備出上千個siRNA點陣，能同時進行研究，因此大大降低地研究成本。這些方法同樣 具有很多缺點。比如，細(xì)胞在玻片或硅片上長成一片，很難區(qū)分或辨別siRNA的點陣位置， 對后期采集分析信號造成極大的困難；siRNA點陣之間的細(xì)胞也會對相鄰點陣中的細(xì)胞造 成一定影響；而且，對一些細(xì)胞現(xiàn)象如遷移不適用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種新型的核酸芯片及其制備方 法以及用途。 通過采用表面修飾手段和微納米技術(shù)，本發(fā)明不僅很好解決傳統(tǒng)反向轉(zhuǎn)染芯片的 問題，還大大拓展它們的應(yīng)用范圍，比如對細(xì)胞遷移等功能基因的篩選。 本發(fā)明所稱的"非生物相容性材料"是指細(xì)胞不能在該材料表面進行正常生長、增 殖等活動的材料，若將細(xì)胞置于該材料表面培養(yǎng)，則細(xì)胞會產(chǎn)生明顯的凋亡或死亡。
"智會g材料(intelligent materials or smart materials)，，是指在^i度、pH 值、化學(xué)、壓力、電荷、磁場等參數(shù)變化時，材料的物理或化學(xué)性會發(fā)生變化的所有材料，包 括但不限于聚-N-異丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己內(nèi)酰胺 (Poly (N-vinylc即rolact咖))、聚丙烯酸、聚丙烯月青、聚醚(Polyethylene-polypropylen eglycol，如BASF公司的Pluronic豕卜'-'S7、 Pluronic*卜'-'S'S、 Pluronic F-108或Piuronic您 F127)、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(Polyoxypropylene-polyoxyethylene Block Copolymer)、聚乙二酉享_聚丙二酉享共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、殼聚糖、海藻酸鈉，以及它們的衍生物或混合物。"光刻膠材料(photoresist)"又稱光致抗蝕劑，由感光樹脂、增感劑和溶劑三種主 要成分組成的對光敏感的混合液體。感光樹脂經(jīng)光照后，在曝光區(qū)能很快地發(fā)生光固化反 應(yīng)，使得這種材料的物理性能，特別是溶解性、親合性等發(fā)生明顯變化。經(jīng)適當(dāng)?shù)娜軇┨幚恚?溶去可溶性部分，得到所需圖像。根據(jù)其化學(xué)反應(yīng)機理和顯影原理，可分負(fù)性膠和正性膠兩 類。包括但不限于AZ^光刻膠系歹lJ (Microchemicals) ，TI 35E光刻膠(Microchemicals) ， TI 35ES光刻膠(Microchemicals) ， PMGI光刻膠(MicroChem Corp.) ， LOR光刻膠(MicroChem Corp.) ， SU-8光刻膠(MicroChem Corp. ) ， KMPR* 1000光刻膠(MicroChem Corp.) ， PMMA光 刻膠(MicroChem Corp.)等。"核酸"是指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其衍生物組成的材料。包 括但不限于DNA、 siRNA、 esiRNA、 shRNA載體、質(zhì)粒載體、或以病毒形式存在的載體等。
"核酸-轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體"是指當(dāng)兩性分子如磷脂、鞘脂、聚合物等分散于水相時，
分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有單層或雙 分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，核酸分子可以包封在這些囊泡內(nèi)或吸附在這些囊泡表面。由于這 種囊泡膜層具有生物膜特征，可與細(xì)胞融合，能將脂質(zhì)體囊泡中的核酸或其他成份導(dǎo)入細(xì) 胞中。脂質(zhì)體大小直徑0. 02毫米 5毫米之間。常用轉(zhuǎn)染試劑包括但不限于Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 、 DharmaconFECT轉(zhuǎn)染試劑等。 本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的。第一步，用去垢劑和超純水清洗芯片。該 芯片可以是任何形狀的固態(tài)物質(zhì)，例如玻片、硅片、塑料片、甚至紙片等。第二步，制備覆 蓋層材料溶液。該覆蓋層材料可以為任何非生物相容性材料。優(yōu)選地，覆蓋材料為智能 材料、光刻膠材料、pH敏感材料或溫度敏感材料。更為優(yōu)選地，覆蓋材料為聚-N-異丙基 丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))或其衍生物或混合物。比如，制備成6% (w/ v)的Poly(N-isopropylacrylamide) (Sigma)乙醇溶液。