骨肉瘤轉(zhuǎn)移抑制劑組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及骨肉瘤轉(zhuǎn)移抑制劑組合物及其應(yīng)用，更 具體的涉及mir-6884和/或其成熟miRNA在診斷和抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨肉瘤(osteosarcoma，0SA)是常見的惡性骨腫瘤，是從間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來，月中 瘤迅速生長是由于腫瘤經(jīng)軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織，幾乎所有骨肉 瘤轉(zhuǎn)移均經(jīng)血液轉(zhuǎn)移至肺，少數(shù)轉(zhuǎn)移至腦、腎等內(nèi)臟器官及經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。骨肉瘤的侵襲和 轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后?；蛩降闹委熞呀?jīng)成為廣大學(xué)者的研究熱點，但 是目前仍缺少骨肉瘤診斷和治療的有效靶標(biāo)，進一步尋找分子生物標(biāo)記，將具有重要的理 論和臨床應(yīng)用價值。同時如能獲得骨肉瘤血清診斷標(biāo)志物，將對骨肉瘤的診斷和治療帶來 深遠(yuǎn)的影響。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子，通過特異性結(jié)合靶基因來調(diào)控基因的表 達。研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì) 胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，具有重要的基因表達調(diào)控作用。
[0003] 本發(fā)明基于高通量測序方法，對5例轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者及5名健康對照人群進行測 序，獲得其miRNA的表達數(shù)據(jù)，進而進行生物信息學(xué)分析，選取后備miRNA進行分子生物學(xué)驗 證及靶標(biāo)驗證，結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的mir-6884與骨肉瘤密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤血液 中低表達，促進miR-6884-5p的表達可有效降低骨肉瘤細(xì)胞的迀移和侵襲，本發(fā)明提供的骨 肉瘤診治靶點可用于臨床診斷及預(yù)防檢測骨肉瘤轉(zhuǎn)移，具有很好的實際應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種抑制骨肉瘤試劑，所述試劑包含：
[0005] (a)上調(diào)mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-6884和/或其成熟 miRNA的活性的試劑；
[0006] (b)藥劑學(xué)上能接受的載體。
[0007] mir-6884的序列見序列表SEQ ID NO l，mir-6884的成熟miRNA為miR-6884-5p和 miR-6884-3p，序列見序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3。
[0008] 優(yōu)選的，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術(shù)和/或基因特異性miR Mimics技 術(shù)上調(diào)mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-6884和/或其成熟miRNA的活性。 優(yōu)選人工合成mir-6884的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)或通過調(diào)控啟動子上調(diào) mir-6884和/或其成熟miRNA的表達。
[0009] 進一步的，所述試劑具體為抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移試劑。
[0010]本發(fā)明的目的在于提供mir-6884和/或其成熟miRNA在制備抑制骨肉瘤試劑中的 應(yīng)用。
[0011] 進一步，mir-6884和/或其成熟miRNA在制備抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移試劑中的應(yīng)用。
[0012] 進一步，抑制骨肉瘤試劑包括上調(diào)mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進 mir-6884和/或其成熟miRNA的活性的試劑。
[0013] 優(yōu)選的，采用基于RNA的microRNA功能獲得性技術(shù)和/或基因特異性miR Mimics技 術(shù)上調(diào)mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄和/或促進mir-6884和/或其成熟miRNA的活性。 優(yōu)選人工合成mir-6884的短發(fā)夾RNA或通過調(diào)控啟動子上調(diào)mir-6884和/或其成熟miRNA 〇
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供mir-6884和/或其成熟miRNA在制備診斷骨肉瘤試劑中的 應(yīng)用。
[0015] 進一步，診斷骨肉瘤試劑為診斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移試劑。
[0016] 優(yōu)選的，診斷骨肉瘤試劑為診斷骨肉瘤細(xì)胞侵襲和迀移的試劑。
[0017] 進一步，mir-6884和/或其成熟miRNA在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中低表達。
[0018] 進一步，診斷骨肉瘤試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或 基于探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測 方法檢測骨肉瘤樣本中mir-6884和/或其成熟miRNA調(diào)控的靶基因的表達情況，優(yōu)選采用 northern雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤樣本中mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄。
[0019] 優(yōu)選的，基于定量PCR方法包括特異性擴增mir-6884和/或其成熟miRNA的引物，進 一步優(yōu)選，特異性擴增mir-6884的引物序列為SEQ ID N0 4;基于探針雜交方法包括與mir-6884 和 / 或其成熟 miRNA 的核酸序列雜交的探針。
