專利名稱：一種核酸檢測(cè)微流芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的檢測(cè)方法，具體地涉及對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法。本發(fā)明還涉及核酸檢測(cè)試劑盒，具體地涉及檢測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及用于PCR疾病診斷的檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)發(fā)展，大量基因信息需要進(jìn)行分析，因此生物芯片概念、技術(shù)和產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。
所謂生物芯片，是借用了計(jì)算機(jī)芯片尋址概念，將生命科學(xué)研究中所涉及的不連續(xù)的分析過(guò)程(如樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè))，利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之高通量、微型化、集成化。生物芯片技術(shù)將為表達(dá)譜分析、藥物研發(fā)、HLA分型、突變分析、疾病診斷等領(lǐng)域研究提供更多的方便。高通量、微型化、集成化是生物芯片的特征。
目前的生物芯片包括微點(diǎn)陣或微陣列(Microarray)和微型實(shí)驗(yàn)室(Lab on chip)兩方面技術(shù)。
微點(diǎn)陣平臺(tái)是最普遍采用的技術(shù)，它是按照經(jīng)典的印跡原理在特定的載體基片上進(jìn)行分析檢測(cè)。
根據(jù)識(shí)別分子種類不同，微點(diǎn)陣分為DNA芯片(DNA Chip)和蛋白芯片兩種。DNA芯片是根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針識(shí)別特定基因。它將探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷希纬蒁NA分子微陣列，然后與標(biāo)記的樣品(DNA、核酸擴(kuò)增產(chǎn)物、RNA等)進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析，比較成熟的產(chǎn)品有檢測(cè)基因突變的芯片(捕獲探針一般用寡核苷酸，也叫Oligo Chip)，檢測(cè)細(xì)胞基因表達(dá)水平的表達(dá)基因芯片(捕獲探針用EST或Unigene的PCR產(chǎn)物)。蛋白質(zhì)芯片，是利用抗體與抗原結(jié)合的特異性即免疫反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗體或抗原的芯片。簡(jiǎn)化模型為選擇一種固相載體能夠牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體)，這樣形成蛋白質(zhì)的微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。如果加入與之特異性反應(yīng)的帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子(抗體或抗原)，兩者結(jié)合后，通過(guò)對(duì)標(biāo)記物的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗原抗體的互檢，即蛋白質(zhì)或小分子非蛋白質(zhì)檢測(cè)。
但現(xiàn)有的微點(diǎn)陣平臺(tái)技術(shù)或者生產(chǎn)工藝復(fù)雜、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，或者需要專用的設(shè)備、操作煩瑣，使用成本居高不下，很難得到普及應(yīng)用，這些缺點(diǎn)已成為微點(diǎn)陣產(chǎn)業(yè)化的主要障礙。
目前微點(diǎn)陣平臺(tái)技術(shù)種類及優(yōu)缺點(diǎn)如下(1)以載玻片(+-NC膜)為基片，點(diǎn)樣，熒光掃描檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)技術(shù)成熟，制備簡(jiǎn)單缺點(diǎn)影響因素較多，雜交時(shí)間長(zhǎng)(2)原位合成，熒光掃描檢測(cè)(Affymetrix為代表)優(yōu)點(diǎn)制備自動(dòng)化缺點(diǎn)專用設(shè)備制造，成本高，影響因素較多，雜交時(shí)間長(zhǎng)。
(3)以常用的微孔板為基片，熒光或其信號(hào)掃描檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)能批處理樣本，雜交時(shí)間長(zhǎng)，成熟蛋白檢測(cè)技術(shù)缺點(diǎn)制備復(fù)雜，掃描儀專用，成本高。
