核酸偶聯(lián)物、其制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物制劑與臨床藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種核酸偶聯(lián)物、其制備方 法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 世界癌癥報(bào)告Gl〇b〇can2013的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年新發(fā)癌癥病例282萬(wàn)例，因癌癥 死亡病例196萬(wàn)例，預(yù)計(jì)到2020年，每年新發(fā)和死亡癌癥病例將達(dá)到388萬(wàn)例和276萬(wàn)例。惡 性腫瘤的治療始終是醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，科技的不 斷進(jìn)步，人們對(duì)生命體的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，通過(guò)對(duì)各類疑難雜癥在基因水平上進(jìn)行治療使 醫(yī)學(xué)發(fā)生了革命性的變化，給患者帶來(lái)福音?；蛑委熥鳛橐环N新興的治療手段，己經(jīng)成為 當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域研究的前沿。
[0003] 當(dāng)前，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于腫瘤、病毒感染、乙型肝炎以及腫瘤等多種疾 病的治療。作為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的主要成員，siRNA是RNA干擾的效應(yīng)分子，可在體內(nèi)誘 導(dǎo)進(jìn)而產(chǎn)生RNA干擾效應(yīng)，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA沉默。但是裸siRNA在體內(nèi)容易被核酶 (RNase)所降解，且半衰期短，轉(zhuǎn)染效率低。因此，如何解決裸s iRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性問(wèn)題使 之免受核糖核酸酶降解，顯得尤其重要。另外，siRNA需要借助載體才能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮治療 作用，因此設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)染效率高的siRNA傳送體系，以提高siRNA的入胞能力同樣非常重要。
[0004] 細(xì)胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides，CPPs，又稱穿膜肽）的發(fā)現(xiàn)為克服細(xì)胞 膜屏障帶來(lái)了希望。它是一大類由10~30個(gè)氨基酸組成的短肽，也稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域或"特 洛伊木馬"肽或轉(zhuǎn)導(dǎo)肽等。這些肽分子不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞膜永久性損傷，并且毒性低。到目前為 止，已發(fā)現(xiàn)了多種穿膜肽，它們共有的性質(zhì):①具有凈正電荷性和兩親性;②穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率 高;③可以導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞;④可以攜帶多種活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞;⑤可以通過(guò)固相合成 或原核表達(dá)制備，方法成熟簡(jiǎn)便。當(dāng)前穿膜肽介導(dǎo)的核酸類藥物遞送的方法可以分為兩種： 一是通過(guò)穿膜肽表面的正電荷與核酸表面的負(fù)電荷之間的靜電相互作用，形成穿膜肽與核 酸類藥物的物理共混物。二是通過(guò)共價(jià)鍵使穿膜肽與核酸類藥物形成小型、單體的穿膜肽-s iRNA共價(jià)偶聯(lián)物。
[0005] 第一種方法是一種將siRNA通過(guò)靜電作用與穿膜肽結(jié)合簡(jiǎn)單有效的方法，需要過(guò) 量的穿膜肽才能與siRNA形成穿膜肽/siRNA復(fù)合物。如在形成寡聚精氨酸/siRNA復(fù)合物時(shí)， 精氨酸肽段和siRNA的混合比例為電荷12:1，摩爾比為56:1;使用MPG肽段時(shí)，電荷比為10: 1，摩爾比是84:1。但采用非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物時(shí)，大量的陽(yáng)離子穿膜肽可能與細(xì)胞中負(fù)電 分子發(fā)生非特異性的相互作用或者將胞外的負(fù)電分子帶入胞內(nèi)而引起副作用。