第三步，在芯片表面鋪覆一層 覆蓋材料，并制備出不同大小或形狀的微結(jié)構(gòu)圖案。根據(jù)覆蓋材料的性能，可使用等離 子刻蝕技術(shù)、光刻法、壓印技術(shù)等制備圖案。例如，使用光敏材料時，可利用光刻法工藝(photolithography)制備不同形狀的微孔。優(yōu)選地，利用氧氣刻蝕機和掩膜保護，刻蝕 Poly(N-isopropylacrylamide)的圖案。例如，刻蝕條件為50pa氧壓，200W功率，刻蝕時間 約3-5分鐘。刻蝕完畢，將芯片放入超凈臺中紫外照射消毒。 下一步是在有圖案的芯片上點制核酸陣列。核酸包括但不限于DNA、 siRNA、 esiRNA、 shRNA載體、質(zhì)粒載體、或以病毒形式存在的載體等。優(yōu)選地，核酸為siRNA分子。 將核酸_轉(zhuǎn)染試劑混合制備成脂質(zhì)體，然后將脂質(zhì)體混合包裹在轉(zhuǎn)染載體溶液中。該轉(zhuǎn)染 載體溶液包含但不限于明膠(gelatin)。轉(zhuǎn)染載體的作用是在干燥條件下或培養(yǎng)液中能 穩(wěn)定核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，而且在培養(yǎng)液中可以緩釋核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體，進入 細(xì)胞中。優(yōu)選地，制備核酸-轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體，并包裹在核酸轉(zhuǎn)染載體溶液的方法如下1) 制備核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體將0. 1M蔗糖的3微升OptiMEM(Invitrogen)以及2. 5微升 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)加入200微升實驗管中并且充分混勻；然后加入1微升 100iiM的siRNA，混勻后室溫孵育20分鐘；2)制備轉(zhuǎn)染載體溶液配制O. 1% (w/v)的明膠 (gelatin, Sigma， Type B)水溶液，其中包含有0. 01 % (w/v) fib皿ectin (Invitrogen) ;3) 將脂質(zhì)體混合包裹在轉(zhuǎn)染載體溶液中在孵育20分鐘后的核酸-轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體的試管 中，加入7.5微升轉(zhuǎn)染載體溶液并充分混勻。然后，將包裹核酸的轉(zhuǎn)染載體溶液點加在不同 的圖案位置。例如，利用針式或噴墨式點樣儀，同時將包含不同核酸分子的上千種轉(zhuǎn)染載體 溶液點加在芯片對應(yīng)的圖案位置上。又例如，也可使用液體分裝儀器(Wang， J.et al. Lap Chip, 2009)來完成點陣制備。 最后，將核酸芯片固定在3. 5cm的培養(yǎng)皿中室溫干燥保存以備使用。使用時將培 養(yǎng)皿置于37t:控溫臺上，加入2-3ml包含lX 105至5X 106個細(xì)胞的37"培養(yǎng)基。細(xì)胞培 養(yǎng)完成后(約48小時)，將培養(yǎng)皿室溫放置5分鐘使得聚合物完全溶解，再加入PBS清洗三 次，隨時進行相應(yīng)的實驗，并通過顯微鏡從事觀察或記錄。 與現(xiàn)有基于孔板(如96孔板或384孔板或1536孔板等)篩選技術(shù)相比，本發(fā)明 提供的核酸芯片具有成本低、便于使用等優(yōu)點。 與現(xiàn)有技術(shù)中已有的核酸芯片相比，本發(fā)明提供的核酸芯片在至少以下三個方面 具有特別優(yōu)異的效果。傳統(tǒng)的核酸芯片僅簡單地將核酸分子附著于基底表面的特定部位 ( 一般這些特定部位排列成點陣)，在進行細(xì)胞培養(yǎng)的時候，細(xì)胞會無任何區(qū)別地在基底的 全部表面生長，這樣會帶來兩個問題一是基底全部表面都被細(xì)胞覆蓋，使得對核酸分子位 置的確定變得困難，不利于信號采集與分析；二是核酸分子點陣中的細(xì)胞會受到點陣之間 的細(xì)胞的干擾，從而影響到觀測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。但是，使用本發(fā)明提供的核酸芯片 進行細(xì)胞功能基因篩選研究的時候就不會遇到以上的問題。由于點陣之間的基底表面被非 生物相容性材料覆蓋，細(xì)胞只會在核酸分子點陣區(qū)域內(nèi)生長，，不會形成相互干擾。因而，通 過觀察細(xì)胞生長的部位便能容易地確定核酸分子點陣的分布區(qū)域。最后，當(dāng)上述非生物相 容性材料去除，細(xì)胞能從點陣內(nèi)向外的擴散便不會再受到其他細(xì)胞的干擾，因此本發(fā)明提 供的芯片，可以用于準(zhǔn)確、可靠地研究細(xì)胞遷移的相關(guān)試驗。
本發(fā)明技術(shù)方案總結(jié)如下 1. —種核酸芯片，包括基底，該基底的一部分表面附著有核酸分子，其特征在于所
述基底上未附著核酸分子的區(qū)域被可抑制細(xì)胞生長的材料覆蓋。 2.根據(jù)第1項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為非生物相容性材料。