(4)以光纖或多孔玻璃為基片，配合Beads標(biāo)記，在微孔板反應(yīng)，熒光掃描檢測(cè)(Illumila為代表，所謂Array of Array或三維芯片)優(yōu)點(diǎn)能批處理樣本，雜交時(shí)間短缺點(diǎn)制備復(fù)雜，專用掃描儀，成本高(5)電磁場(chǎng)雜交，能量傳導(dǎo)的熒光檢測(cè)(Nanogen為代表)優(yōu)點(diǎn)雜交時(shí)間極短，信號(hào)采集獨(dú)特缺點(diǎn)制備復(fù)雜，檢測(cè)工作站專用，成本高。
(6)膜或聚苯乙烯等材料，陣列(Array)或點(diǎn)(dot)，常規(guī)方法檢測(cè)(顯色，熒光)(以RANDOX為代表)優(yōu)點(diǎn)制備簡(jiǎn)單，成本底實(shí)用，市場(chǎng)易于接收缺點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)工作站專用。
微型實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-chip)技術(shù)是當(dāng)今國(guó)際上生物芯片技術(shù)發(fā)展的熱點(diǎn)，基本原理是以硅、玻璃等材料建立反應(yīng)通道和系統(tǒng)，完成反應(yīng)全過(guò)程，目前集中在以微反應(yīng)池為基礎(chǔ)的微閥系統(tǒng)的研究，如形成集樣品處理、核酸擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體的分析系統(tǒng)等；但這項(xiàng)技術(shù)尚處于研究的初期階段，要達(dá)到應(yīng)用還需要一段相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、和/或成本低廉的芯片技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、和/或成本低廉的芯片技術(shù)。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸檢測(cè)芯片，該檢測(cè)芯片包括檢測(cè)膜，所述檢測(cè)膜包括接觸區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)和吸水區(qū)，其中，所述檢測(cè)膜的平均孔徑0.5-10微米，且在點(diǎn)樣區(qū)固定有核酸探針點(diǎn)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150-1500微米，點(diǎn)密度為9-5000點(diǎn)/平方厘米。
較佳地，所述的檢測(cè)膜的平均孔徑為0.8-8微米，更佳地為1-5微米。
在本發(fā)明中，所述芯片上固定的探針選自下組的核酸分子DNA、RNA、肽核酸、通過(guò)擴(kuò)增方法產(chǎn)生的核酸、人工合成的寡核苷酸及這些核酸的修飾物。
在本發(fā)明中，點(diǎn)密度通常為9-5000點(diǎn)/平方厘米，較佳地為15-2500點(diǎn)/平方厘米，更佳地為25-1000點(diǎn)/平方厘米。點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150-1500微米，較佳地為150-500微米。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種核酸檢測(cè)方法，它包括步驟(1)提供一核酸檢測(cè)芯片，該檢測(cè)芯片包括檢測(cè)膜，所述檢測(cè)膜包括接觸區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)和吸水區(qū)，其中，所述檢測(cè)膜的平均孔徑0.5-10微米，且在點(diǎn)樣區(qū)固定有核酸探針點(diǎn)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150-1500微米，點(diǎn)密度為9-5000點(diǎn)/平方厘米；(2)將所述的接觸區(qū)與含待檢核酸的液體接觸，液體通過(guò)微流作用被吸引通過(guò)點(diǎn)樣區(qū)，從而使點(diǎn)樣區(qū)的核酸探針與待檢核酸雜交；(3)根據(jù)點(diǎn)樣區(qū)中點(diǎn)樣點(diǎn)是否產(chǎn)生的信號(hào)，以及信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)判斷結(jié)果。
在本發(fā)明中，所述待檢核酸包括DNA、RNA、通過(guò)擴(kuò)增方法產(chǎn)生的核酸、核酸衍生物和核酸標(biāo)記物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸檢測(cè)試劑盒，它具有一種核酸檢測(cè)芯片，該檢測(cè)芯片包括檢測(cè)膜，所述檢測(cè)膜包括接觸區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)和吸水區(qū)，其中，所述檢測(cè)膜的平均孔徑0.5-10微米，且在點(diǎn)樣區(qū)固定有核酸探針點(diǎn)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150-1500微米，點(diǎn)密度為15-5000點(diǎn)/平方厘米。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的一種或多種試劑(1)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用試劑；(2)進(jìn)行RNA化學(xué)修飾所用試劑；(3)進(jìn)行DNA化學(xué)修飾所用試劑；(4)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)所用試劑。
