用于體內(nèi)遞送至哺乳動物細胞的、包含無質(zhì)粒的功能性核酸的、源自細菌的完整小細胞的制作方法【專利摘要】完整的、細菌衍生的小細胞可將治療上有效量的無質(zhì)粒的功能性核酸安全地引入靶標哺乳動物細胞。為此，功能性核酸可被直接包裹進入完整的小細胞，而不需要借助表達構(gòu)建體、宿主細胞的表達機制、刺激性的化學(xué)物質(zhì)或電穿孔?！緦＠f明】用于體內(nèi)遞送至哺乳動物細胞的、包含無質(zhì)粒的功能性核酸的、源自細菌的完整小細胞[0001]本申請是申請?zhí)枮?00880018076.X、2009年11月30日進入中國國家階段、申請日為2008年3月26日、發(fā)明名稱為"用于體內(nèi)遞送至哺乳動物細胞的、包含無質(zhì)粒的功能性核酸的、源自細菌的完整小細胞"的發(fā)明專利申請的分案申請。[0002]相關(guān)專利申請的交叉引用[0003]本申請要求2007年3月30日提交的、申請?zhí)枮?0/909070的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，前述申請在此通過引用全部并入本文。【
背景技術(shù)：
】[0004]最近，許多基于核酸的策略已被開發(fā)出來用于調(diào)節(jié)多種細胞功能（Opalinska和Gewirtz,2002)。各種寡核苷酸，例如:適配體、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合誘殺寡核苷酸、核酶、三鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸、免疫刺激CpG模體、反義寡核苷酸(包括肽核酸）、小干擾RNA和微RNA，因為它們的高度特異性的作用模式而作為研究工具已吸引了很多注意力。這些寡聚核酸作為治療劑也具有相當大的潛能。但是，這樣的治療劑面臨幾個障礙，包括游離核酸的不穩(wěn)定性以及這些大分子的安全、有效和革E向的細胞遞送(Dykxhoorn和Lieberman，2005)。[0005]許多基于核酸的治療策略的焦點是RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，通過RNAi細胞中長的、雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)致同源的（互補的或部分互補的）基因轉(zhuǎn)錄體的序列特異性降解。更具體而言，長的dsRNA分子通過被稱為"切酶"的內(nèi)源性核糖核酸酶加工成較小的RNA(Grishok等，2000;Zamore等，2000)。當該較小的RNA來自于外源性源時，它們被稱作"短干擾RNA"(siRNA)，而當該較小的RNA由細胞自身基因組中的RNA編碼基因產(chǎn)生時，它們被稱作"微RNA"（miRNA)。這兩類小的(通常為21至23個核苷酸)調(diào)節(jié)性RNA的區(qū)別還在于，miRNA與信使RNA(mRNA)靶標僅部分互補。[0006]短的調(diào)節(jié)性RNA結(jié)合至具有解旋酶活性和核酸內(nèi)切酶活性的所謂的"RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合物"（RISC)。解旋酶活性解開雙鏈RNA分子，使得反義鏈可結(jié)合至靶標RNA分子(Zamore等，2000;Zamore，2002;Vickers等，2003)。核酸內(nèi)切酶活性在反義鏈結(jié)合的位置水解靶標RNA。[0007]因此，在RNAi中，單鏈RNA分子（ssRNA)通過Watson-Crick堿基配對原則結(jié)合至革巴標RNA分子并征集降解靶標RNA的核糖核酸酶。相反，基因表達的反義抑制使得ssRNA結(jié)合至mRNA，阻斷翻譯，而不催化mRNA的降解。[0008]通常，調(diào)節(jié)性RNA在人類血漿中具有小于一個小時的半衰期(Layzer等，2004)并且通過腎被快速地排泄掉。因此，幾個研究團體已嘗試制備包括siRNA在內(nèi)的抗核酸酶的調(diào)節(jié)性RNA。這樣的努力的例子包括化學(xué)修飾核苷酸(例如，2'-F、2'-〇Me、鎖定核酸;LNA)或磷酸二酯骨架，例如磷酸二酯鍵（Chiu和Rana2003;Choung等，2006;Czauderna等，2003;Elmen等，2005;Layzer等，2004;Morrissey等，2005)。此外，為使得siRNA或其他調(diào)節(jié)性RNA在循環(huán)中花費的時間最小化，操作人員已將RNA分子接合至蛋白質(zhì)和抗體，以靶定所期望的哺乳動物細胞。在解決低穩(wěn)定性和快速腎排泄問題的進一步努力中，操作人員已開發(fā)出用于遞送調(diào)節(jié)性RNA的載體。多聚復(fù)合物（由核酸與聚陽離子的自組裝形成）、脂多聚復(fù)合物(通過首先縮合核酸與聚陽離子，隨后添加陽離子脂類而形成）、脂質(zhì)體和合成納米顆粒也在開發(fā)當中。[0009]這些方法也面臨許多障礙，例如：（a)載體蛋白通過腎排泄而從血清中快速清除，(b)少數(shù)可接合至每個載體蛋白的調(diào)節(jié)性RNA分子，（c)完整的調(diào)節(jié)性RNA難以與載體蛋白細胞內(nèi)脫離，（d)由可用作調(diào)理素的多聚復(fù)合物結(jié)合血清蛋白導(dǎo)致的快速清除（Dash等，1999)，和(e)脂質(zhì)體在體內(nèi)的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致核酸釋放進入血清和潛在的非特異性轉(zhuǎn)化。[0010]病毒載體也已被開發(fā)用來內(nèi)源性地產(chǎn)生調(diào)節(jié)性RNA。參見，例如，Devroe和Silver，2004。但是，這些病毒載體具有嚴重的安全顧慮。例證性的問題包括與野生型病毒的重組、插入潛能和致癌潛能、病毒誘導(dǎo)的免疫抑制、病毒載體攜帶DNA大片段的有限能力、復(fù)原至減毒病毒的毒力、難以制造和銷售、低穩(wěn)定性和有害反應(yīng)(Hacein-Bey-Abina等，2003;Kootstra和Verma，2003;Raper等，2003;Verma和Weitzman，2005;Check，2005)〇[0011]基于質(zhì)粒的系統(tǒng)也已被開發(fā)用于調(diào)節(jié)性RNA(例如siRNA或更大的（~70nt)前體、短發(fā)卡RNA(shRNA))的重組和原位表達。shRNA含有來自靶標基因的正義序列和反義序列，它們通過發(fā)卡環(huán)連接。參見，例如，Paddison等，2002。8111?嫩可由pol-III型啟動子表達，或者在是miRNA的情況下可由polII啟動子表達。[0012]如在國際申請W003/033519中所描述的，編碼shRNA、siRNA或其他調(diào)節(jié)性RNA的質(zhì)?？赏ㄟ^導(dǎo)致細胞不對稱分裂的突變被轉(zhuǎn)化至產(chǎn)生完整小細胞的親代菌株中。這種轉(zhuǎn)化產(chǎn)生重組細胞，其中質(zhì)粒在細胞內(nèi)復(fù)制，從而在細菌細胞質(zhì)中引入大量的質(zhì)粒。在不對稱分裂期間，一些質(zhì)粒分離進入小細胞細胞質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致產(chǎn)生重組小細胞。隨后，小細胞可將質(zhì)粒DNA遞送進入哺乳動物細胞，在那里質(zhì)粒DNA迀移至細胞核。在細胞核中，質(zhì)粒DNA根據(jù)具體情況表達出shRNA或其他調(diào)節(jié)性RNA，且所產(chǎn)生的核酸隨后迀移至細胞質(zhì)，在那里核酸可影響RNAi或基因抑制，這取決于所涉及的調(diào)節(jié)性RNA的性質(zhì)。[0013]但是，因為這些方法需要宿主系統(tǒng)，通過基于表達的系統(tǒng)來遞送治療上有效量的核酸涉及復(fù)雜且耗時的過程，這限制了它們的效力。因此，需要一種將功能性核酸(例如調(diào)節(jié)性RNA)遞送至靶細胞的更有效的方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0014]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含(a)多個完整小細胞，所述多個完整小細胞中的每個小細胞包含無質(zhì)粒的功能性核酸，和(b)用于所述小細胞的藥學(xué)上可接受的載體。"功能性核酸"的種類的例子有單鏈的、雙鏈的或多鏈的DNA或RNA。在一種實施方式中，所述多個小細胞含有的無質(zhì)粒功能性核酸是調(diào)節(jié)性RNA。這種調(diào)節(jié)性RNA的例子包括，但不限于，siRNA、miRNA和shRNA。[0015]被小細胞包裹的功能性核酸可靶定編碼有助于抗藥性、抗凋亡性或瘤形成等的蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄體。此外，本發(fā)明的組合物可進一步包含雙特異性配體，該雙特異性配體例如由對小細胞表面結(jié)構(gòu)特異性的第一個臂和對非吞噬性哺乳動物細胞表面受體特異的第二個臂組成。[0016]在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供一種將功能性核酸遞送至靶標哺乳動物細胞的方法。本發(fā)明的方法包括(a)提供在藥學(xué)上可接受的載體中的多個完整小細胞，每個小細胞包含無質(zhì)粒的功能性核酸，和(b)將小細胞與哺乳動物細胞接觸，使得哺乳動物細胞吞噬小細胞，因而功能性核酸被釋放進入靶細胞的細胞質(zhì)。如所提及的，功能性核酸，以調(diào)節(jié)性RNA(例如siRNA、miRNA和shRNA)為例，可靶定編碼有助于抗藥性、抗凋亡性或瘤形成的蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄體。在其他實施方式中，本發(fā)明的方法進一步包括將不同于功能性核酸的藥物遞送至靶標哺乳動物細胞。所述藥物可在給予小細胞組合物之后、同時甚至之前給藥。[0017]根據(jù)另一方面，本發(fā)明設(shè)計一種使用無質(zhì)粒的功能性核酸配制（formulate)小細胞的方法。該方法包括將多個小細胞與功能性核酸(例如，像siRNA、miRNA或shRNA之類的調(diào)節(jié)性RNA)在緩沖液中共培育。在一些實施方式中，共培育可包括溫和的搖動，而在其他實施方式中，共培育是靜止的。在一些方面，共培育持續(xù)約半個小時，而在其他方面，其持續(xù)約一個小時。在一種實施方式中，緩沖液包含緩沖鹽，例如，1X磷酸緩沖溶液。在另一種實施方式中，共培育在約4°C至約37°C、約20°C至約30°C、約25°C或約37°C的溫度進行。共培育可包[0018]其他目的、特點和優(yōu)點將從以下詳細的描述中變得顯而易見。詳細的描述和特定的實施例僅為說明性目的而給出，因為根據(jù)此詳細的描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)作出的各種改變和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯而易見。而且，實施例論證本發(fā)明的原理，而不能被預(yù)期為具體地說明將本發(fā)明應(yīng)用至對于現(xiàn)有