3.根據(jù)第1或2項所述的核酸芯片，其特征在于該材料容易制備成微結(jié)構(gòu)圖案。
4.根據(jù)1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為智能材料。
5.根據(jù)1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為光刻膠、溫度敏感 材料或pH敏感材料。 6.根據(jù)1-5的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為聚-N-異丙基丙烯 酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己內(nèi)酰胺(Poly (N_vinylcaprolactam))、 聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氨酯、聚醚(Polyethylene-polypropylene glycol)、聚氧丙烯_聚 氧乙條共聚物(Polyoxypropylene-polyoxyethylene block copolymer)、聚乙二酉享_聚丙 二酉享共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、殼聚糖、海 藻酸鈉，以及它們的衍生物或混合物。 7.根據(jù)1-6的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料層的厚度為1-500微 米。 8.根據(jù)1-7的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子分布在基底表 面多個彼此分立的區(qū)域內(nèi)。 9.根據(jù)第8項所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區(qū)域排列成規(guī)則 的點陣。 10.根據(jù)第8或9項所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區(qū)域為圓 形，其直徑在50微米-1毫米之間，彼此間距在50微米-10毫米之間。 11.根據(jù)1-10的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子被包裹在轉(zhuǎn) 染載體中，通過轉(zhuǎn)染載體附著在基底表面。 12.根據(jù)1-11的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子與轉(zhuǎn)染試劑
形成核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體被包裹在轉(zhuǎn)染載體中，通過轉(zhuǎn)染載體附著在基底表面。 13.根據(jù)第11或12項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉(zhuǎn)染載體為在干燥條件下
或培養(yǎng)液中能保護核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)不被破壞的材料或混合物。 14.根據(jù)11-13的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉(zhuǎn)染載體為能在培
養(yǎng)液中使得核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體緩釋進入細(xì)胞的材料或混合物。 15.根據(jù)11-14的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉(zhuǎn)染載體為明膠
(gelatin)、纖粘連蛋白(fibronectin)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)、透明質(zhì)
酸(Hyaluronicacid, HA)、瓊脂糖、水凝膠(hydrogel)、聚乳酸(polylactide， PLA)、聚
乙二醇(Polyglycolide)、聚乳酸-羥基乙酸(Polylactide-glycolide， PLGA)、聚烯烴
(polyolefins)、聚酉旨(polyesters)、聚酉先月安(polyamides)、聚石發(fā)酸酉旨(polycarbonates)或
聚砜樹脂(polysulfones)，或它們的衍生物或混合物。 16.根據(jù)第15項所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠的溶液濃度范圍為質(zhì)量百 分比0. 05%到1%。 17.根據(jù)第16項所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠中含有蔗糖或纖粘連蛋白 (fibronectin)，其中蔗糖的摩爾濃度范圍為O. 05M到1M，纖粘連蛋白的濃度范圍為質(zhì)量百 分比0. 005 %到0. 05%。 18.根據(jù)1-17的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子為DNA、 siRNA、 esiRNA、質(zhì)?；蛞圆《拘问酱嬖诘妮d體。