在本發(fā)明的第四方面，提供了上述的核酸檢測(cè)芯片的用途，它被用于下列檢測(cè)分析(1)基因突變檢測(cè)分析；(2)耐藥基因突變檢測(cè)分析；(3)HLA分型檢測(cè)分析；(4)SNP分型檢測(cè)分析；(5)微生物分型檢測(cè)；(6)表達(dá)譜檢測(cè)分析；(7)藥物研發(fā)中的檢測(cè)分析。


圖1為本發(fā)明核酸檢測(cè)微流芯片的操作示意圖。
圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，芯片點(diǎn)樣中各探針位置示意圖。
圖3是野生型(H37rv)結(jié)核桿菌耐藥基因rpoB的部分序列及熱點(diǎn)突變區(qū)域。
圖4注明熱點(diǎn)突變區(qū)域中各突變位點(diǎn)的名稱。
圖5顯示了對(duì)野生株H37rv檢測(cè)結(jié)果左側(cè)針對(duì)野生型探針，均顯示非常強(qiáng)的雜交信號(hào)，而針對(duì)突變型探針，信號(hào)非常弱，右上角為控制點(diǎn)。
圖6顯示了對(duì)質(zhì)控品(R1克隆)的檢測(cè)結(jié)果。
圖7顯示了對(duì)耐藥結(jié)核桿菌rpoB基因雜交檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改進(jìn)傳統(tǒng)核酸雜交-檢測(cè)法中的點(diǎn)樣技術(shù)，可以大大提高核酸-雜交檢測(cè)法的效率，并使操作大為簡(jiǎn)化。
在本發(fā)明中，“檢測(cè)膜”指用于檢測(cè)核酸分子的固相載體，它通常為膜狀或片狀，有時(shí)也被稱為“載體膜”。其結(jié)構(gòu)一般由背襯材料和涂在背襯材料上的膜涂層所組成。膜涂層一般為聚合物材料。
在本發(fā)明中，檢測(cè)核酸分子時(shí)采用層析的形式，在固相載體上直接進(jìn)行雜交反應(yīng)。為了進(jìn)行這樣的雜交反應(yīng)，載體必須滿足三個(gè)方面的要求，即(1)具有良好的親水性；(2)易于包被核酸探針和(3)對(duì)核酸、酶及其它物質(zhì)的非特異吸附作用較小。
對(duì)于后兩方面的要求，可選擇在一定條件下能有效結(jié)合核酸探針，而在一般雜交條件下對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、酶、酶底物和其它有機(jī)分子較少發(fā)生非特異性吸附的高分子聚合膜材料，比如醋酸基、硝酸基或硫酸基的多聚物，如纖維素膜或者尼龍膜等。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣，在聚合過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)聚合原料的濃度、配比、聚合速度、溫度、添加劑、催化劑種類等條件，可以方便地控制聚合物的孔徑、硬度、親水性等各種理化指標(biāo)。
本領(lǐng)域中用于核酸分子雜交的常規(guī)膜，其孔徑很小，一般平均孔徑為0.5微米左右或甚至以下。但是用這種膜進(jìn)行層析雜交時(shí)，有很多缺點(diǎn)如速度極其緩慢等，因此不適合用于本發(fā)明的檢測(cè)方法。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)膜涂層的聚合物的平均孔徑在1-10微米時(shí)，不僅可以大大改善層析雜交的速度指標(biāo)，從而使雜交過(guò)程在較短的時(shí)間內(nèi)完成，而且還能使雜交效率保持在很高水平，并提高檢測(cè)的靈敏度。較佳地，該檢測(cè)膜的平均孔徑為0.8-8微米；更佳地，平均孔徑為1-6微米。
本發(fā)明的檢測(cè)膜，其形狀沒(méi)有限制。較佳地為長(zhǎng)方形。由于吸水材料的存在，液體會(huì)從檢測(cè)膜的浸沒(méi)端向吸水端移動(dòng)，從而將液體中的核酸分子夾帶至探針包被點(diǎn)處，以發(fā)生雜交反應(yīng)。
本發(fā)明的檢測(cè)膜可以在一端含有吸水材料，從而制成一體化的檢測(cè)膜(固相膜+吸水材料)。
在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，需要將特異性的核酸探針固定在固相載體(即檢測(cè)膜)上。在這一固定過(guò)程中，為了牢固地固定核酸探針并形成不擴(kuò)散的探針點(diǎn)，需要使用包被液。在本發(fā)明中，可以使用基因芯片領(lǐng)域常用的包被液。一種理想的包被液是氯化鈉溶液。