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員將是明顯有用的所有實施例中?！靖綀D說明】[0019]圖1圖示包裹有Cy3焚光團標記的siRNA的完整小細胞。圖1A來自光學(xué)顯微鏡，而圖1B顯示相同的、但在具有515-560激發(fā)濾光片的熒光下觀察的載玻片，顯示出與小細胞一致的強焚光siRNA分子。[0020]圖2是由熒光共焦顯微鏡檢術(shù)捕獲的圖像，并顯示EGFR-靶定的、包裹有siRNA-Plkl的小細胞附著并內(nèi)化進入體外的人乳癌細胞。[0021]圖3圖示通過使用EGFR-靶定的、包裹有KSP-siRNA的小細胞處理在裸鼠中的人乳癌(MDA-MB-468)異種移植物而獲得的顯著的抗腫瘤效應(yīng)。對照組1(4-)接受無菌生理鹽水，而實驗組2()接受[0022]EGFR小細胞siRNA-ksp(109)，每周四次。[0023]圖4圖示通過使用EGFR-靶定的、包裹有KSP-siRNA的小細胞和EGFR-靶定的、包裹有脫羧鉑氨的小細胞來處理在裸鼠中的人結(jié)腸癌(HCT116)異種移植物而獲得的顯著的抗腫瘤效應(yīng)。組1(+)的鼠接受無菌生理鹽水，而組2(4-.)、組3(+)和組4(4)的鼠，對于前1〇次劑量(見圖4)，分別使用109個EGFR小細胞siRNA-Plkl、E<；FR小細胞siRNA-KSP-：^PEeFR小細胞siRNA-KSP-2來處理。[0024]圖5提供使用實驗小細胞(EGFM、細胞slRNA-KSt^EGFR小細胞slRNA-Plkl)處理的結(jié)腸癌(HCT116)細胞的來自不同轉(zhuǎn)染后時間的FACS分析。圖5A-圖5D提供在轉(zhuǎn)染后4小時收集的樣品的FACS分析，而圖5E-圖5H顯示轉(zhuǎn)染后8小時的樣品分析。圖5A和圖5E顯示僅來自細胞的結(jié)果，而圖5B和圖5F涉及細胞+空EGFM、細胞。圖5C和圖5G顯示來自細胞+EGFR小細胞siRNA-KSP的結(jié)果，并且圖和圖5H涉及細胞+EGFM、細胞siRNA-pm。[0025]圖6提供使用實驗小細胞(EG?小細胞siRNA-KSpSEGFR小細胞siRNA-Plkl)處理的結(jié)腸癌(HCT116)細胞的來自不同轉(zhuǎn)染后時間的FACS分析。圖6A-圖6D提供在轉(zhuǎn)染后16小時收集的樣品的FACS分析，而圖6E-圖6H顯示轉(zhuǎn)染后24小時的樣品分析。圖6A和圖6E顯示僅來自細胞的結(jié)果，而圖6B和圖6F涉及細胞+空EGFM、細胞。圖6C和圖6G顯示來自細胞+EGFM、細胞siRNA-ksp的結(jié)果，并且圖6D和圖6H涉及細胞+EGFM、細胞siRNA-pm。[0026]圖7提供使用實驗小細胞(E小細胞31隱-1^或￡小細處理的結(jié)腸癌(HCT116)細胞的來自不同轉(zhuǎn)染后時間的FACS分析。圖7A-圖7D提供在轉(zhuǎn)染后32小時收集的樣品的FACS分析，而圖7E-圖7H顯示轉(zhuǎn)染后48小時的樣品分析。圖7A和圖7E顯示僅來自細胞的結(jié)果，而圖7B和圖7F涉及細胞+空EGFM、細胞。圖7C和圖7G顯示來自細胞+EGFM、細胞siRNA-KSP的結(jié)果，且圖7D和圖7H涉及細胞+EeFM、細胞siRNA-pm?！揪唧w實施方式】[0027]根據(jù)本發(fā)明，治療上有效量的功能性核酸可被包裹進小細胞中，而不需要采用刺激性的化學(xué)物質(zhì)或電穿孔。就這點來說，已開發(fā)出一種將這種治療上有效濃度的功能性核酸包裹進完整小細胞的簡單方法，該方法不涉及基于質(zhì)粒的表達構(gòu)建體或宿主細菌細胞的表達系統(tǒng)。因此，編碼功能性核酸的多核苷酸片段不被克隆進入質(zhì)粒DNA或病毒載體中。取而代之的是，無質(zhì)粒的功能性核酸經(jīng)小細胞的完整細胞膜被直接包裹進小細胞。而且，本發(fā)明的小細胞組合物可安全且有效地將治療上有效量的功能性核酸分子(例如調(diào)節(jié)性RNA，如siRNA、miRNA和shRNA)遞送至靶標哺乳動物細胞。[0028]定義[0029]除非另有說明，用在此說明書中的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有如相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。[0030]為簡便起見，以下提供用在說明書、實施例和所附權(quán)利要求書中的某些術(shù)語和詞語的含義。其他術(shù)語和詞語在說明書各處定義。[0031]除非文中明確地另外規(guī)定，單數(shù)形式"一個(a)"、"一個(an)"和"所述(the)"包括復(fù)數(shù)涵義。[0032]"反義寡核苷酸"是指與特定基因轉(zhuǎn)錄體的一部分互補的核酸分子，該核酸分子可雜交至轉(zhuǎn)錄體并阻斷其翻譯。反義寡核苷酸可包含RNA或DNA。[0033]"生物分子序列"或"序列"是指多核苷酸或多肽序列的全部或部分。[0034]可在本文中互換使用的"癌癥"、"瘤"、"腫瘤"、"惡性腫瘤"和"癌"是指表現(xiàn)出以細胞增殖的顯著失控為特征的異常生長表型的細胞或組織。本發(fā)明的方法和組合物特別應(yīng)用在惡性的、轉(zhuǎn)移前的、轉(zhuǎn)移性的和非轉(zhuǎn)移性的細胞上。[0035]"互補"是指兩種分子(例如siRNA分子及其靶標mRNA)的相互作用表面的拓撲學(xué)相容性或相互匹配。該分子可被描述為互補的，而且接觸表面特性為彼此互補。[0036]當用在，例如，"對應(yīng)于"或"代表"基因的多核苷酸或序列的語句中時，"對應(yīng)于"或"代表"是指多核苷酸的序列存在于基因中或核酸基因產(chǎn)物中，例如，mRNA。多核苷酸可整個存在于基因的基因組序列的外顯子內(nèi)，或多核苷酸序列的不同部分可存在于不同外顯子中，例如，使得鄰接的多核苷酸序列存在于剪接前或剪接后的mRNA(-種基因的表達產(chǎn)物）中。[0037]"誘殺RNA"是一種分子，其可采用與要被靶定的RNA的重要功能區(qū)相同的結(jié)構(gòu)。后一RNA可以是對哺乳動物宿主來說是天然的，或者是已感染哺乳動物細胞的病原體，例如HIV。誘殺RNA隔離通常與靶標RNA相互作用的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致哺乳動物宿主或病原體宿主的正常加工的破壞。[0038]"藥物"是指在動物(特別是哺乳動物和人類）中產(chǎn)生局部或全身性的效應(yīng)的任何生理上或藥理上有活性的物質(zhì)。[0039]"表達"通常是指一種過程，通過該過程多核苷酸序列經(jīng)歷成功的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而表達出可檢測水平的氨基酸序列或蛋白質(zhì)。在本文的某些情況下，表達是指產(chǎn)生mRNA。在另外的情況下，表達是指產(chǎn)生蛋白質(zhì)。[0040]"功能性核酸"是指一旦引入宿主細胞即特異性地干擾蛋白質(zhì)的表達的核酸分子。通常，功能性核酸分子具有通過直接干擾編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體而降低蛋白質(zhì)的表達的能力。調(diào)節(jié)性RNA(例如siRNA、shRNA、短RNA(長度通常少于400個堿基）、微RNA(miRNA)、核酶和誘殺RNA)和反義核酸構(gòu)成了示例性的功能性核酸。[0041]"基因"是指包含產(chǎn)生多肽或前體所需的控制序列和編碼序列的多核苷酸序列。多肽可由全長編碼序列或由編碼序列的任何部分編碼。基因可以為不間斷的編碼序列，或者它可包括由適當?shù)募艚狱c連接的一個或多個內(nèi)含子。而且，基因在編碼區(qū)或非翻譯區(qū)可含有可能影響表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達速率或表達控制的方式的一個或多個修飾。這種修飾包括，但不限于，一個或多個核苷酸的突變、插入、缺失和取代。就這點而言，這種被修飾的基因可被稱為"天然"基因的"變體"。[0042]"宿主細胞"是指可被或已被用作重組質(zhì)粒或其他多核苷酸轉(zhuǎn)移體（transfer)的受體的細胞，且包括已被轉(zhuǎn)染的原始細胞的子代。由于天然的、偶然的或蓄意的突變的原因，單個細胞的子代不能必然地在形態(tài)學(xué)上或在基因組或總DNA上與原始親代細胞完全相同。[0043]"雜交"是指將多核苷酸序列通過堿基配對結(jié)合至互補序列的任何方法。[0044]在本說明書中可互換使用的"個體"、"對象"、"宿主"和"患者"是指需要診斷、處理或治療的任何哺乳動物對象。在一個優(yōu)選的實施方式中，該個體、對象、宿主或患者是人。其他對象可包括但不限于牛、馬、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、靈長類和小鼠。[0045]"標記物"是指能夠直接提供或通過與信號產(chǎn)生系統(tǒng)的一個或多個額外成員相互作用而提供可檢測的信號的試劑?？芍苯訖z測的且可用于本發(fā)明的標記物包括熒光標記物。具體的熒光團包括熒光素、若丹明、B0DIPY、花菁染料等等。本發(fā)明還設(shè)計使用放射性同位素作為標記物，例如35S、32P、3H等等。也可使用色度標記物，例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳）珠粒。例如，參見專利號為4,366,241、4,277,437、4,275，149、3,996,345、3,939,350、3,850,752和3,817,837的美國專利。[0046]"寡核苷酸"是指包含例如約10個核苷酸(nt)至約lOOOnt的多核苷酸。用于本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選為約10個nt至約150個nt。寡核苷酸可為天然的寡核苷酸或合成的寡核苷酸。寡核苷酸可被修飾。[0047]"小細胞"是指細菌細胞的無核形式，它是通過在細胞分裂的二分裂期間與DNA分離協(xié)同的干擾(disturbance)而產(chǎn)生的。小細胞不同于在特定情況下自然生成和釋放的其他小泡(并非由特異性基因重排或游離基因表達引起）。在本發(fā)明中，小細胞是完整的，因為其他"裸露"形式(例如原生質(zhì)球、原生質(zhì)孔(poroplast)、原生質(zhì)體)可能滲漏被包裹的功能性核酸且可能不是治療上有效的。完整小細胞的細胞膜讓負載物保留在小細胞內(nèi)并在靶標宿主哺乳動物細胞中細胞內(nèi)釋放。[0048]在本說明書中，"修飾的"和"化學(xué)修飾的"是指下述寡核苷酸或多核苷酸，其中所有或任何堿基、糖部分和核苷酸間磷酸鍵的天然分子結(jié)構(gòu)以及在這些位點具有額外的取代或修飾的組合的分子具有一個或多個化學(xué)改變。核苷酸間磷酸鍵可以為磷酸二酯核苷酸間鍵、磷酸三酯核苷酸間鍵、氨基磷酸酯核苷酸間鍵、硅氧烷核苷酸間鍵、碳酸酯核苷酸間鍵、羧甲基酯核苷酸間鍵、乙酰胺核苷酸間鍵、氨基甲酸酯核苷酸間鍵、硫醚核苷酸間鍵、橋連氨基磷酸酯核苷酸間鍵、橋連膦酸亞甲酯核苷酸間鍵、硫代磷酸酯核苷酸間鍵、甲基磷酸酯核苷酸間鍵、二硫代磷酸酯核苷酸間鍵、橋連硫代磷酸酯核苷酸間鍵或砜核苷酸間鍵，或3'-3'、5'-3'或5'_5'鍵，和這樣的類似鍵的組合。磷酸二酯鍵可被替代的鍵取代，例如硫代磷酸酯、甲氨基、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯和胍，且多核苷酸的核糖亞單位也可被取代（例如，己糖磷酸二酯鍵;肽核酸）。修飾可在寡核苷酸分子的內(nèi)部(單個或重復(fù)的)或在末端，且可包括如核苷酸間磷酸鍵上添加例如脫氧核糖修飾和磷酸酯修飾，這種修飾粘著或交聯(lián)至相反的鏈或相關(guān)的酶或其他蛋白質(zhì)。術(shù)語"修飾的寡核苷酸"和"修飾的多核苷酸"也包括包含對糖部分(例如，3取代的核糖核苷酸的或脫氧核糖核苷酸的單體)修飾的寡核苷酸或多核苷酸，任何修飾都是通過5'至3'鍵而結(jié)合在一起。[0049]詞語"核酸分子"和術(shù)語"多核苷酸"表示任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸）的聚合形式。