19.根據(jù)1-18的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述基底的材料為玻璃、 聚苯乙烯、聚乙烯、塑料、硅片、陶瓷或紙張。 20. —種制備根據(jù)1-19的任意一項所述的核酸芯片的方法，其特征在于其包括如 下步驟 1)將基底清洗干凈，干燥后在其表面制備可抑制細(xì)胞生長材料的圖案；
2)將核酸分子或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體包裹在轉(zhuǎn)染載體中； 3)將包裹核酸分子或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染載體固定到基底上未被可抑 制細(xì)胞生長的材料覆蓋的區(qū)域中。 21.根據(jù)第20項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈晾干后，將可抑制細(xì)胞生長的材料溶于水、乙醇或其它溶劑中形成溶液，將 所述溶液均勻覆蓋基底表面并干燥，然后將預(yù)先準(zhǔn)備好的掩模覆蓋在所述可抑制細(xì)胞生長 的材料上，將未被掩模遮蓋的部分刻蝕除去，露出基底。 22.根據(jù)第21項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于所述刻蝕為氧氣等離子 體刻蝕。 23.根據(jù)第20項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，將可抑制細(xì)胞生長的材料溶于乙醇或水中形成溶液，利用壓印技 術(shù)(stampfabrication)直接在基底表面印出所需圖案。 24.根據(jù)第20項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，利用光刻膠在表面制備出相反的圖案，然后在基底涂鍍或共價鍵 連接一種可抑制細(xì)胞生長的材料，最后去除光刻膠，保留可抑制細(xì)胞生長材料的圖案。
25. —種使用根據(jù)1-19的任意一項所述的核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選的方 法，其特征在于包括如下步驟 1)將細(xì)胞與核酸芯片上的轉(zhuǎn)染載體接觸，使核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體緩釋進 入細(xì)胞； 2)觀測核酸分子對細(xì)胞功能的影響。 26.根據(jù)第25項所述的使用核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選的方法，其特征在于 步驟1所述核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體緩釋進入細(xì)胞的過程為在芯片上加入細(xì)胞和培 養(yǎng)液后開始的2小時，核酸或核酸-轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體釋放量少于10%，而在隨后的12至24 小時內(nèi)，逐漸釋放至少40 % 。 27.根據(jù)第25或26項所述的使用核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選的方法，其特征 在于步驟2中所述的細(xì)胞功能為細(xì)胞增值、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移或細(xì)胞自噬。
28.根據(jù)第27項所述的使用核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選的方法，其特征在于 所述細(xì)胞遷移可通過單位時間內(nèi)細(xì)胞小島面積變化來評估。 圖1本發(fā)明的核酸芯片制備以及細(xì)胞小島陣列形成示意圖。在干凈的玻璃片表面 上鋪覆一層聚-N-異丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide)， PNIAAm， Sigma)。待 干燥后利用等離子刻蝕機，刻蝕出上百個500或800微米直徑的小孔。因為圖案的大小和 形狀完全由掩膜上圖案的大小和形狀決定，所以可以方便地設(shè)計、刻蝕出任何形狀或大小


的聚-N-異丙基丙烯酰胺材料圖案。然后，含不同核酸分子轉(zhuǎn)染載體溶液點加在對應(yīng)的圖 案位置，制成核酸芯片。加入細(xì)胞后培養(yǎng)兩到三天，將培養(yǎng)基溫度降低至室溫移去異-N-丙 基丙烯酰胺，細(xì)胞自組裝形成小島。每個小島對應(yīng)一個核酸點陣，點陣中的核酸將有效地轉(zhuǎn) 染到對應(yīng)的小島細(xì)胞中。觀察細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)目、特定蛋白(利用免疫熒光標(biāo)記等辦法)、細(xì) 胞核等參數(shù)，可以達(dá)到篩選或研究特定核酸功能的目的。 圖2相差顯微鏡照片顯示細(xì)胞小島形狀。左圖顯示四個小島，右圖顯示一個小島。 [OOM] 圖3利用熒光標(biāo)記的siRNA (如FAM-siRNA，上圖)和GFP質(zhì)粒(下圖)驗證小 島之間沒有明顯的交叉污染。左圖為相差顯微鏡照片，右圖為對應(yīng)的熒光顯微鏡照片。 FAM-siRNA或GFP質(zhì)粒只點在左上角和右下角。 圖4通過細(xì)胞小島面積隨時間的變化，來評估細(xì)胞的遷移速度。上圖為相差顯微 鏡照片顯示0小時，8小時，15小時三個時間點細(xì)胞小島面積變化。下圖為細(xì)胞小島面積隨 時間按的變化曲線。每小時測量一次細(xì)胞小島面積變化。 圖5三種不同細(xì)胞，Hela細(xì)胞，H印G2細(xì)胞，U2-0S細(xì)胞，遷移速度的比較。同一實 驗重復(fù)五次，求平均值。結(jié)果表明Hela細(xì)胞< H印G2細(xì)胞< U2-0S細(xì)胞。