[0006] 第二種方法是目前認(rèn)為傳遞siRNA最有潛力的方法，可得到可溶性單體的siRNA偶 聯(lián)物。但是，由于帶有正電的細(xì)胞穿膜肽與帶有負(fù)電的siRNA易于凝結(jié)使得這種方法難以利 用，如何避免兩者之間通過(guò)靜電作用形成非共價(jià)的復(fù)合物是合成的關(guān)鍵。目前應(yīng)用比較廣 泛的是二硫鍵和硫酯鍵。由于穿膜肽的核定位特性和RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體機(jī)制的細(xì)胞質(zhì)定 位特性，使得連接穿膜肽與siRNA分子的共價(jià)鍵在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)必須是可逆的。而以二硫鍵共 價(jià)連接形成的偶聯(lián)物在細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)可被分解，釋放出連接物。因而使用穿膜肽與siRNA所形 成的特定的二硫共價(jià)鍵偶聯(lián)物，是最佳的穿膜肽介導(dǎo)siRNA遞送的方式。二硫鍵可由穿膜肽 上的甘氨酸和外源物質(zhì)的巰基來(lái)形成，一些不含有巰基的外源物質(zhì)則可使用化學(xué)修飾來(lái)添 加疏基，形成^硫鍵。
[0007] 雖然通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)SiRNA是遞送SiRNA的最佳方式，但目前只有極少數(shù)描述SiRNA 與穿膜肽通過(guò)二硫鍵共價(jià)偶聯(lián)的報(bào)道。而在已有的報(bào)道中，siRNA與穿膜肽兩者間因靜電作 用發(fā)生聚集、沉淀的問(wèn)題也未得到較好的解決。因此，如何有效解決上述技術(shù)問(wèn)題成了諸如 siRNA之類的核酸藥物傳遞研究中的當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種核酸偶聯(lián)物、其制備方法及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有 技術(shù)中核酸類藥物在細(xì)胞內(nèi)容易聚集發(fā)生沉淀的問(wèn)題。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種核酸偶聯(lián)物，該核酸偶聯(lián) 物的分子式為X-Y-B，其中，X為穿膜肽，Y是與X共價(jià)連接的柔性鏈段，B是與Y共價(jià)連接的核 酸藥物。
[0010] 進(jìn)一步地，柔性鏈段是由中性聚合物形成的線性結(jié)構(gòu)的鏈段。
[0011]進(jìn)一步地，柔性鏈段由聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中 的任意一種中性聚合物形成。
[0012] 進(jìn)一步地，中性聚合物的分子量為1000~10000,更優(yōu)選為2000~5000。
[0013 ]進(jìn)一步地，B與Y共價(jià)連接的共價(jià)鍵包括二硫鍵、腙鍵、酰胺鍵、酯鍵或醚鍵。
[0014] 進(jìn)一步地，穿膜肽選自如下任意一種:序列號(hào)為SEQ ID N0:1的LMWP、序列號(hào)為SEQ ID N0:2的Tat48-60、序列號(hào)為SEQ ID N0:3的Tat48-60-P10、序列號(hào)為SEQ ID N0:4的CAI、 序列號(hào)為SEQ ID N0:5的HIV-TAT、序列號(hào)為SEQ ID N0:6的MAP、序列號(hào)為SEQ ID N0:7的 MPGa、序列號(hào)為SEQ ID N0:8的M918、序列號(hào)為SEQ ID N0:9的R6Pen、序列號(hào)為SEQ ID NO: 10的penetratin、序列號(hào)為SEQIDN0:ll的P印-1-K、序列號(hào)為SEQIDN0:12的ARFl-22、序 列號(hào)為SEQ ID NO: 13的TplO、序列號(hào)為SEQ ID NO: 14的P0D、3~100個(gè)賴氨酸殘基組成的聚 賴氨酸以及4~9個(gè)精氨酸殘基組成的聚精氨酸;優(yōu)選聚精氨酸為8個(gè)精氨酸組成的聚精氨 酸R8。
[0015] 進(jìn)一步地，核酸藥物包括核苷酸單體或寡聚核苷酸，優(yōu)選寡聚核苷酸為非取代的 寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸為磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸，非取代的寡核 苷酸選自鎖核酸、s i RNA、mi croRNA、核酸適體、肽核酸、誘騙0DN、催化性RNA以及CpG二核苷 酸中的任意一種;更優(yōu)選寡聚核苷酸為長(zhǎng)度為19~23bp的siRNA。
[0016] 進(jìn)一步地，19~23bp的siRNA為SEQ ID NO: 17至SEQ ID NO:172中的任意一種。
[0017] 進(jìn)一步地，核酸偶聯(lián)物的給藥途徑為靜脈注射、皮下注射、黏膜給藥或者經(jīng)皮給 藥;黏膜給藥包括鼻腔黏膜、口腔黏膜、直腸黏膜和陰道黏膜中的任意一種。
[0018] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種上述核酸偶聯(lián)物的制備 方法，制備方法包括:穿膜肽的活化步驟，將穿膜肽的N端或C端特異性地與中性聚合物進(jìn)行 共價(jià)結(jié)合，得到活化的穿膜肽;核酸藥物的活化步驟，在核酸藥物反義鏈的3'端或者正義鏈 的任意一端引入不同于磷酸基團(tuán)或羥基基團(tuán)的反應(yīng)活性基團(tuán)，得到活化的核酸藥物；以及 共價(jià)連接步驟，活化的穿膜肽與活化的核酸藥物通過(guò)親核反應(yīng)或親電加成反應(yīng)得到核酸偶 聯(lián)物。