它們包括單鏈的、雙鏈的或多鏈的DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體，或包含嘌呤堿基和嘧啶堿基或其他天然的、化學(xué)或生化修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基團（如通?？稍赗NA或DNA中找到），或被修飾或被取代的糖或磷酸基團?？蛇x地，多核苷酸的骨架可包含合成亞單位(例如亞磷酰胺）的聚合物，因此骨架可為寡聚脫氧核糖核苷酸氨基磷酸酯或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸（例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物）、尿嘧啶(uracyl)、其他糖和連接基團（例如氟代核糖和硫代核糖）以及核苷酸支鏈。多核苷酸可通過諸如與標記成分結(jié)合之類的方法而被進一步修飾。其他類型的修飾包括加帽、使用類似物取代一個或多個天然核苷酸和引入將多核苷酸附著至蛋白質(zhì)、金屬離子、標記成分、其他多核苷酸或載體的手段。[0050]"藥學(xué)上可接受的"是指生理學(xué)的相容性。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑不會廢除被給藥的組合物的生物學(xué)活性、是化學(xué)惰性的且對被給藥的生物體沒有毒性。[0051]修飾語"無質(zhì)粒的"意指沒有用于功能性核酸的原位表達的構(gòu)建體(例如質(zhì)粒或病毒載體)。[0052]可在本文中互換使用的"多肽"和"蛋白質(zhì)"是指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可包括翻譯的、未翻譯的、化學(xué)修飾的、生化修飾的和衍生的氨基酸。多肽或蛋白質(zhì)可以是天然的、重組的或合成的，或這些的任何組合。而且，多肽或蛋白質(zhì)可包含天然蛋白質(zhì)或肽的片段。多肽或蛋白質(zhì)可以為單個分子，或者可以是多分子復(fù)合物。另外，這種多肽或蛋白質(zhì)可具有被修飾的肽骨架。該術(shù)語包括融合蛋白質(zhì)，所述融合蛋白質(zhì)包括具有異源氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)、具有異源和同源前導(dǎo)序列的融合蛋白質(zhì)、具有或不具有N末端蛋氨酸殘基的融合蛋白質(zhì)、免疫學(xué)標記的蛋白質(zhì)等等。[0053]"純化的"是指從其自然環(huán)境中移除的化合物，且其至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或99.99%不含與其天然結(jié)合的其他成分。[0054]"調(diào)節(jié)性RNA"表示一個種類，該種類包括通過RNA干擾、抑制基因表達或另外的機制影響表達的RNA。因此，除了shRNA、siRNA、miRNA和反義ssRNA，調(diào)節(jié)性RNA的種類包括核酶和誘殺RNA等等。[0055]"核酶"是指具有酶活性的RNA分子，該酶活性可以核苷酸堿基序列特異性的方式重復(fù)切割其他RNA分子。[0056]"RNA干擾"（RNAi)表示如上所述的RNA導(dǎo)引的機制，包括互補的或部分互補的靶標RNA的降解，用于基因表達(蛋白質(zhì)合成)的序列特異性調(diào)節(jié)或基因特異性調(diào)節(jié)。[0057]"序列同一性"表示相似性或互補性的程度?？赡苡胁糠滞恍曰蛲耆恍?。部分互補的序列至少部分地抑制相同序列雜交至靶標多核苷酸;使用功能性術(shù)語稱它為"基本相同的"。使用雜交分析(Southern或Northern雜交、溶液雜交等)在低嚴格性的條件下，可檢查對完全互補的序列雜交至靶標序列的抑制?；鞠嗤男蛄谢蛱结槍⒏偁幒鸵种仆耆嗤男蛄谢蛱结樤诘蛧栏裥詶l件下結(jié)合(即，所述雜交)至靶標序列。這并不是說，低嚴格性條件允許非特異性結(jié)合;低嚴格性條件需要彼此結(jié)合的兩個序列是特異性(即選擇性）相互作用。非特異性結(jié)合的缺失可通過使用甚至缺乏部分互補度（例如，小于約30%同一性)的第二個靶標序列來測試;在缺少非特異性結(jié)合時，探針將不會雜交至第二個非互補性的靶標序列。[0058]在本文中，檢查兩個核酸序列或多肽序列的序列同一性的另一種方式使得在兩個序列中需有參考殘基(referencingresidue)，當在指定區(qū)域為獲得最大對應(yīng)而比對時，參考殘基是相同的。如本文中所使用的，"序列同一性的百分數(shù)"意指通過在對比窗口比較兩個最佳比對的序列而測定的值，其中在對比窗口的多核苷酸序列的部分與用于兩個序列的最佳比對的參考序列（其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失（即，空隙）。該百分數(shù)是通過以下方式計算的：確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基的位置的數(shù)目以獲得匹配位置的數(shù)目、將匹配位置的數(shù)目除以對比窗口中的位置的總數(shù)，再將結(jié)果乘以100以獲得序列同一,性的百分數(shù)。[0059]"短干擾RNA"（siRNA)是指長度通常為約10至約30個核苷酸、能夠介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的雙鏈RNA分子。通常，siRNA分子具有通過直接與編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體相互作用而降低蛋白質(zhì)的表達的能力。[0060]功能性核酸的"治療上有效"量是當根據(jù)本發(fā)明給對象給藥時引起藥理學(xué)反應(yīng)的所討論的分子(例如siRNA、miRNA或游離的shRNA)的劑量。因此在本發(fā)明中，如以下詳細描述的，當包裹有功能性核酸的小細胞被給藥時，治療上有效量可參考在動物模型或人類對象中的與疾病或失調(diào)有關(guān)的有害情況或癥狀的預(yù)防或改善來測定。在給定情況下，對于特定對象證明是"治療上有效量"的量，可能不是對于被類似治療所考慮的疾病或癥狀的100%的對象都是有效的，即使這樣的劑量被技術(shù)實踐者視為"治療上有效量"。就這點而言，適當?shù)膭┝繉㈦S著例如所受侵襲的疾病或癥狀的類型、階段和嚴重性而改變。無論如何，當根據(jù)全文考慮時，本發(fā)明所說明的體外測試(實施例2)和體內(nèi)測試(實施例4、5和6)以及定量功能性核酸分子的小細胞遞送量的方法(實施例3)，使得有候選藥物的臨床前測試和臨床測試知識的人能夠通過例行試驗確定對于特定病征來說功能性核酸的治療上有效量。[0061]術(shù)語"治療"（"treatment""treating""treat"）是指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。該效果可以是預(yù)防性的，表現(xiàn)為完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀，并且/或者可以是治療性的，表現(xiàn)為部分或完全穩(wěn)定或治愈疾病和/或由該疾病引起的有害效果。"治療"涵蓋在哺乳動物(特別是人)體內(nèi)的疾病的任何治療，且包括：（a)防止疾病或癥狀出現(xiàn)在易患該疾病或癥狀但尚未被診斷患有該病的對象中；（b)抑制疾病癥狀，即，阻止其發(fā)展;或(c)減輕疾病癥狀，即，導(dǎo)致疾病或癥狀的消退。[0062]小細胞[0063]本發(fā)明的小細胞是大腸桿菌或其他細菌細胞的無核形式，它們是在細胞分裂的二分裂期間，通過與DNA分離協(xié)同的干擾而產(chǎn)生的。原核染色體復(fù)制與正常的二分裂有關(guān)，其涉及細胞中隔(mid-cel1septum)形成。例如，在大腸桿菌中，min基因（例如minCD)的突變可去除細胞分裂期間在細胞極體(cellpole)處的中隔形成的抑制，導(dǎo)致產(chǎn)生常規(guī)的子細胞和無核的小細胞。參見deBoer等，1992;Raskin&deBoer，1999;Hu&Lutkenhaus，1999;Harry，2001。小細胞不同于在特定情況下自然生成和釋放的其他小泡，與小細胞相反，這些小泡并非由特異性基因重排或游離基因表達引起。在優(yōu)選的實施方式中，小細胞具有完整的細胞壁（"完整的小細胞"）。[0064]除了min操縱子突變外，無核小細胞還可根據(jù)影響中隔形成的一類其他基因重排或突變而產(chǎn)生，例如在枯草桿菌中的divIVBl中的基因重排或突變。參見Reeve和Cornett，1975。小細胞也可根據(jù)在細胞分類/染色體分離中的蛋白質(zhì)的基因表達水平的微擾而形成。例如，minE的過度表達導(dǎo)致小細胞的極體分裂和小細胞的產(chǎn)生。相似地，染色體較少的小細胞可由染色體分離的缺陷產(chǎn)生，例如在枯草桿菌中的smc突變(Britton等，1998)、在枯草桿菌中的8口〇0】缺失（1代1:〇11等，1994)、在大腸桿菌中的皿11^突變(11;!^83等，1989)和在大腸桿菌中的parC突變(Stewart和D'Ari，1992)?；虍a(chǎn)物可被提供在轉(zhuǎn)化進入細胞的質(zhì)粒中(intrans)。例如，當由高拷貝數(shù)質(zhì)粒過度表達時，CafA可提高細胞分裂的速率和/或抑制復(fù)制后的染色體分配(Okada等，1994)，導(dǎo)致形成鏈狀的（chained)細胞和無核的小細胞(Wachi等，1989)。小細胞可由來源于革蘭氏陽性或革蘭氏陰性的任何細菌細胞來制備。[0065]在一個方面，小細胞含有一種或多種需要遞送的無質(zhì)粒功能性核酸。本發(fā)明的功能性核酸具有通過與編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體直接相互作用而降低蛋白質(zhì)的表達的能力。[0066]將功能性核酸包裹進入完整小細胞[0067]功能性核酸可被直接包裹進入完整小細胞。該方法省略了之前需要的步驟，例如，將編碼功能性核酸的核酸克隆進入表達質(zhì)粒，使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)生小細胞的親代細菌并產(chǎn)生重組的小細胞。取而代之的是，無質(zhì)粒的功能性核酸可通過將多個完整的小細胞與功能性核酸在緩沖液中共培育而被直接包裹進入完整的小細胞。在一些實施方式中，共培育可包括溫和的搖晃，而在其他實施方式中，共培育是靜止的。已證實，約一個小時的共培育時間是足夠的，但較短的時間（例如約半個小時)也可能是有效的。在一種實施方式中，緩沖液包含緩沖鹽，例如1X磷酸緩沖溶液。緩沖鹽可為凝膠形式。在另一種實施方式中，共培育在約4°C至約37°C;約20°C至約30°C;約25°C;或約37°C的溫度進行。在其他方面，共培育可包含約107、108、109、101°、1011、1012或1013個小細胞。溫度、時間、緩沖液、小細胞濃度等的具體參數(shù)可被優(yōu)化，以獲得特定的條件組合。[0068]該方法的成果是驚人的，因為在四十多年的時間內(nèi)，實踐者已開發(fā)出各種化學(xué)方法和電化學(xué)方法(Miller寫過評論，1994)來將核酸轉(zhuǎn)化進入細菌細胞。實踐者已利用了這些苛刻的手段，因為常規(guī)的認識已認為核酸(例如siRNA、miRNA或無質(zhì)粒的shRNA)太大而不能被動進入小細胞細胞質(zhì)。例如，孔蛋白⑴-桶蛋白，通常起擴散孔的作用）允許具有600道爾頓或更小分子量的分子被動傳輸通過細菌外膜(Nikaido,1994)。