圖6模擬傳統(tǒng)劃痕法(Wound healing assay)研究細(xì)胞遷移。從左到右不同分別 是0小時，6小時，10小時拍得照片。 圖7研究三條基因Pten， Rhog， Sgef分別抑制后對Hela細(xì)胞遷移的影響。左圖 為實時熒光定量PCR結(jié)果，表明合成的三條基因的siRNA能有效的抑制相應(yīng)的基因。抑制 Pten基因能提高Hela細(xì)胞的遷移速度，相反抑制Rhog或Sgef基因?qū)⒔档虷ela細(xì)胞的遷 移速度(右圖)。NC為不相關(guān)siRNA序列，為對照實驗使用。 圖8研究三條基因Pten， Rhog， Sgef分別抑制后對U2-0S細(xì)胞遷移的影響。左圖 為實時熒光定量PCR結(jié)果，表明合成的三條基因的siRNA能有效的抑制相應(yīng)的基因。抑制 Pten基因能提高U2-0S細(xì)胞的遷移速度，相反抑制Rhog或Sgef基因?qū)⒔档蚒2-0S細(xì)胞的 遷移速度(右圖)。NC為不相關(guān)siRNA序列，為對照實驗使用。
具體實施例方式
以下將通過具體的實施例說明本發(fā)明，但是這些具體的實施例不應(yīng)當(dāng)理解為對本
發(fā)明的限制，對某些細(xì)節(jié)進行修改將仍然落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。 實例1細(xì)胞培養(yǎng) 實驗中用到的細(xì)胞包括Hela， H印G2和U2-0S。細(xì)胞培養(yǎng)基是Dulbecco' s ModifiedEagle Medium(DMEM， Invitrogen)，其中包含10%胎牛血清和1 %雙抗。培養(yǎng)條 件濕度95%，溫度37"，5% C02。細(xì)胞傳代時，先用PBS清洗一遍，再加入包含5mM EDTA 的0. 25%胰酶，觀察細(xì)胞邊緣浮起外觀變圓時加入血清終止消化。使用移液器將貼壁細(xì)胞 吹下來，離心除去上清液，獲得沉積的細(xì)胞。加入適量的培養(yǎng)基稀釋后使用細(xì)胞計數(shù)板計 數(shù)，然后培養(yǎng)。 實例2利用分配器制備核酸點陣 使用基于微流體技術(shù)的分配器(Wang， et al. L即Chip， 2009)進行核酸點陣制備。 根據(jù)不同的實驗要求，也可以使用其它點樣儀。分配器設(shè)計成帶有六個獨立的管道，因此可 以同時分配六個不同的樣品。壓縮空氣產(chǎn)生的氣壓脈沖(0.04兆帕，15毫秒)可以驅(qū)動大約iio納升液體試劑填充在沒有聚合物覆蓋的一個孔表面。點樣時芯片放置在37t:控溫臺
上以免液體試劑溶解聚合物。點樣結(jié)束，用超純水清洗分配器管道并且用壓縮空氣吹干以 便下次使用。 實例3細(xì)胞自組裝小島 用去垢劑和超純水清洗實驗室常用的玻片(25毫米X 25毫米)表面。干燥后在其 表面滴一層聚合物薄膜，使用65微升6% (w/v)的Poly(N-isopropylacrylamide) (Sigma 或PolySciences)乙醇溶液，干燥后，在室溫中保存12小時。根據(jù)實驗要求制備硅片掩模， 利用微加工技術(shù)可在其上刻出不同大小或形狀微孔。具體講，將硅片掩模蓋在薄膜干燥后 的玻片上，放入氧氣等離子刻蝕機中刻蝕?？涛g條件為50pa氧壓，200W功率，刻蝕時間約 3.5分鐘?？涛g完畢，將玻片放入超凈臺中紫外照射消毒，然后使用分配器在其上加工出 siRNA微陣列。玻片可以用蠟固定在3.5cm的培養(yǎng)皿中室溫干燥保存以備使用。使用時將 培養(yǎng)皿置于37t:控溫臺上，加入3ml包含IX 106個細(xì)胞的37t:培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)完成后 (約48小時)，將培養(yǎng)皿室溫放置5分鐘使得聚合物完全溶解，再加入PBS清洗三次，隨時 進行相關(guān)實驗(圖2)。 實例4核酸點陣間的交叉污染研究 我們利用熒光標(biāo)記的siRNA和GFP質(zhì)粒來研究核酸陣列是否會形成交叉污染。例 如，在兩個對角(如左上角和右下角)點制FAM-siRNA陣列，另外兩個對角(如左下角和右 上角)點制兩個沒有標(biāo)記siRNA陣列，點陣直徑大小為0. 8毫米，點之間相隔距離為2毫 米。加入細(xì)胞培養(yǎng)兩天后，在FAM-siRNA點的細(xì)胞中可檢測到熒光信號；相反，在沒有標(biāo)記 siRNA的細(xì)胞中，沒有檢測任何熒光信號(圖3)。