在將特異性的核酸探針用本發(fā)明的包被液固定在檢測(cè)膜上之后，可將其一端浸在含有待檢測(cè)的核酸分子的液體(如PCR擴(kuò)增后的反應(yīng)液體)中，檢測(cè)膜的一端與吸水性材料相接觸，以便吸引含有待檢測(cè)核酸分子的液體(見(jiàn)圖1)。待檢測(cè)的核酸分子便會(huì)到達(dá)探針的包被點(diǎn)樣點(diǎn)，如果該核酸分子可與探針發(fā)生特異性結(jié)合，那么就可得到陽(yáng)性結(jié)果；如果不與探針發(fā)生特異性結(jié)合，就得到陰性結(jié)果。
在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)，對(duì)于已經(jīng)被探針特異地吸附在載體膜上的核酸，應(yīng)當(dāng)采用信號(hào)放大的方式對(duì)核酸進(jìn)行特異地顯示?？梢岳玫姆椒òū绢I(lǐng)域熟知的金標(biāo)記、酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記等方法。其中以酶標(biāo)記最為常見(jiàn)，因?yàn)檫@種方法具有使用安全、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果清楚、不需要特殊設(shè)備、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)。常用的標(biāo)記酶是堿性磷酸酶或者過(guò)氧化物酶，一般條件下，都使用可溶性的酶反應(yīng)底物和產(chǎn)物。但是當(dāng)顯色反應(yīng)是在固相載體上進(jìn)行時(shí)，如果仍然使用可溶性的酶反應(yīng)底物和產(chǎn)物，會(huì)導(dǎo)致酶顯色反應(yīng)的有色產(chǎn)物在固相載體表面的水相層中快速擴(kuò)散，結(jié)果無(wú)法分辨。當(dāng)使用包括5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺等不溶性底物時(shí)，問(wèn)題就迎刃而解，可以清晰地觀察并便于保存。
本發(fā)明方法可用于檢測(cè)來(lái)源不同的、以及用不同方法獲得的核酸分子。較佳地，所檢測(cè)的核酸分子包括DNA、RNA、通過(guò)擴(kuò)增方法產(chǎn)生的核酸、核酸衍生物和核酸標(biāo)記物。
本發(fā)明的核酸檢測(cè)微流芯片在操作時(shí)，通常包括以下步驟(參照?qǐng)D1)1.將各種檢測(cè)核酸1點(diǎn)樣在高分子聚合膜(2)上(微點(diǎn)陣)，形成反應(yīng)區(qū)3；2.將核酸樣品5與步驟1中的高分子聚合膜的一端(即接觸端或接觸區(qū))2接觸(步驟2)3.接觸后，借助聚合膜吸水區(qū)4而產(chǎn)生的虹吸現(xiàn)象液體產(chǎn)生微流，并流過(guò)反應(yīng)區(qū)3(步驟3)。
4.核酸分子與高分子聚合膜中反應(yīng)區(qū)3上的檢測(cè)核酸發(fā)生雜交反應(yīng)，根據(jù)高分子聚合膜上各點(diǎn)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)弱判斷結(jié)果(步驟4)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，將經(jīng)典印跡檢測(cè)技術(shù)與層析原理結(jié)合，引入微點(diǎn)陣(Microarray)概念形成的微流芯片技術(shù)，用于核酸檢測(cè)不但具有高通量、微型化和集成化等生物芯片特征，更具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便等特性。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1微流芯片用于結(jié)核桿菌耐藥基因rpoB突變檢測(cè)分析對(duì)結(jié)核桿菌耐藥相關(guān)基因的突變分析，可盡早獲得感染結(jié)核菌耐藥信息，提高臨床醫(yī)生早期結(jié)核用藥的合理性，提高結(jié)核病治愈率；對(duì)于結(jié)核病合理治療方案的實(shí)施、流行病疫情監(jiān)控等具有重要的意義；結(jié)核桿菌耐藥相關(guān)基因中最重要的是與一線藥物利福平(Rifampin)相關(guān)的RpoB基因，其突變株耐藥發(fā)生率達(dá)96-98％，同時(shí)不同的突變方式與其耐藥性程度關(guān)系也十分密切，因此結(jié)核株RpoB基因突變分析非常重要。
RpoB基因突變熱點(diǎn)區(qū)域?yàn)橐欢渭s70bp的序列，圖3顯示了RpoB的部分序列(SEQ ID NO1)，其中帶下劃線的序列為突變熱點(diǎn)區(qū)域。圖4進(jìn)一步顯示了該突變熱點(diǎn)區(qū)域，即ctg agccaattcatggaccagaacaacccgctgtcggggttgacccacaagcgccgactgtcggcgctg(SEQ ID NO2)。
步驟
(1)按表1所示，設(shè)計(jì)與合成引物和探針，其中下游引物5′端帶生物素標(biāo)記；鏈霉親和素交聯(lián)堿性磷酸酶溶液(SA-AP)來(lái)自于Bio-rad公司，稀釋到1∶2000。
AP酶底物溶液來(lái)自于Bio-rad公司，事先用雙蒸水將25x專用稀釋液配制成1x稀釋液，臨用前將底物A、底物B原液分別用1x稀釋液稀釋到工作濃度(1∶50)，按1∶1比例混合。