同時，編碼shRNA的雙鏈質(zhì)粒DNA超過一百萬道爾頓，而雙鏈siRNA或miRNA超過15000道爾頓。[0069]而且，一旦被包裹，功能性核酸保留在小細胞內(nèi)部且受保護而不被降解。就這點而言，使用在無菌生理鹽水中培育的包裹有siRNA的小細胞進行延長的培育研究未顯示出siRNA的滲漏。另外，將包裹有siRNA的小細胞與核酸酶共培育證實，siRNA已穿透完整小細胞的外膜且受保護而不被降解。類似地，盡管小細胞可能被預(yù)期從親代細菌的細胞質(zhì)攜帶殘留的核酸酶，但被包裹的siRNA在小細胞細胞質(zhì)中是穩(wěn)定的。被包裹的siRNA還避免了存在于吞溶酶體內(nèi)的降解機制(例如酸、氧自由基和酸解酶(Conner和Schmid，2003))，以實現(xiàn)在哺乳動物細胞內(nèi)的靶標mRNA擊倒。[0070]在其他實施方式中，靶定不同mRNA靶標的多個功能性核酸可被包裹在相同的小細胞中。這樣的方法可被用來對抗抗藥性和抗凋亡性。例如，癌癥患者通常表現(xiàn)對化療藥物的抗藥性。這種抗藥性可通過基因（例如，多抗藥性(MDR)栗和抗凋亡基因等）的過度表達來調(diào)節(jié)。為對抗這種抗藥性，可使用治療上有效濃度的編碼MDR-相關(guān)基因的功能性核酸包裹小細胞，在化療之前向患者給藥。而且，靶定不同的mRNA靶標的多個功能性核酸包裹進相同的小細胞，可提尚治療成功率，因為大多數(shù)分子革G標會突變且具有復(fù)等位基因。[0071]因此如本文所述，將無質(zhì)粒的功能性核酸直接包裹進入完整的小細胞提供了許多優(yōu)點。例如，因為本發(fā)明的方法不需要基因修飾親代細菌以適應(yīng)功能性核酸的表達，一個親代細胞可被用來產(chǎn)生包含許多類型核酸、針對多種病征的小細胞。相似地，小細胞可被裝載有多種不同的RNA，從而避免或克服抗藥性機制。[0072]功能性核酸[0073]如上所述，功能性核酸表示包括通過RNA干擾、基因表達的抑制或另外的機制影響表達的核酸分子在內(nèi)的一個種類。這種分子的例子有單鏈的、雙鏈的或多鏈的DNA或RNA。因此，功能性核酸的例子包括，但不限于調(diào)節(jié)性RNA(例如shRNA、siRNA、miRNA和反義ssRNA)、核酶和誘殺RNA和反義核酸。[0074]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，完整小細胞攜帶siRNA分子。短干擾RNA分子對于進行RNAi(-種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制)是有用的。如所提及的，"siRNA"通常是指長度為約10至約30個核苷酸的雙鏈RNA分子，它們因為其特異性地干擾蛋白質(zhì)表達的能力而被命名。優(yōu)選地，siRNA分子的長度為12-28個核苷酸，更優(yōu)選為15-25個核苷酸，還更優(yōu)選為19-23個核苷酸，最優(yōu)選為21-23個核苷酸。因此，優(yōu)選的siRNA分子的長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個核苷酸。[0075]一個鏈的長度表示了siRNA分子的長度。例如，被描述為21個核糖核苷酸長（21-mer)的siRNA可包含兩個相反鏈的RNA，它們退火在一起形成19個連續(xù)的堿基配對。在每個鏈上的兩個剩余的核糖核苷酸將形成"突出端"。當siRNA含有兩個不同長度的鏈時，較長的鏈表示siRNA的長度。例如，含有21個核苷酸長的一個鏈和20個核苷酸長的另一個鏈的dsRNA為21-mer。[0076]包含突出端的siRNA是合乎需要的。突出端可位于鏈的5'端或3'端。優(yōu)選地，突出端位于RNA鏈的3'端。突出端的長度可改變，但優(yōu)選為約1至約5個堿基，且更優(yōu)選為約2個核苷酸長。優(yōu)選地，本發(fā)明的siRNA將包含具有約2至4個堿基的3'突出端。更優(yōu)選地，3'突出端為2個核糖核苷酸長。還更優(yōu)選地，構(gòu)成3'突出端的2個核糖核苷酸為尿苷(U)。[0077]shRNA包含形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，其中莖是由包含雙鏈siRNA的互補的正義鏈和反義鏈組成，而環(huán)是具有不同尺寸的連接體。shRNA的莖結(jié)構(gòu)通常為約10至約30個核苷酸長。優(yōu)選地，shRNA分子的莖的長度為12-28個核苷酸，優(yōu)選為15-25個核苷酸，還更優(yōu)選為19-23個核苷酸，最優(yōu)選21-23個核苷酸。因此，優(yōu)選的shRNA分子包含的莖的長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個核苷酸。[0078]本發(fā)明的siRNA被設(shè)計用來與靶標核糖核苷酸序列相互作用，意味著它們充分地與靶標序列互補以雜交至靶標序列。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種siRNA分子，其包含與靶標核糖核苷酸序列或靶標核糖核苷酸序列的互補體(complement)至少70%、75%、80%、85%或90%相同的核糖核苷酸序列。優(yōu)選地，siRNA分子與靶標核糖核苷酸序列或靶標核糖核苷酸序列的互補體至少90%、95%、96%、97%、98%或100%相同。最優(yōu)選地，siRNA將與靶標核苷酸序列或核糖核苷酸序列的互補體100%相同。但是，相對靶標具有插入、缺失或單點突變的siRNA分子也可能是有效的。[0079]因此，在本發(fā)明的一個方面，完整小細胞可攜帶用來使抗藥性基因或抗凋亡性基因沉默的一種或多種siRNA序列。使用編碼多種siRNA的小細胞可能治療表達多抗藥性機制的細胞。[0080]通常，輔助siRNA設(shè)計的工具和調(diào)節(jié)性RNA對于公眾來說可輕易獲得。例如，一種基于計算機的siRNA設(shè)計工具可在互聯(lián)網(wǎng)www.dharmacon.com上獲得。[0081]功能性核酸的標靶[0082]本發(fā)明的功能性核酸靶定促進抗藥性、抑制凋亡、促進瘤生成表型、抑制病原體增殖或抑制病毒復(fù)制或增殖的蛋白質(zhì)的基因或轉(zhuǎn)錄體。在本文中的功能性核酸策略的成功應(yīng)用已在本領(lǐng)域中實現(xiàn)，但沒有受益于小細胞載體。參見，例如，Sioud(2004)，Caplen(2003)，Wu等（2003)，Yague等（2004)。[0083]有助于抗藥性或促進瘤生成表型的蛋白質(zhì)是功能性核酸的優(yōu)選靶標。所述蛋白質(zhì)可促進獲得性抗藥性或固有抗藥性。當患病細胞(例如腫瘤細胞)最初對藥物作出反應(yīng)，但在后續(xù)的治療循環(huán)中變得難以治愈，則獲得了抗藥性表型。涉及獲得性或固有抗藥性的有用靶標包括但不限于ATP結(jié)合盒型轉(zhuǎn)運蛋白，例如P-糖蛋白（P-gp、P-170、PGYl、MDRl、ABCB1、MDR相關(guān)蛋白、多抗藥性蛋白1、MDR-2和MDR-3)、MRP2(多抗藥性相關(guān)蛋白）、BCR-ABL(斷裂點簇區(qū)-Abelson原癌基因）、STI-571耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥相關(guān)蛋白、環(huán)氧酶-2、核因子k、XRCC1(X射線修復(fù)交叉互補蛋白1)、ERCC1(切除修復(fù)交叉互補基因）、GSTP1(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）、突變的微管蛋白、Abcbla(ABCB4)、Abccl、Abcc2、Abcc3(MLP_2)、Abcc5、Abcc6、Abcd2、Abcg2、Bax、Bcl2、Bcl21(bcl_x)、Mvp、Rbl、Topl、Top2a、Top2b、Trp53(p53)〇涉及抗藥性的其他基因還包括(a)涉及藥物代謝的基因，例如Arnt、Blmh、C130052I12Rik(CRR9p)、Comt、Crabpl、Cyplal、Cypla2、Cyp2bl9、Cyp2b20、Cyp2c29、Cyp2c40、Cyp2c70、Cyp2d22、Cyp2el、Dhfr、Ephxl、Ephx2、Gstml(MGST1)、Gstpl、Nat2、Nqol、Sodl、Ste、Tpmt、丁}〇118、％〇8;(13)涉及0嫩修復(fù)的基因，例如厶口6、厶1：111、131^&1、131^&2、￡1'(^3(乂?13)、]\%1]11:、]\0111、父口&、乂口(3;((3)涉及細胞周期的基因，例如(^11(11(細胞周期蛋白01)、(^1161(細胞周期蛋白El)、Cdkl、Cdk2、Cdk4、Cdknla(p21Wafl)、Cdknlb(p27Kipl)、Cdkn2a(pl6Ink4a)、Cdkn2d(pl9)、KSP.;(d)涉及生長因子受體的基因，例如Egfr、Erbb2(Neu、HER2)、Erbb3、Erbb4、Fgf2(bFGF)、Met;(e)涉及激素受體的基因，例如Ar、Esrl、Esr2、Igf2r、Ppara、Ppard、Pparg、Ppargcl、Rara、Rarb、Rxra、Rxrb、Rxrg、Srd5a2;和（f)涉及轉(zhuǎn)錄因子的基因，例如Ahr、Aplsl、Apls2、Elkl、Fos(c_fos)、Gabpa、Hifla、Mafb、Myc(c_myc)、Nfkbl、Nfkb2、Nfkbib、Nfkbie、ReIb(l_rel)、TnfrsfllA。[0084]有用的靶標還包括有助于抗凋亡性的蛋白質(zhì)。這些包括Bcl_2(B細胞白血病/淋巴瘤）、8〇1-1[^1/8打1、黏著斑激酶和?53突變蛋白。[0085]有用的靶標進一步包括致癌蛋白和突變腫瘤抑制蛋白。例子包括聯(lián)蛋白、PKC-a(蛋白激酶0、01^?、1(-1^8(￥12)、11-1^8、0?97〇63(1框1?熟解旋酶、0匪1'1(0嫩甲基化轉(zhuǎn)移酶l)、FLIP(Flice樣抑制蛋白）、03&、538?1、聚梳家族蛋白￡2112(狀8七6基因增強子同源物）、ErbBl、HPV-16E5和E7(人乳頭瘤病毒早期蛋白5和早期蛋白7)、Fortilin&MCIlP(髓樣細胞白血病1蛋白）、DIP13a(DDC相互作用蛋白13a)、MBD2(甲基CpG結(jié)合域）、p21、KLF4(Kruppel樣因子4)、tpt/TCTP(翻譯控制的腫瘤蛋白）、SPK1&SPK2(鞘氨醇激酶）、？300、？0(1(?〇1〇樣激酶-1)、1'印53、1^8、￡481、￥￡6?(血管內(nèi)皮細胞生長因子)和846-1(8(^2-相關(guān)抗死亡基因1)〇[0086]大量的分子靶標已被發(fā)現(xiàn)用于治療癌癥，且RNAi發(fā)現(xiàn)平臺正在快速地確認一系列不同的新靶標。對于本發(fā)明有用的這種分子靶標的例子包括，酪氨酸激酶(變體）、Akt(蛋白激酶13，？1(13)、4杜1、(11^2整聯(lián)蛋白、氨基肽酶、雄激素受體、4111'〇瓜4、4111'〇瓜13、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)受體（bFGFr)、Braf、癌胚抗原（CEA)、CD142、CD37、CD44、CD5、CD74、CD77、Chk1、CHK2、CHras、CSF1r、CXCR4、細胞周期蛋白D1(CCND1)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑IB(CDKN1B、口27、1(1?1)、0￥?26、成纖維細胞生長因子受體3(?6?以）、成纖維細胞生長因子受體4(FGFr4)、G250、Hedgehog(Hh)信號途徑、肝細胞生長因子/擴散因子（HGF/SF或SF/HGF)、HEr4(ErbB4)、HIF、組蛋白去乙酰酶9(HDAC9)、同源異型盒基因（H0XB7)、透明質(zhì)酸(HA)、胰島素樣生長因子(IGF)、胰島素樣生長因子1受體(16?