同樣，我們利用GFP質(zhì)粒和普通質(zhì)粒重復(fù) 上述實驗，只在GFP質(zhì)粒陣列點中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有熒光信號。這些結(jié)果說明，核酸點陣沒有形成 交叉污染。 實例5細(xì)胞遷移 細(xì)胞遷移在生理學(xué)和病理學(xué)過程中扮演著非常重要的角色，包括胚胎發(fā)育，傷口 愈合，炎癥反應(yīng)，癌癥細(xì)胞侵染和轉(zhuǎn)移等過程。在過去的這幾年當(dāng)中，細(xì)胞遷移領(lǐng)域取得了 極大的研究進展。細(xì)胞遷移是一個多步驟的循環(huán)過程，以細(xì)胞極化為開端，前端向外突出延 展并且緊密貼壁，后端貼壁松脫并且向前端收縮。然而，這些步驟的分子機理還不是很清 楚，這使得治療癌癥，尤其是當(dāng)癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時，仍然是一項棘手的任務(wù)。系統(tǒng)性地鑒別 調(diào)控細(xì)胞遷移的新型分子，可以幫助我們更好地了解細(xì)胞遷移相關(guān)的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)。以此 項技術(shù)為基礎(chǔ)，就可以找到一些可行的靶點用于治療和診斷。 傳統(tǒng)的大規(guī)模RNA干擾篩選主要是在96或384孔板中完成的，并不適合細(xì)胞遷移 的結(jié)果分析。傳統(tǒng)檢測細(xì)胞遷移的技術(shù)，包括體外劃線實驗、Boyden小室實驗，都需要額外 的熟練的操作或者特殊的器具，這就導(dǎo)致大規(guī)模篩選時不夠精確和低效率。利用本發(fā)明制 備的siRNA細(xì)胞微陣列芯片，可以用于高通量的篩選調(diào)控細(xì)胞遷移的功能基因。由于使用 了一種熱敏感的聚合物——聚N-異丙基丙烯酰胺，我們可以輕易的制作出大小和形狀標(biāo)準(zhǔn) 化的圖形。這些填充了小RNA的圖形被細(xì)胞所覆蓋。添加細(xì)胞培養(yǎng)2到3天后，在室溫下 去除聚N-異丙基丙烯酰胺，組成細(xì)胞小島陣列(圖3)。不同時間測量細(xì)胞小島面積的變 化，可以計算面積的變化，除以時間間隔來衡量細(xì)胞的遷移速度(圖4)。很明顯，在一定的 時間段內(nèi)(如不超過16小時)，細(xì)胞的速度為線性。我們比較發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞的遷移速度小于H印G2細(xì)胞，而H印G2細(xì)胞遷移速度小于U2-0S細(xì)胞(圖5)。 實例6模擬劃痕法(wound healing assay)研究細(xì)胞的遷移 如果掩膜上的圖案是長方型，本發(fā)明可以制備長方型細(xì)胞小島(圖6)。當(dāng)去除聚
N-異丙基丙烯酰胺，細(xì)胞開始向周邊移動，最終在中間會合。這些實驗?zāi)苣M傳統(tǒng)的劃痕法
(woundhealing assay)，用于細(xì)胞遷移的石開究。 實例7 為了考察siRNA芯片研究細(xì)胞遷移的可能性，我們合成三條基因Pten，Rhog，Sgef 的siRNA。序列如下
PTEN siRNA sense : 5' -pGUUAGCAGAAACAAAAGGAGdTdT
antisense 5'-pCUCCUUUUGUUUCUGCUAACdTdT
RhoG siRNA sense : 5' -pGCAACAGGAUGGUGUCAAGdTdT
antisense，5， -pUCGUCCAAGAUCGACAUCCdTdT
sGEF siRNA sense 5' -pCAAAUGGCCUUGCCGCUAAdTdTantisense 5' -pUUAGCGGCAAGGCCAUUUGdTdT 我們選取兩種細(xì)胞Hela和U2_0S細(xì)胞進行研究。首先，檢測三條基因siRNA的抑 制效果。利用實時熒光定量PCR方法，定量檢測了分別轉(zhuǎn)染三條基因siRNA后48小時，各 自基因mRNA表達(dá)水平的變化。圖7表明合成的三條基因的siRNA能有效的抑制相應(yīng)的基 因(左圖)。其次，考察三條基因被抑制后細(xì)胞的遷移行為變化。結(jié)果表明抑制Pten后能 提高Hela細(xì)胞的遷移速度，相反抑制Rhog或Sgef將降低Hela細(xì)胞的遷移速度(右圖)。 利用U2-0S細(xì)胞，重復(fù)了上述實驗，發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律。這些結(jié)果與先前其他研究小組的 手艮道完全——致(Czauderna， F. et al. Nucleic Acids Research, 2003 ;Ellerbroek， S. et al. Molecular Biology ofthe Cell,2004 ;Katoh， H. et al. Journal of Cell Science, 2006)。因此，有力地證明本發(fā)明提供的siRNA芯片研究細(xì)胞遷移的有效性。
權(quán)利要求