PBS溶液分別稱取NaCl40g，KCl1.0g，Na2HPO4.12H2O6.0g，NaH2PO41.0g，在約3000ml雙蒸水中全部溶解，滴加1MNaOH至pH為7.4左右，最后加雙蒸水定容至5000ml；20xSSC溶液在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容至1L，高壓滅菌。高分子聚合膜是FF125膜(德國(guó)Schleicher&Schull公司產(chǎn)品)；(2)將寡核苷酸探針以3.6％NaCl稀釋至25uM，分別點(diǎn)樣在高分子聚合膜上，點(diǎn)分布如圖2，并通過(guò)UV交聯(lián)固定，其中，膜大小為1.5×2cm，點(diǎn)大小為φ1mm；(3)樣品核酸提取菌株稀釋液或樣本液12,000rpm離心15分鐘，棄上清。在沉淀中加入50ulDNA提取液，使沉淀懸浮后100℃沸水浴15分鐘，15,000rpm離心10分鐘；(4)PCR擴(kuò)增耐藥基因rpoBPCR擴(kuò)增條件為常規(guī)PCR條件，取已加引物的PCR反應(yīng)液46ul、Taq酶5ul混于一離心管中，旋渦振蕩器上振蕩10秒，加入樣本核酸離心上清5ul。標(biāo)記后5,000rpm離心2秒，取出置熱循環(huán)儀上。先在37℃反應(yīng)10分鐘，然后94℃保溫5分鐘，再按93℃45秒→55℃45秒→72℃60秒循環(huán)35次，最后72℃延伸5分鐘。；(5)DNA變性在擴(kuò)增后的rpoB反應(yīng)管中加入30μlDNA變性液(0.4MNaOH)，充分混勻后放置2min，加入20xSSC和水，使終濃度為2xSSC，并將液體轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)槽中，52℃放置5分鐘；(6)微流雜交52℃培養(yǎng)箱保溫中，將雜交膜一端與反應(yīng)槽中雜交液接觸52℃培養(yǎng)箱保溫時(shí)間約5到10分鐘，至雜交液被雜交膜剛好吸干，洗脫將雜交膜和反應(yīng)槽轉(zhuǎn)移至37℃恒溫箱中，加入洗滌液200ul，洗滌液為PBS含0.3％Tween-20；SA-AP酶結(jié)合反應(yīng)槽中加入200ulSA-AP酶工作液，37℃反應(yīng)5-10分鐘，至槽中液體被雜交膜剛好吸干。
酶工作液制備吸取SA-AP酶原液10μl至SA-AP酶液瓶中，混勻。
(7)底物顯色在另一反應(yīng)槽中加入顯色底物液A、顯色底物液B各200ul，混勻，使雜交膜與底物液接觸，37℃反應(yīng)5-10分鐘，判斷結(jié)果。；(8)結(jié)果掃描分析。
表1用于結(jié)核桿菌耐藥基因rpoB突變檢測(cè)的引物和探針(5′→3′)

結(jié)果如圖5-7所示。
圖5顯示了對(duì)野生株H37rv檢測(cè)結(jié)果。左側(cè)印跡點(diǎn)針對(duì)野生型探針，均顯示非常強(qiáng)的雜交信號(hào)，而針對(duì)突變型探針，信號(hào)非常弱，右上角為控制點(diǎn)。
圖6顯示了對(duì)質(zhì)控品(R1克隆)的檢測(cè)結(jié)果。質(zhì)控品為一株在rpoB野生株上進(jìn)行人工致突變，經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)的克隆株，人工致突變引入突變位點(diǎn)和方式是511CTG→CCG、516GAC→GTC、526CAC→TAC、531TCG→TTG，對(duì)照?qǐng)D2，結(jié)果相當(dāng)吻合。
圖7顯示了對(duì)一耐藥結(jié)核桿菌rpoB檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在526位點(diǎn)a→C突變，而511、513、516、518、522、531、533均未發(fā)生變化。為了證實(shí)，對(duì)該耐藥結(jié)核桿菌rpoB進(jìn)行克隆、DNA測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，526a→C變化這一檢測(cè)結(jié)果是正確的。
盡管本發(fā)明是結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行描述的，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，可以對(duì)本發(fā)明作各種等價(jià)的改動(dòng)和修改。應(yīng)理解，這些等價(jià)形式同樣在申請(qǐng)權(quán)利要求書所限定的范圍之內(nèi)。