斤、16?1廣16?1廣16?1〇、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5)、整聯(lián)蛋白樣激酶(ILK)、白細胞介素（IL6)受體、白細胞介素1(IL1)受體II、白細胞介素10(IL10)、白細胞介素4(IL4)受體、白細胞介素6(IL6)、白細胞介素15(IL15)、白細胞介素3受體a(IL3ra)鏈、從1(、從1(3、見1(1、見1(2、紡錘體驅(qū)動蛋白（1^)、層粘連蛋白5、1^&(13)、淋巴毒素〇^)0受體(LTBr)、溶血磷脂酸（LPA)受體（LPAr)、溶血磷脂酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、MAGE3、微管、MUC2、刻缺蛋白1(TAN1)、P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、P53正調(diào)節(jié)的凋亡介體(PUMA)、H)GF酪氨酸激酶(TK)信號途徑、磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)、磷脂酰肌醇3'激酶(PI3K)、纖溶酶原激活物、尿激酶(PLAU)受體(PLAUr)、Polo樣激酶(Plkl)、多腺苷二磷酸核糖、聚合酶(PARP)、增殖細胞核抗原(PCNA)、前列腺肝細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性抗原(PSA)773、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)、Rad51蛋白、RAF1、視磺酸受體(RAr)a、視磺酸受體(RAr)y、類視黃醇受體(RXr)P、絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT、hTERT)、端粒、ThomsenFriedenreich(TF)抗原、血小板反應(yīng)蛋白1(TSP1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腫瘤壞死因子a(TNFa、TNFA)、腫瘤壞死因子受體(TNFr、TNFr)、腫瘤相關(guān)碳酸酐酶(CA)IX(CA9)、I型干擾素、泛素連接酶、血管細胞黏連分子1(VCAM，CD106)、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF、VEGFA)、血管內(nèi)皮細胞生長因子D(VEGFD)、玻連蛋白（VTN)、腎母細胞瘤1(WT1)等。[0087]關(guān)于HIV感染，靶標包括HIV-Tat、HIV-Rev、HIV-Vif、HIV-Nef、HIV-Gag、HIV-Env、LTR、CD4、CXCR4(趨化因子受體)和CCR5(趨化因子受體）。[0088]因為腫瘤細胞的異質(zhì)性，許多不同的抗藥性或抗凋亡性途徑可在靶標細胞中操作。因此，用在本發(fā)明方法中的功能性核酸可隨著時間變化而需要改變。例如，如果活體解剖樣品顯示導(dǎo)致獲得性抗藥性的新的突變，那么特異性的功能性核酸可被設(shè)計并被包裹進入完整的小細胞，該小細胞被給藥至哺乳動物宿主以解決所獲得的抗藥性。[0089]經(jīng)完整的小細胞遞送功能性核酸[0090]在另一個方面，本發(fā)明提供一種遞送功能性核酸的方法，其包括(a)提供在藥學(xué)上可接受的載體中的多個完整小細胞，每個小細胞包含無質(zhì)粒的功能性核酸，和(b)將小細胞與哺乳動物細胞接觸，使得哺乳動物細胞吞噬小細胞，從而將功能性核酸釋放進入靶標細胞的細胞質(zhì)。如在公布的PCT申請W005/056749中所描述的，小細胞通過雙特異性配體而與靶標哺乳動物細胞接觸。小細胞與靶標哺乳動物細胞之間的接觸可在體外或在體內(nèi)進行。[0091]克服抗藥性和治療疾病的方法[0092]在另一方面，本發(fā)明提供一種克服抗藥性并治療對象中的疾病(例如癌癥或AIDS)的方法。該方法包括(a)將一種或多種靶定促進抗藥性的蛋白質(zhì)的基因或轉(zhuǎn)錄體的功能性核酸包裹進入完整的、純化的小細胞，（b)將含功能性核酸的小細胞與靶標哺乳動物細胞接觸，如以上引用的'749號PCT申請(在此通過引用將其并入本文)所描述的，使得哺乳動物細胞吞噬小細胞，和（c)如在公布的PCT申請W005/079854中所描述的，將藥物遞送至靶標哺乳動物細胞。優(yōu)選地，步驟(c)在步驟(a)和步驟(b)之后進行，以在給藥之前使功能性核酸減少抗藥性。遞送藥物和引入功能性核酸可連續(xù)發(fā)生、以任何順序發(fā)生或同時發(fā)生。[0093]根據(jù)本發(fā)明，藥物可通過任何常規(guī)手段被遞送。例如，藥物可通過口服遞送、腸胃外（包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和通過灌輸)遞送、局部遞送、經(jīng)皮遞送或通過吸入遞送。每種藥物的適當?shù)倪f送模式和劑量可很容易地由藥物領(lǐng)域技術(shù)人員確定。[0094]經(jīng)小細胞的藥物遞送[0095]雖然藥物遞送可通過常規(guī)手段進行，但如在公布的PCT申請W005/079854(在此通過引用將其并入本文）中所描述的，優(yōu)選地經(jīng)小細胞遞送。就這點而言，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，相同的哺乳動物細胞可通過包裹有不同負載物的靶定的完整小細胞而被成功地重復(fù)轉(zhuǎn)染。例如，包裹有功能性核酸的小細胞可轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，其后包裹有藥物的小細胞可將藥物遞送至相同的哺乳動物細胞，以獲得互補的或協(xié)同的抗腫瘤效果。[0096]藥物可被包裹在不同于功能性核酸的單獨小細胞中?；蛘撸幬锟杀话谂c功能性核酸相同的小細胞中。某些藥物可與核酸相互作用，并阻止藥物和核酸在相同小細胞中的共同包裹(co-packaging)。例如，已知阿霉素與DNA相互作用。[0097]優(yōu)選地，本發(fā)明的小細胞包含足夠量的藥物，以在靶標細胞上發(fā)揮藥物的生理學(xué)或藥理學(xué)作用。同樣優(yōu)選地，被包含在小細胞內(nèi)的藥物對于小細胞來說是異質(zhì)的的或外來的，意味著小細胞的親代細菌細胞通常不產(chǎn)生該藥物。[0098]通過在含有小細胞的細胞外介質(zhì)和小細胞細胞質(zhì)之間產(chǎn)生藥物的濃度梯度，親水的和疏水的藥物都可被包裹在小細胞中。當細胞外介質(zhì)含有比小細胞細胞質(zhì)高的藥物濃度，藥物自然地沿此濃度梯度向小細胞細胞質(zhì)內(nèi)移動。然而當濃度梯度相反時，藥物不會移出小細胞。藥物裝載進入小細胞的程序和機制如公布的PCT申請W005/079854所述。[0099]為使用通常不溶于水的藥物裝載小細胞，藥物首先可被溶解在適當?shù)娜軇┲?。例如，紫杉醇可被溶解在乙醇與聚氧乙烯EL(聚乙氧基化蓖麻油）的1:1混合物中，隨后在PBS中稀釋，以獲得紫杉醇溶液，該紫杉醇溶液被部分稀釋在含水介質(zhì)中且攜帶最少量的有機溶劑以保證藥物保留在溶液中。小細胞可在此最終介質(zhì)中培育，以實現(xiàn)藥物裝載。因此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使疏水性藥物也可擴散進行小細胞的細胞質(zhì)以獲得高的、治療上顯著的細胞質(zhì)藥物裝載量。這是未預(yù)料到的，因為小細胞細胞膜是由疏水性磷脂雙層構(gòu)成的，其被預(yù)期以阻止疏水性分子擴散進入細胞質(zhì)。[0100]使用藥物裝載小細胞的另一種方法包括在一定條件下培養(yǎng)重組的親代細菌細胞，使得親代細菌細胞轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼藥物的核酸，且藥物被釋放進入親代細菌細胞的細胞質(zhì)。例如，編碼所需藥物的細胞生物合成的基因簇可被克隆并轉(zhuǎn)移進入能夠產(chǎn)生小細胞的親代菌株?；虼氐幕蜣D(zhuǎn)錄和翻譯導(dǎo)致藥物在親代細菌細胞的細胞質(zhì)內(nèi)的生物合成，使得細菌細胞質(zhì)中充滿藥物。當親代細菌細胞分裂并形成子代小細胞時，小細胞也在其細胞質(zhì)中含有該藥物。預(yù)包裹的小細胞可通過任何合適的小細胞純化的方法來純化，包括以上所述的方法。[0101]相似地，使用藥物裝載小細胞的另一種方法包括在一定條件下培養(yǎng)含有編碼藥物的表達質(zhì)粒的重組小細胞，使得編碼藥物的基因在小細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯。[0102]藥物[0103]用于本發(fā)明中的藥物可以是任何生理或藥理活性物質(zhì)，其在動物，尤其是哺乳動物和人體內(nèi)產(chǎn)生所期望的局部或全身效應(yīng)。藥物可以是無機或有機化合物，不受限制地，包括肽、蛋白質(zhì)、核酸和小分子，其中任何一種可被特征化或不被特征化。它們可以為各種形式，例如未改變的分子、分子復(fù)合物、藥理上可接受的鹽，例如氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、月桂酸鹽、棕櫚酸鹽、磷酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、水楊酸鹽等。對于酸性藥物，可使用金屬鹽、銨鹽或有機陽離子，例如季銨鹽。還可以使用藥物衍生物，例如堿、酯和酰胺。不溶于水的藥物能以其水溶性衍生物的形式或作為其堿性衍生物被使用，無論在任何情況下或通過其遞送，該藥物可通過酶被轉(zhuǎn)化成、通過體內(nèi)pH或其它代謝過程被水解成原始的治療上有活性的形式。[0104]有用的藥物包含化療制劑、免疫抑制劑、細胞因子、細胞毒素劑、核溶解化合物(nucleolyticcompound)、放射性同位素、受體和藥物前體活化酶，它們可以是天然的或通過重組方法制備的。[0105]受經(jīng)典多藥抗藥性影響的藥物在本發(fā)明中具有特別的用處，例如長春花生物堿(例如，長春堿和長春新堿）、蒽環(huán)類抗生素(例如，阿霉素和柔紅霉素）、RNA轉(zhuǎn)錄抑制劑(例如，放線菌素-D)和微管穩(wěn)定藥物(例如，紫杉醇）。[0106]通常，癌癥化療劑為優(yōu)選的藥物。有用的癌癥化療藥物包括氮芥、亞硝基脲(nitrosorueas)、乙稀亞胺、磺酸燒酯、四嗪、鉬化合物、啼啶類似物、噪呤類似物、抗代謝物、葉酸類似物、蒽環(huán)類抗生素、紫杉烷類、長春花生物堿、拓撲異構(gòu)酶抑制劑和激素劑。示例性的化療藥物為放線菌素-D、左旋苯丙氨酸氮芥、阿糖胞苷(Ara-C)、阿那曲唑、天冬酰胺酶、BiCNU、比卡魯胺、博來霉素、白消安、卡培他濱、卡鉬、碳鉬、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、CPT-11、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷（Cytarabine)、阿糖胞苷（Cytosine8瓜13；[11081(16)、環(huán)磷酰胺(071：(?311)、達卡巴嗪、放線菌素(0301：；[1101115^；[11)、柔紅霉素、右丙亞胺、多西他賽、阿霉素、DTIC、表柔比星、乙烯亞胺、依托泊苷、氟尿嘧啶脫氧核苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他濱、赫賽汀、六甲胺、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、美法侖、巰嘌呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、氨羥二磷酸二鈉、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔單抗、類固醇、鏈佐星、STI-571、鏈佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鳥嘌呤、塞替派、雷替曲塞、托泊替康、曲奧舒凡、三甲曲沙、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、VP-16和希羅達。