一種核酸芯片，包括基底，該基底的一部分表面附著有核酸分子，其特征在于所述基底上未附著核酸分子的區(qū)域被可抑制細(xì)胞生長的材料覆蓋。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸芯片，其特征在于該材料為非生物相容性材料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸芯片，其特征在于該材料容易制備成微結(jié)構(gòu)圖案。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為智能材料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為光刻膠、溫度 敏感材料或pH敏感材料。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5的任意 一 項所述的核酸芯片，其特征在于該材料 為聚-N-異丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己 內(nèi)酰胺(Poly(N-vinylc即rolactam))、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氨酉旨、聚醚 (Polyethylene-polypropylene glycol)、聚氧丙烯_聚氧乙烯共聚物(Polyoxypropylene -polyoxyethylene block copolymer)、聚乙二酉享-聚丙二酉享共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、殼聚糖、海藻酸鈉，以及它們的衍生物或混合 物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l-6的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料層的厚度為 1-500微米。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子分布在基 底表面多個彼此分立的區(qū)域內(nèi)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區(qū)域排列成規(guī)則 的點陣。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區(qū)域為圓 形，其直徑在50微米-1毫米之間，彼此間距在50微米-10毫米之間。
11. 根據(jù)權(quán)利要求i-io的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子被包裹 在轉(zhuǎn)染載體中，通過轉(zhuǎn)染載體附著在基底表面。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子與轉(zhuǎn)染 試劑形成核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體被包裹在轉(zhuǎn)染載體中，通過轉(zhuǎn)染載體附著在基底表面。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的核酸芯片，其特征在于所述轉(zhuǎn)染載體為在干燥條件下 或培養(yǎng)液中能保護核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)不被破壞的材料或混合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11-13的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉(zhuǎn)染載體為能 在培養(yǎng)液中使得核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體緩釋進入細(xì)胞的材料或混合物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11-14的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉(zhuǎn)染載體為明 膠(gelatin)、纖粘連蛋白(fibronectin)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)、透明 質(zhì)酸(Hyaluronic acid， HA)、瓊脂糖、水凝膠(hydrogel)、聚乳酸(polylactide， PLA)、 聚乙二醇(Polyglycolide)、聚乳酸-羥基乙酸(Polylactide-glycolide， PLGA)、聚烯烴 (polyolefins)、聚酉旨(polyesters)、聚酉先月安(polyamides)、聚石發(fā)酸酉旨(polycarbonates)或 聚砜樹脂(polysulfones)，或它們的衍生物或混合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠的溶液濃度范圍為質(zhì)量百 分比0. 05%到1%。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠中含有蔗糖或纖粘連蛋白(fibronectin)，其中蔗糖的摩爾濃度范圍為O. 05M到1M，纖粘連蛋白的濃度范圍為質(zhì)量百 分比0. 005 %到0. 05%。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子為DNA、 siRNA、 esiRNA、質(zhì)粒或以病毒形式存在的載體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述基底的材料為玻 璃、聚苯乙烯、聚乙烯、塑料、硅片、陶瓷或紙張。