[0020] 本發(fā)明的目的在于提供mir-6884和/或其成熟miRNA的靶基因在制備診斷和/或防 治骨肉瘤制劑中的應(yīng)用。進一步的，骨肉瘤為轉(zhuǎn)移性骨肉瘤。
[0021] 本發(fā)明的目的在于提供上述骨肉瘤診斷制劑在制備骨肉瘤診斷工具中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨肉瘤診斷試劑，骨肉瘤診斷試劑能夠檢測骨肉瘤樣 本中mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或免疫檢測方法檢測骨肉瘤樣本中mir-6884和/或 其成熟miRNA調(diào)控的靶基因的表達情況。
[0023] 優(yōu)選的，mir-6884和/或其成熟miRNA的靶基因在制備診斷和/或防治骨肉瘤制劑 中的應(yīng)用。
[0024] 進一步，骨肉瘤診斷試劑基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于 探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄或基于免疫方法檢測 骨肉瘤樣本中mir-6884和/或其成熟miRNA調(diào)控的革E1基因的表達情況，優(yōu)選采用northern雜 交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù) 檢測骨肉瘤樣本中mir-6884和/或其成熟miRNA的轉(zhuǎn)錄。
[0025] 本發(fā)明的目的在于提供上述防治骨肉瘤的制劑在制備骨肉瘤治療藥物或試劑中 的應(yīng)用。
[0026] 定義：
[0027] 現(xiàn)階段檢測miRNA的表達水平的方法主要包括基于高通量測序技術(shù)、基于核苷酸 雜交和基于PCR的miRNA檢測方法。基于探針雜交技術(shù)的miRNA檢測方法是一種直接檢測法， 不需要對樣本RNA進行預(yù)擴增，包括northern雜交方法、miRNA表達譜芯片、核酶保護分析技 術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。
[0028] (1 )Northern 雜交
[0029]又稱RNA印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測真核生物RNA大小，估計其豐度的實驗方法?；?本原理如下：首先在載體(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA樣本，再與經(jīng)過標(biāo)記的探針雜 交，洗滌多余的雜交探針后進行信號檢測；也可以在載體上先固定與靶miRNA序列互補的 DNA探針，然后與經(jīng)過標(biāo)記的樣本miRNA雜交，再進行信號檢測。信號標(biāo)記的方法包括同位素 標(biāo)記、熒光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。
[0030] (2)miRNA表達譜芯片
[0031]原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測固相支持物上的目標(biāo)分子。通過設(shè)計芯片上miRNA 基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)miRNA的表達水平?；蛐酒哂懈咄康膬?yōu) 點，可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達。Luminex公司研制的液相芯片 (Liquid chip)又稱多功能懸浮點陣（Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新 一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不 同的探針分子，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個獨特的 色彩編號，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對同 一個微量樣本中的多個不同分子同時進行快速的定性、定量分析，這種檢測技術(shù)被稱為 FMAP(Flexible multianalyte profiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進行，檢測速度極 快。
[0032] (3)核酶保護分析技術(shù)(RPA)
[0033] miRNA的檢測還可以采用核酶保護分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測RNA樣本混 合，熱變性后雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受 保護的RNA分子，最后通過變性PAGE電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡單 快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
[0034] (4)RAKE法
[0035] RAKE法（RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基 礎(chǔ)上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA與固定的DNA探針雜交的方法。RAKE可以敏感 特異地檢測miRNA，適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中 檢測miRNA表達譜情況。不僅如此，RAKE法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中 分離出miRNA并對其進行分析，為從存檔標(biāo)本中分析miRNA開啟了希望之門。
[0036] (5)原位雜交（in situ hybridization)
[0037] 原位雜交技術(shù)可直觀了解miRNA表達方式，是觀測miRNA時空表達的一種較簡便的 方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針方 式。
[0038] (6)基于微球的流式細(xì)胞術(shù)(bead-based flow cytometry)
[0039] 是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測與芯片技術(shù)有機地結(jié)合起來，兼有 通量大、檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點。
[0040] (7)實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR，RT-PCR)
[0041 ]熒光檢測PCR儀可對整個PCR過程中擴增