[0107]有用的癌癥化療藥物還包括烷基化劑，例如塞替派和環(huán)磷酰胺;烷基磺酸鹽，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮丙啶，例如硫丹、卡波醌、麥吞多派(Meturedopa)和尤里多派(Uredopa);乙烯亞胺和甲基氨基吖啶，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫化磷酰胺和三輕甲蜜胺（1^；[11161：11710101]1613111；[116);氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(Cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氧氮芥鹽酸化物、美法侖、Novembiehin、苯芥膽留醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀;硝基脲，例如卡莫司汀(Cannustine)、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀;抗生素，例如阿柔比星(Aclacinomysins)、放線菌素、安曲霉素(Authramycin)、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、刺孢霉素、洋紅霉素(Carabicin)、去甲柔紅霉素、嗜癌霉素、色霉素(Chromoinycins)、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、重氮氧代正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(Potfiromycin)、嘌羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素(Tubercidin)、烏苯美司、凈司他丁和佐柔比星;抗代謝物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物;例如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙;嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鳥嘌呤;嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟脲嘧啶脫氧核苷和5-FU;雄激素類，例如卡普睪酮、屈他雄酮、丙酸酯、環(huán)硫雄醇、Rnepitiostane和睪內(nèi)酪;抗腎上腺抗體(antiadrenals)，例如氨格魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例如亞葉酸（frolinicacid);醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；Bestrabucil;比生群；依達曲沙;地磷酰胺;秋水仙胺;地吖醌;依氟鳥氨酸(Elfornithine);依利醋銨；依托格魯;硝酸鎵;羥基脲;磨茹多糖;氯尼達明；米托胍腙;米托蒽醌、莫哌達醇;二胺硝吖啶;噴司他丁;蛋氨氮芥；啦柔比星;足葉草酸；2-乙基肼;丙卡巴肼；PSK?;雷佐生；Sizofrran;鍺螺胺;細格孢氮雜酸;三亞胺醌;三氯乙胺;2,2'，2"_三氯代三乙基胺;烏拉坦;長春地辛;達卡巴嗪；甘露莫司汀;二溴甘露醇;二溴衛(wèi)矛醇;哌泊溴烷;Gacytosine;阿糖胞苷（"Ara-C"）；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉燒，例如紫杉醇（TA.XOL?，Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，NJ)和多稀紫杉醇（Doxetaxel)(TAX(.)TEREf氧Rhone-PoulencRorer，Antony，F(xiàn)rance);苯丁酸氮芥；吉西他濱;6-硫鳥嘌呤;巰嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物例如順鉑和卡鉑;長春堿;鉑、依托泊苷(VP-16);異磷酰胺;絲裂霉素C;米托蒽醌;長春新堿;長春瑞濱;諾維本;能滅瘤;替尼泊苷;柔紅霉素;氨喋呤;希羅達;伊班膦酸鹽;CPT-11;拓撲異構(gòu)抑制劑酶RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);維A酸;Esperamicins;卡培他濱；以及上述任意藥物的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。還包括用于調(diào)節(jié)或抑制腫瘤上激素作用效果的抗激素劑，例如抗雌激素類，其包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4輕泰米芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬鹽酸鹽(Keoxifene)、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通）；以及抗雄激素類，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任意藥物的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。[0108]有用的藥物還包括細胞因子。這樣的細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。所述細胞因子中包括生長激素，例如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素;胰島素;前胰島素;松弛素;前松弛素(prorelaxin);糖蛋白激素，例如促卵胞激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子;催乳素;胎盤催乳激素;腫瘤壞死因子-a和-0;苗勒氏抑制物質(zhì);小鼠促性腺激素相關(guān)肽;抑制素;激活蛋白；血管內(nèi)皮生長因子;整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TP0);神經(jīng)生長因子，例如NGF-0;血小板生長因子;轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，例如TGF-a和TGF-0;胰島素樣生長因子I和II;紅細胞生成素（EP0);骨誘導(dǎo)因子;干擾素，例如干擾素a和y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF);和粒細胞-CSF(GCSF);白細胞介素（IL)，例如IL-l、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15;腫瘤壞死因子，例如TNF-a或TNF-0;以及其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如在此文中所使用的，術(shù)語細胞因子包括來源于自然資源或來源于重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細胞因子的生物活性等價物。[0109]所述藥物可以是前體藥物，之后由將例如肽基化療劑的前體藥物轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物的前體藥物激活酶來激活。參見例如W088/07378;W081/01145;美國專利第4，975，278號。通常，酶成分包括任何能夠以這種方式作用于前體藥物從而將其轉(zhuǎn)化成更有活性、更有細胞毒性形式的酶。[0110]將小細胞導(dǎo)向特異性哺乳動物細胞[0111]在本發(fā)明的一個方面，如在公布的PCT申請W005/056749和W005/079854中所描述的，小細胞經(jīng)雙特異性配體被導(dǎo)向至靶標哺乳動物細胞。雙特異性配體具有對小細胞成分和哺乳動物細胞成分的特異性，導(dǎo)致小細胞結(jié)合至哺乳動物細胞，使得小細胞被哺乳動物細胞吞噬，從而使功能性核酸被釋放進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。這種靶向的遞送方法可在體內(nèi)或體外進行，或者在體內(nèi)和體外進行。[0112]雙特異性配體、小細胞和哺乳動物細胞之間的接觸可以以多種不同的方式進行。對于體內(nèi)遞送，優(yōu)選地給予已附著有雙特異性配體的小細胞。因此，當雙特異性配體靶定的小細胞在體內(nèi)達到靶標細胞時，小細胞、雙特異性配體和靶標細胞都可接觸。或者，雙特異性配體和小細胞可在體內(nèi)被單獨給藥。[0113]雙特異性配體、小細胞和哺乳動物細胞之間的接觸也可以在體外的一個或多個培育期間進行。在一種實施方式中，三者被同時一起培育?？蛇x地，可進行分步培育。在逐步法的一個實施例中，小細胞和雙特異性配體首先被培育在一起，以形成雙特異性配體靶定的小細胞，該小細胞隨后倍于靶標細胞一起培育。在另一個實施例中，雙特異性配體首先與靶標細胞一起培育，隨后與小細胞一起培育。一個或多個體外培育和體內(nèi)給藥的組合也可使雙特異性配體、小細胞和哺乳動物靶細胞接觸。[0114]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，靶向遞送法可廣泛地適用于多種哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞包括通常不易于特異性粘合和內(nèi)吞小細胞的細胞。例如，在一個臂上有抗〇-多糖特異性和在另一個臂上具有抗ffiR2受體特異性或抗EGF受體特異性的雙特異性抗體配體，有效地將小細胞結(jié)合至多種靶標非噬菌性細胞上的各種受體。這些細胞包括:肺癌細胞、卵巢癌細胞、腦癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞和皮膚癌細胞。而且，所述有效的結(jié)合優(yōu)先于由每種非噬菌性細胞進行的小細胞的快速內(nèi)吞作用。[0115]本發(fā)明的靶細胞包括其中被引入功能性核酸的任何細胞。理想的靶細胞的特征是，一旦結(jié)合配體，細胞表面受體的表達有利于內(nèi)吞作用。優(yōu)選的靶細胞是非噬菌性的，意味著該細胞不是諸如巨噬細胞、樹突狀細胞以及自然殺傷細胞(NK)之類的專業(yè)的噬菌細胞。優(yōu)選的靶細胞還有哺乳動物細胞。[0116]用于本發(fā)明的靶向遞送方法中的配體包括結(jié)合至靶細胞上的表面成分和小細胞上的表面成分的任何試劑。優(yōu)選地，靶細胞上的表面成分是受體，特別是能夠介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體。配體可包含多肽和/或碳水化合物成分?？贵w是優(yōu)選的配體。例如，攜帶對由細菌衍生的完整小細胞上的表面成分和靶標哺乳動物細胞上的表面成分具有雙重特異性的雙特異性抗體，可被有效地用來將小細胞靶定至在體外和體內(nèi)的靶標哺乳動物細胞。