20. —種制備根據(jù)權(quán)利要求1-19的任意一項所述的核酸芯片的方法，其特征在于其包 括如下步驟1) 將基底清洗干凈，干燥后在其表面制備可抑制細(xì)胞生長材料的圖案；2) 將核酸分子或核酸-轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體包裹在轉(zhuǎn)染載體中；3) 將包裹核酸分子或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染載體固定到基底上未被可抑制細(xì) 胞生長的材料覆蓋的區(qū)域中。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈晾干后，將可抑制細(xì)胞生長的材料溶于水、乙醇或其它溶劑中形成溶液，將 所述溶液均勻覆蓋基底表面并干燥，然后將預(yù)先準(zhǔn)備好的掩模覆蓋在所述可抑制細(xì)胞生長 的材料上，將未被掩模遮蓋的部分刻蝕除去，露出基底。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于所述刻蝕為氧氣等離子 體刻蝕。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，將可抑制細(xì)胞生長的材料溶于乙醇或水中形成溶液，利用壓印技 術(shù)(stamp fabrication)直接在基底表面印出所需圖案。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，利用光刻膠在表面制備出相反的圖案，然后在基底涂鍍或共價鍵 連接一種可抑制細(xì)胞生長的材料，最后去除光刻膠，保留可抑制細(xì)胞生長材料的圖案。
25. —種使用根據(jù)權(quán)利要求1-19的任意一項所述的核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選 的方法，其特征在于包括如下步驟1) 將細(xì)胞與核酸芯片上的轉(zhuǎn)染載體接觸，使核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體緩釋進入細(xì)胞；2) 觀測核酸分子對細(xì)胞功能的影響。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的使用核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選的方法，其特征在于 步驟1所述核酸或核酸_轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體緩釋進入細(xì)胞的過程為在芯片上加入細(xì)胞和培 養(yǎng)液后開始的2小時，核酸或核酸-轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體釋放量少于10%，而在隨后的12至24 小時內(nèi)，逐漸釋放至少40 % 。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的使用核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選的方法，其特征 在于步驟2中所述的細(xì)胞功能為細(xì)胞增值、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移或細(xì)胞自噬。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的使用核酸芯片進行細(xì)胞功能基因篩選的方法，其特征在于 所述細(xì)胞遷移可通過單位時間內(nèi)細(xì)胞小島面積變化來評估。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸芯片、其制備方法及用途，屬于酶、微生物或者核酸分子的檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的核酸芯片包括基底，該基底的一部分表面附著有核酸分子，基底上未附著核酸分子的區(qū)域被可抑制細(xì)胞生長的材料覆蓋，該材料可以是非生物相容性材料，例如可以是聚-N-異丙基丙烯酰胺、聚乙烯基己內(nèi)酰胺、聚丙烯酸、殼聚糖、海藻酸鈉等，核酸分子可以是DNA、siRNA、esiRNA、質(zhì)粒等。本發(fā)明的核酸芯片特別適于進行細(xì)胞增值、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移等功能基因篩選方面的研究。
文檔編號C12Q1/68GK101696449SQ20091021056
公開日2010年4月21日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者席建忠, 黃巖誼 申請人:北京大學(xué);