[0019] 進(jìn)一步地，中性聚合物為包括聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯 酰胺;優(yōu)選中性聚合物的分子量為1000~10000,更優(yōu)選為2000~5000。
[0020] 進(jìn)一步地，反應(yīng)活性基團(tuán)包括氨基、巰基、羧基、馬來(lái)酰亞胺基和N-羥基琥珀酰亞 胺基中的任意一種。
[0021] 進(jìn)一步地，穿膜肽選自如下任意一種:序列號(hào)為SEQ ID N0:1的LMWP、序列號(hào)為SEQ ID N0:2的Tat48-60、序列號(hào)為SEQ ID N0:3的Tat48-60-P10、序列號(hào)為SEQ ID N0:4的CAI、 序列號(hào)為SEQ ID N0:5的HIV-TAT、序列號(hào)為SEQ ID N0:6的MAP、序列號(hào)為SEQ ID N0:7的 MPGa、序列號(hào)為SEQ ID N0:8的M918、序列號(hào)為SEQ ID N0:9的R6Pen、序列號(hào)為SEQ ID NO: 10的penetratin、序列號(hào)為SEQIDN0:ll的P印-1-K、序列號(hào)為SEQIDN0:12的ARFl-22、序 列號(hào)為SEQIDN0:13的Tpl0、序列號(hào)為SEQIDN0:14的P0D、3-100個(gè)賴氨酸殘基組成的聚 賴氨酸以及4~9個(gè)精氨酸殘基組成的聚精氨酸;優(yōu)選聚精氨酸為8個(gè)精氨酸殘基組成的聚 精氨酸R8。
[0022] 進(jìn)一步地，核酸藥物包括核苷酸單體或寡聚核苷酸，優(yōu)選寡聚核苷酸為非取代的 寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸為磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸，非取代的寡核 苷酸選自鎖核酸、s i RNA、mircoRNA、核酸適體、肽核酸、誘騙0DN、催化性RNA以及CpG二核苷 酸中的任意一種;更優(yōu)選寡聚核苷酸為長(zhǎng)度為19~23bp的siRNA。
[0023] 進(jìn)一步地，19-23bp的siRNA為SEQIDN0:17至SEQIDN0:172中的任意一種。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種上述任一種核酸偶聯(lián)物在體外篩選藥物中的 應(yīng)用。
[0025]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，核酸偶聯(lián)物通過(guò)柔性鏈段連接核酸藥物和穿膜肽，柔性 鏈段能夠在物理空間上間隔核酸藥物和穿膜肽，進(jìn)而阻止強(qiáng)電負(fù)性的核酸藥物與呈正電性 的穿膜肽之間相互吸引形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而避免了核酸藥物與穿膜肽間因靜電作用而發(fā)生 聚集沉淀的問(wèn)題，使得核酸藥物進(jìn)入細(xì)胞后能夠在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其生物活性，提 高其生物利用度。
【附圖說(shuō)明】
[0026]構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0027]圖1示出了本發(fā)明的核酸偶聯(lián)物CPP-PEG-siRNA的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028]圖2示出了本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中核酸偶聯(lián)物的合成路線圖；
[0029]圖3示出了本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中所制備的核酸偶聯(lián)物L(fēng)MWP-PEG-S-S-siRNA的 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道1為核酸標(biāo)準(zhǔn)物(Marker)，泳道2為siRNA，泳道3為L(zhǎng)MWP-PEG，泳 道4 為 LMWP-PEG-S-S-siRNA，泳道 5 為 siRNA 的二聚體，泳道6 為 LMWP-PEG-S-S-siRNA 用谷胱 甘肽還原后的siRNA;
[0030]圖4A至圖4E示出了本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中所制備的核酸偶聯(lián)物L(fēng)MWP-PEG-S-S-s iRNA的質(zhì)譜表征結(jié)果;其中，圖4A示出了 LMWP的分子量；圖4B示出了 NHS-PEG-Ma 1的分子量 分布；圖4C示出了LMWP與PEG共價(jià)偶聯(lián)后形成的LMWP-PEG分子量分布；圖4D示出了Μ0Ε的分 子量;圖4E示出了 LMWP-PEG-S-S-MOE的分子量分布；
[0031] 圖5A示出了本發(fā)明一種優(yōu)選實(shí)施例中所制備的核酸偶聯(lián)物L(fēng)MWP-PEG-S-S-siRNA 與現(xiàn)有技術(shù)制備的藥物經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocol)觀察到的在MDA-MB-231細(xì)胞 中的攝取比對(duì)情況;其中，1代表roS緩沖液的空白對(duì)照組;2代表不含有任何轉(zhuǎn)染試劑的裸 siRNA組;3代表脂質(zhì)體包裹的siRNA復(fù)合體;4代表LMWP-PEG與siRNA按摩爾比1:1混合的物 理共混物;5代表LMW