有用的配體還包括受體、酶、結(jié)合肽、融合/嵌合蛋白和小分子。[0117]具體配體的選擇基于兩個主要的標準：（i)特異性地結(jié)合至完整小細胞的表面上的一個或多個區(qū)域，和（ii)特異性地結(jié)合至靶細胞表面上的一個或多個區(qū)域。因此，配體優(yōu)選地具有攜帶對由細菌衍生的完整小細胞表面結(jié)構(gòu)特異性的第一個臂和攜帶對哺乳動物細胞表面結(jié)構(gòu)特異性的第二個臂。第一個臂和第二個臂都可以是多價的。優(yōu)選地，即使是多價的，每個臂也是單特異性的。[0118]對于結(jié)合至由細菌衍生的小細胞而言，理想的是，配體的其中一個臂對在親代細菌細胞上發(fā)現(xiàn)的脂多糖的〇-多糖成分具有特異性。其它可被開發(fā)用于配體結(jié)合的小細胞表面結(jié)構(gòu)包括細胞表面暴露的多肽和外膜上的碳水化合物，例如菌毛(pilli)、傘毛、外膜蛋白和暴露于鞭毛細胞表面的肽片段。[0119]對于結(jié)合至靶細胞而言，配體的其中一個臂對哺乳動物細胞的表面成分具有特異性。這樣的成分包括細胞表面蛋白、肽和碳水化合物，不論是特征化的或未被特征化的。細胞表面受體，特別是能夠激活受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的受體，是用于靶定的理想的細胞表面成分。如果在靶細胞表面過度表達，對于靶定要被治療的細胞，這樣的受體會賦予額外的選擇性，從而減少遞送至非靶細胞的可能性。[0120]例如，通過選擇將細胞表面受體模體(motif)特異性地結(jié)合在所期望的細胞的配體上，所述配體可以靶定腫瘤細胞、轉(zhuǎn)移細胞、脈管系統(tǒng)細胞（例如內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞）、肺細胞、腎細胞、血細胞、骨髓細胞、腦細胞、肝細胞等等，或任何被選細胞的前體。細胞表面受體的例子包括癌胚抗原(CEA)，其在大多數(shù)的結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃腸道癌中過度表達(厘&^1^11，2003);調(diào)蛋白受體(1^-2、11611或(^外8-2)，其常常在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和子宮頸癌中過度表達(Hung等，2000);表皮生長因子受體(EGFR)，其在一系列實體瘤中高度表達，所述實體瘤包括乳腺癌、頭頸癌、非小細胞肺癌和前列腺癌（Salomon等，1995);唾液酸糖蛋白受體(Stockert，1995);轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Singh，1999);絲氨酸蛋白酶抑制劑酶復(fù)合體受體，其在肝細胞中表達(Ziady等，1997);纖維母細胞生長因子受體(FGFR)，其在胰腺癌細胞中過量表達(Kleeff等，2002);血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)，用于血管生成抑制基因治療(Becker等，2002和Hoshida等，2002);葉酸鹽受體，其在90%的非粘液卵巢癌中選擇性地過量表達(Gosselin和Lee，2002);細胞表面多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物(Batra等，1994);碳水化合物受體(Thurnher等，1994);和聚免疫球蛋白受體，其可用于將基因遞送至呼吸上皮細胞，且對于肺?。ɡ缒倚岳w維性變病）的治療具有吸引力(Kaetzel等，1997)。[0121]優(yōu)選的配體包含抗體和/或抗體衍生物。此處所用"抗體"包括由在體內(nèi)或體外發(fā)生的免疫源應(yīng)答而獲得的免疫球蛋白分子。術(shù)語"抗體"包括多克隆的、單特異性的和單克隆的抗體，以及抗體衍生物，如單鏈抗體片斷(scFv)。用于本發(fā)明中的抗體和抗體衍生物也可通過DNA重組技術(shù)而獲得。[0122]野生型抗體有四個多肽鏈，兩個相同的重鏈和兩個相同的輕鏈。兩種類型的多肽鏈有恒定區(qū)和可變區(qū)，恒定區(qū)在同種類的抗體中不變化或極少變化。可變區(qū)對于特定的抗體是唯一的，且包括一個識別特異性表位的抗原結(jié)合區(qū)。與抗體結(jié)合最直接相關(guān)的抗原結(jié)合區(qū)的區(qū)域即是"互補性決定區(qū)域"（CDR)。[0123]術(shù)語"抗體"也包括抗體衍生物，例如保留了特異性結(jié)合至抗原的能力的抗體片段。這樣的抗體片段包括Fab片段(含有抗原結(jié)合區(qū)并包括由二硫鍵橋接的輕鏈和部分重鏈的片段）、Fab'（含有單個抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段，其包括Fab和穿過鉸鏈區(qū)的重鏈的另外的部分）、F(ab'）2(由重鏈鉸鏈區(qū)的鏈間二硫鍵連接的兩個Fab'分子）、雙特異性Fab(具有兩個抗原結(jié)合區(qū)的Fab分子，每個抗原結(jié)合區(qū)可指向不同的表位)和scFv(由氨基酸鏈連接在一起的、抗體的單個輕鏈和重鏈的可變抗原結(jié)合決定區(qū)）。[0124]當抗體(包括抗體片段)構(gòu)成部分或全部配體時，抗體優(yōu)選是人源性的或被修飾以適合用于人類。所謂的"人源化抗體"在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如Osbourn等，2003。通過遺傳操作和/或體外處理來修飾抗體以減少它們在人體內(nèi)的抗原性。例如，用于人源化抗體的方法已在專利號分別為6,639,055、5,585,089和5,530，101的美國專利中描述。在最簡單的情況下，人源化抗體通過將來自小鼠mAb的被稱為互補性決定區(qū)域(CDR)的抗原結(jié)合環(huán)移植進入人IgG而形成。參見Jones等，1986;Riechmann等，1988;和Verhoeyen等，1988。然而，高親和力人源化抗體的產(chǎn)生通常需要從小鼠親代mAb的所謂的構(gòu)架區(qū)(FR)轉(zhuǎn)移一個或多個額外的殘基。也已開發(fā)出幾個人源化技術(shù)的變體。參見Vaughan等，1998。[0125]在本發(fā)明中也可使用人抗體(而不是"人源化抗體"）。它們對其各自的抗原具有很高的親和力，且可從非常大的、單鏈可變片段(scFvs)或Fab噬菌體展示庫中按常規(guī)獲得。參見Griffiths等，1994;Vaughan等，1996;Sheets等，1998;deHaard等，1999;和Knappik等，2000〇[0126]有用的配體還包括雙特異性單鏈抗體，該抗體通常是重組多肽，該重組體多肽由可變輕鏈部分(通過連接分子共價地連接至相應(yīng)的可變重鏈部分)組成。參見專利號分別為5，455，030、5，260，203和4，496，778的美國專利。雙特異性抗體也可通過其他方法制備。例如，化學(xué)復(fù)共輒對配合物可通過以化學(xué)方法連接具有不同特異性的完整抗體或抗體片段而制得。參見Karpovsky等，1984。但是，這種復(fù)共輒對配合物難于以可再生的方式制得，并且至少是正常單克隆抗體的兩倍大。雙特異性抗體也可通過二硫化物交換而制得，這涉及酶裂解和抗體片段的重新組合。參見Glennie等，1987。[0127]因為Fab片段和scFv片段是單價的，因此它們通常對靶結(jié)構(gòu)具有低親和力。因此，由這些成分制得的優(yōu)選的配體被改造成二聚的、三聚的或四聚的共輒物以增強功能性親和力。參見Tomlinson和Hoi1iger，2000;Carter，2001、Hudson和Souriau，2001;和Todorovska等，2001。這種共輒結(jié)構(gòu)可通過化學(xué)交聯(lián)和/或遺傳學(xué)交聯(lián)而制備。[0128]本發(fā)明的雙特異性配體優(yōu)選在每一端都是單特異性的，即，在一端對小細胞上的單個成分是特異性的，而在另一端對靶細胞上的單個成分是特異性的。配體可以在一端或兩端都是多價的，例如，以所謂的雙抗體、三鏈抗體和四鏈抗體形式存在。參見Hudson和Souriau，2003。雙抗體是通過兩個scFv的非共價連接而形成的二價二聚體，其產(chǎn)生兩個Fv結(jié)合位點。同樣地，三鏈抗體通過形成三個scFv的三價三聚體而得到，產(chǎn)生三個結(jié)合位點，而四鏈抗體通過形成四個scFv的四價四聚體而得到，產(chǎn)生四個結(jié)合位點。[0129]對哺乳動物細胞上的受體具有特異性的幾個人源化的、人的以及小鼠的單克隆抗體和抗體片段已被批準用于人類的醫(yī)療用途，并且數(shù)量快速增多。參見Hudson和Souriau，2003。這種可被用來形成對HER2具有特異性的雙特異性配體的一個臂的抗體的例子是:赫賽汀TM;曲妥珠單抗。[0130]抗體可變區(qū)也可被融合至許多蛋白質(zhì)域。融合至人免疫球蛋白域(例如IgGlCH3)既增加了質(zhì)量又促進了二聚化。參見Hu等，1996。融合至人Ig鉸合部-Fc區(qū)可增加效應(yīng)子功能。同樣，融合至來自多聚體蛋白的異源蛋白區(qū)域促進多聚化。例如，將短scFv融合至短的兩親性螺旋已被用于制備微型抗體。參見Pack和Pluckthun,1992。來自形成異源二聚體(例如fos/jun)的蛋白質(zhì)的區(qū)域，可被用于制備雙特異性分子(Kostelny等，1992)，可選地，同源二聚化區(qū)域可通過工程化策略，如"凹凸配合(knobsintoholes)"（Ridgway等，1996)，而被改造形成異源二聚體。最后，可選擇使用融合蛋白伴侶(partner)，其提供多聚化作用和額外的功能，例如鏈霉抗生物素蛋白。參見Dubel等，1995。[0131]遞送至有吞噬或內(nèi)吞能力的細胞[0132]本發(fā)明還提供通過將細菌衍生的小細胞與有吞噬或內(nèi)吞能力的哺乳動物細胞接觸的遞送。這樣的能夠以胞內(nèi)細菌性病原體的方式吞噬親代細菌細胞的哺乳動物細胞同樣吞噬小細胞，該小細胞將它們的負載物釋放至哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。不需要使用靶向配體即可實現(xiàn)這種遞送方法。[0133]在小細胞被給定類型的細胞吞噬的過程中可能涉及多種機制，而本發(fā)明在這點上并不依賴于任何特定機制。例如，吞噬作用是一個被眾多文件記載的過程，在該過程中巨噬細胞和其它吞噬細胞(例如中性白細胞)通過在顆粒表面伸展偽足直到該顆粒被完全包裹的方式攝取該顆粒。雖然被描述為"非特異性"吞噬作用，但在該過程中已證實涉及特異性受體。參見Wright等（1986);Speert等（1988)。[0134]因此，一種形式的吞噬作用涉及表面配體與位于偽足膜上的配體受體之間的相互作用。這種由特異性受體介導(dǎo)的附著步驟被認為依賴于細菌表面粘附素。對于毒性較小的細菌，例如非腸毒性大腸桿菌，在缺乏噬菌細胞受體的表面配體的情況下也可發(fā)生吞噬作用。參見例如Pikaar等（1995)。因此，本發(fā)明包括但不限于利用具有或缺乏表面粘附素的小細胞，是否具有粘附素要與它們的親代細菌細胞的性質(zhì)一致，并且該小細胞被噬菌細胞(即"有吞噬能力的"宿主細胞)吞噬，其中中性粒細胞和巨噬細胞是哺乳動物中的主要類型。[0135]另一個吞噬過程是內(nèi)吞作用，細胞內(nèi)病原體，例如沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、螺桿菌屬、假單胞菌屬和乳桿菌屬，通過這種方式進入哺乳動物上皮細胞中并在那里復(fù)制。