序列表<110>上海雅貝科技有限公司<120>一種核酸檢測(cè)微流芯片<130>015139<160>28<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>409<212>DNA<213>結(jié)核桿菌<400>1tacggtcggc gagctgatcc aaaaccagat ccgggtcggc atgtcgcgga tggagcgggt 60ggtccgggag cggatgacca cccaggacgt ggaggcgatc acaccgcaga cgttgatcaa 120catccggccg gtggtcgccg cgatcaagga gttcttcggc accagccagc tgagccaatt 180catggaccag aacaacccgc tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt cggcgctggg 240gcccggcggt ctgtcacgtg agcgtgccgg gctggaggtc cgcgacgtgc acccgtcgca 300ctacggccgg atgtgcccga tcgaaacccc tgaggggccc aacatcggtc tgatcggctc 360gctgtcggtg tacgcgcggg tcaacccgtt cgggttcatc gaaacgccg 409<210>2<211>69<212>DNA<213>結(jié)核桿菌<400>2ctgagccaat tcatggacca gaacaacccg ctgtcggggt tgacccacaa gcgccgactg 60tcggcgctg 69<210>3<211>24<212>DNA<213>引物<400>3gcgatcaagg agttcttcgg cacc 24<210>4<211>23<212>DNA<213>引物<400>4cggtacggcg tttcgatgaa ccc 23<210>5<211>46<212>DNA<213>結(jié)核桿菌<400>5ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga ctgtcggcgc tggggc 46<210>6<211>24<212>DNA<213>探針<400>6ccagccagct gagccaattc atgg 24<210>7<211>24<212>DNA<213>探針<400>7ccagccagcc gagccaattc atgg 24<210>8<211>24<212>DNA<213>探針<400>8ccagccagct gagcctattc atgg 24<210>9<211>25<212>DNA<213>探針<400>9aattcatgga ccagaacaac ccgct25<210>10<211>25<212>DNA<213>探針<400>10aattcatggt ccagaacaac ccgct25<210>11<211>25<212>DNA<213>探針<400>11aattcatgta ccagaacaac ccgct25<210>12<211>24<212>DNA<213>探針<400>12ttcatggacc agaacccgct gtcg 24<210>13<211>21<212>DNA<213>探針<400>13aacccgctgt cggggttgac c21<210>14<211>21<212>DNA<213>探針<400>14aacccgctgt cggggttgac c21<210>15<211>22<212>DNA<213>探針<400>15ggttgaccca caagcgccga ct 22<210>16<211>22<212>DNA<213>探針<400>16ggttgaccta caagcgccga ct 22<210>17<211>22<212>DNA<213>探針<400>17ggttgaccga caagcgccga ct 22<210>18<211>22<212>DNA<213>探針<400>18ggttgaccca gaagcgccga ct 22<210>19<211>22<212>DNA<213>探針<400>19ggttgaccaa caagcgccga ct 22<210>20<211>22<212>DNA<213>探針<400>20ggttgacccg caagcgccga ct 22<210>21<211>22<212>DNA<213>探針<400>21ggttgacccc caagcgccga ct 22<210>22<211>18<212>DNA<213>探針<400>22gactgtcggc gctggggc18<210>23<211>18<212>DNA<213>探針<400>23gactgttggc gctggggc18<210>24<211>18<212>DNA<213>探針<400>24gactgtgggc gctggggc18<210>25<211>18<212>DNA<213>探針<400>25gactgcaggc gctggggc18<210>26<211>18<212>DNA<213>探針<400>26gactgtcggc gccggggc18<210>27<211>21<212>DNA<213>探針<400>27gccacctgaa ggaacgttca g21<210>28<211>23<212>DNA<213>探針<400>28cggtacggcg tttcgatgaa ccc 2權(quán)利要求
1.一種核酸檢測(cè)芯片，其特征在于，該檢測(cè)芯片包括檢測(cè)膜，所述檢測(cè)膜包括接觸區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)和吸水區(qū)，其中，所述檢測(cè)膜的平均孔徑0.5-10微米，且在點(diǎn)樣區(qū)固定有核酸探針點(diǎn)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150-1500微米，點(diǎn)密度為9-5000點(diǎn)/平方厘米。
2.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片上固定的探針選自下組的核酸分子DNA、RNA、肽核酸、通過(guò)擴(kuò)增方法產(chǎn)生的核酸、人工合成的寡核苷酸及這些核酸的修飾物。
3.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，點(diǎn)密度為15-2500點(diǎn)/平方厘米。
4.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，點(diǎn)密度為25-1000點(diǎn)/平方厘米。
5.一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供一核酸檢測(cè)芯片，該檢測(cè)芯片包括檢測(cè)膜，所述檢測(cè)膜包括接觸區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)和吸水區(qū)，其中，所述檢測(cè)膜的平均孔徑0.5-10微米，且在點(diǎn)樣區(qū)固定有核酸探針點(diǎn)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150-1500微米，點(diǎn)密度為9-5000點(diǎn)/平方厘米；(2)將所述的接觸區(qū)與含待檢核酸的液體接觸，液體通過(guò)微流作用被吸引通過(guò)點(diǎn)樣區(qū)，從而使點(diǎn)樣區(qū)的核酸探針與待檢核酸雜交；(3)根據(jù)點(diǎn)樣區(qū)中點(diǎn)樣點(diǎn)是否產(chǎn)生的信號(hào)，以及信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)判斷結(jié)果。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的待檢核酸包括DNA、RNA、通過(guò)擴(kuò)增方法產(chǎn)生的核酸、核酸衍生物和核酸標(biāo)記物。
7.一種核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它具有一種核酸檢測(cè)芯片，該檢測(cè)芯片包括檢測(cè)膜，所述檢測(cè)膜包括接觸區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)和吸水區(qū)，其中，所述檢測(cè)膜的平均孔徑0.5-10微米，且在點(diǎn)樣區(qū)固定有核酸探針點(diǎn)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150-1500微米，點(diǎn)密度為15-5000點(diǎn)/平方厘米。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有選自下組的一種或多種試劑(1)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用試劑；(2)進(jìn)行RNA化學(xué)修飾所用試劑；(3)進(jìn)行DNA化學(xué)修飾所用試劑；(4)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)所用試劑。
9.如權(quán)利要求1所述的核酸檢測(cè)芯片的用途，其特征在于，它被用于下列檢測(cè)分析(1)基因突變檢測(cè)分析；(2)耐藥基因突變檢測(cè)分析；(3)HLA分型檢測(cè)分析；(4)SNP分型檢測(cè)分析；(5)微生物分型檢測(cè)；(6)表達(dá)譜檢測(cè)分析；(7)藥物研發(fā)中的檢測(cè)分析。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種核酸檢測(cè)芯片，它包括檢測(cè)膜，所述檢測(cè)膜包括接觸區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)和吸水區(qū)，其中，所述檢測(cè)膜的平均孔徑0.5－10微米，且在點(diǎn)樣區(qū)固定有核酸探針點(diǎn)樣點(diǎn)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑大小為150－1500微米，點(diǎn)密度為9－5000點(diǎn)/平方厘米。本發(fā)明還公開(kāi)了使用該芯片的檢測(cè)方法、含該芯片的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的芯片技術(shù)工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、和/或成本低廉。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1408882SQ01126899
公開(kāi)日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者丁元生, 朱新賢, 徐磊 申請(qǐng)人:上海雅貝科技有限公司