在這點上，兩個基本機制是網(wǎng)格蛋白依賴型的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，也稱為"有被小窩內(nèi)吞作用"（Riezman，1993)，以及網(wǎng)格蛋白非依賴型的內(nèi)吞作用（Sandvig&Deurs，1994)。當有吞噬能力的細胞通過內(nèi)吞作用（即，"有內(nèi)吞能力"的宿主細胞)吞噬本發(fā)明的小細胞時可能涉及其中一個機制或兩個機制。代表性的有內(nèi)吞能力的細胞為乳腺上皮細胞、胃腸道中的腸上皮細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞以及泌尿道和膀胱上皮細胞。[0136]當不使用靶向配體向有吞噬能力的哺乳動物細胞有效遞送時，本申請設(shè)計的本質(zhì)將影響所使用的小細胞的細菌來源的選擇。例如，沙門氏菌種、埃希氏菌種和志賀氏菌種攜帶粘附素(可被胃腸道中腸上皮細胞上內(nèi)吞作用介導(dǎo)的受體識別），且可能適合于遞送對結(jié)腸癌細胞有效的藥物。類似地，由幽門螺桿菌衍生的、攜帶對胃上皮細胞有特異性的粘附素的小細胞，可適合于針對胃癌細胞的遞送。對于由假單胞菌種衍生的、攜帶由肺上皮細胞上的受體識別的粘附素的小細胞，吸入法或吹入法可能是理想的給藥方法。由乳桿菌衍生的、攜帶對泌尿道和膀胱上皮細胞具有特異性的粘附素的小細胞，可非常適合于將藥物尿道內(nèi)遞送至泌尿道癌或膀胱癌。[0137]制劑[0138]在一個方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含(a)多個完整的小細胞，所述多個完整小細胞中的每個小細胞包含無質(zhì)粒的功能性核酸，和(b)用于小細胞的藥學(xué)上可接受的載體。[0139]該制劑任選地包含藥物。在一個實施例中，制劑的小細胞含有藥物，而在另一個實施例中，小細胞可含有編碼藥物的核酸分子，例如質(zhì)粒。[0140]制劑還任選地含有用于將小細胞靶定至靶細胞的雙特異性配體。小細胞和配體可為本文所述的任何一種。因此，小細胞含有編碼功能性核酸的核酸，且雙特異性配體優(yōu)選地能夠結(jié)合至小細胞的表面成分和靶標哺乳動物細胞的表面成分。[0141]制劑可以單位劑量地形式提供，例如，以安瓿或管形瓶的形式，或者以多次劑量容器的形式，所述制劑具有或不具有添加的防腐劑。所述制劑可為溶液、懸浮液或者在油性或水性載體中的乳狀液，并可包含配方劑，例如:懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。合適的溶液與接受者血液等壓，以生理鹽溶液、林嘉氏溶液和葡萄糖溶液為例?？蛇x地，制劑可為凍干粉末形式，用于使用諸如無菌、無熱原水或生理鹽水之類的合適載體來復(fù)原。制劑還可制備成微球的形式。這種長效制劑可通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi)）或肌內(nèi)注射給藥。[0142]給藥途徑[0143]本文所述的制劑可通過各種途徑給藥至哺乳動物體內(nèi)的不同位點，以獲得所需的局部或系統(tǒng)治療效果?？赏ㄟ^以下方法完成遞送，例如，通過口服給藥、通過將制劑應(yīng)用至體腔、通過吸入或吹入法、或者通過腸胃外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、肝內(nèi)、腹膜、皮下、腫瘤內(nèi)或經(jīng)皮給藥。給藥的模式和位點取決于靶細胞的位置。例如，通過被靶定的小細胞的吸入遞送可有效靶定囊性纖維性變細胞。類似地，通過被靶定的小細胞的靜脈遞送可更加有效地治療腫瘤轉(zhuǎn)移。通過被靶定的小細胞的腹腔內(nèi)遞送可治療源發(fā)性卵巢癌。[0144]純度[0145]在一個方面，小細胞基本上不含雜質(zhì)親代細菌細胞。因此，含小細胞的制劑優(yōu)選為每107個小細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞，更優(yōu)選為每108個小細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞，甚至更優(yōu)選為每1〇9個小細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞，還更優(yōu)選為每1〇1()個小細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞，且最優(yōu)選為每1011個小細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞。[0146]純化小細胞的方法在本領(lǐng)域是已知的，且在國際公開號為W003/033519的申請中有描述。一種這樣的方法將交叉流過濾(進料流動與膜表面平行;F〇rbeS，1987)與死端過濾(進料流動與膜表面垂直)組合。任選地，在過濾組合之前，可進行低離心力的差速離心，以出去一些部分的細菌細胞，從而使上清液富集小細胞。[0147]另一種純化方法使用在生物學(xué)相容性介質(zhì)中的密度梯度離心。離心后，從梯度中收集小細胞帶，且任選地，小細胞經(jīng)受進一步的密度梯度離心循環(huán)，以使純度最大化。該方法可進一步包括在含小細胞的樣品上進行差速離心的預(yù)備步驟。當以低離心力進行時，差速離心將除去一些部分的親代細菌細胞，從而使上清液富集小細胞。[0148]特別有效的純化方法使用細菌絲化(filamentation)以增加小細胞純度。因此，小細胞純化方法可包括以下步驟：（a)使含有小細胞的樣品經(jīng)受一定條件以誘導(dǎo)親代細菌細胞采取絲狀形式，隨后(b)過濾樣品以獲得純化的小細胞制劑。[0149]也可組合已知的小細胞純化方法。一種高效的方法組合如下：[0150]步驟A:差異離心小細胞產(chǎn)生細菌細胞培養(yǎng)物。此步驟(可在2000g進行約20分鐘）除去大多數(shù)親代細菌細胞，而在上清液中留下小細胞。[0151]步驟B:使用等壓的和無毒的密度梯度介質(zhì)的密度梯度離心。此步驟將小細胞與許多污染物分開，包括親代細菌細胞，而具有最小的小細胞損失。優(yōu)選地，在純化方法中重復(fù)此步驟。[0152]步驟C:通過0.45M1過濾器的交叉流過濾，以進一步減少親代細菌細胞污染。[0153]步驟D:殘留親代細菌細胞的應(yīng)激誘導(dǎo)絲化。這可通過將小細胞懸浮液經(jīng)受幾種應(yīng)激誘導(dǎo)的環(huán)境條件中的任何一種而完成。[0154]步驟E:抗生素處理以殺死親代細菌細胞。[0155]步驟F:交叉流過濾以除去小的污染物，例如膜泡、膜碎片、細菌殘骸、核酸、機制成分等等，并濃縮小細胞?？墒褂茅?2WI1過濾器以將小細胞與小污染物分離，可使用0.1M1過濾器以濃縮小細胞。[0156]步驟G:死端過濾以消除絲狀死亡細菌細胞。0.45mi過濾器可被用于此步驟。[0157]步驟H:從小細胞制劑中除去內(nèi)毒素?？怪|(zhì)A涂布的磁珠可被用于此步驟。[0158]給藥安排[0159]通常，本文公開的制劑可以按通過給藥途徑測試確定的適當劑量被使用，以獲得最佳的生理學(xué)作用，同時使任何潛在的毒性最小化?？筛鶕?jù)多種因素選擇劑量方案，這些因素包括年齡、體重、性別、患者的醫(yī)療條件;被治療病癥的嚴重程度、給藥途徑以及患者的腎功能和肝功能。[0160]在獲得小細胞和藥物產(chǎn)生最大效力和最小副作用的范圍內(nèi)的濃度的最佳精確度時，可能需要一種基于功能性核酸動力學(xué)和對靶位點及靶細胞的藥物利用度的方案。當確定治療方案的最佳濃度時，可考慮小細胞或藥物的分散、平衡和消除。當結(jié)合使用小細胞和藥物時，可調(diào)整小細胞和藥物的劑量以達到所需效果。[0161]而且，可使用藥動學(xué)/藥效學(xué)模型系統(tǒng)優(yōu)化所述制劑的給藥劑量。例如，可選擇一個或多個劑量方案來確定所述一個或多個劑量方案的藥動學(xué)/藥效學(xué)曲線。隨后，選擇其中一個用于給藥的劑量方案，該方案根據(jù)特定的藥動學(xué)/藥效學(xué)曲線獲得所需的藥動學(xué)/藥效學(xué)反應(yīng)。參見，例如，W000/67776。在這點上，用于任何病征的劑量方案可使用本文在實施例6中所描述的方法和模型(被修改以用于所感興趣的特定細胞)來確定。[0162]具體而言，在數(shù)周的過程中，所述制劑每周給藥至少一次。在一種實施方式中，所述制劑在數(shù)周至數(shù)月的過程中每周給藥至少一次。[0163]更具體地，制劑可至少每天給藥一次，并且持續(xù)約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天?；蛘?，所述制劑可約每隔一天、約每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天或更長時間給藥一次。[0164]可選地，所述制劑可約每隔一周、約每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更長時間給藥一次?；蛘?，所述制劑可每周給藥至少一次，并持續(xù)約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更長時間。[0165]可選地，所述制劑可約每隔一月、約每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間給藥一次。[0166]所述制劑可按單個日劑量給藥，或按總?cè)談┝棵咳辗殖?次、3次或4次給藥。[0167]在給藥前給予小細胞的方法中，可在給予小細胞后的數(shù)分鐘到數(shù)個小時的任何時間給藥?；蛘撸稍诮o予小細胞后的數(shù)個小時到數(shù)天，可能為數(shù)個星期直至到數(shù)個月的任何時間給藥。[0168]更具體而言，可在給藥前至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個小時給予包裹有功能性核酸的小細胞。而且，可在給藥前至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天給予小細胞。在另一種實施方式中，可在給藥前至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更長時間給予小細胞。在另一種實施方式中，可在給藥前至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月給予小細胞。[0169]在另一種實施方式中，在給藥后給予小細胞?？稍诮o藥后數(shù)分鐘到數(shù)個小時的任何時間給予小細胞?；蛘?，可在給藥后數(shù)個小時到數(shù)天，可能是數(shù)個星期直至數(shù)個月的任何時間給予小細胞。[0170]以下實施例僅是說明性的，而非限制性的，其提供本發(fā)明的更完全的理解。[0171]實施例[0172]1.在體外將調(diào)節(jié)性RNA直接包裹進完整的小細胞[0173]如在公布的美國申請第US2004/0265994號所述制備并純化細菌衍生的完整小細胞。獲得了Cy3標記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)siRNA，該物質(zhì)的最大激發(fā)波長(Amax)為547nm，最大發(fā)射波長(Amax)為563nm，它是Ambion(Austin,TexasUSA)的產(chǎn)品，并在無核酸酶的水中復(fù)原至最終濃度50yM。[0174]約107個小細胞被重懸在1X磷酸緩沖液(PBS)(Gibco)中，并且與lyM的Cy3-標記的GATOHsiRNA共培育。培育在37°C進行2個小時，并伴隨溫和的混合。通過僅與1XPBS培育來模擬裝載對照小細胞。裝載后小細胞通過以16200Xg離心10分鐘而形成小球并使用IXPBS洗滌兩次。在熒光DMLB顯微鏡下觀察實驗小細胞和對照小細胞，該顯微鏡是Leica(Germany)的產(chǎn)品，帶有D70照相機(OlympusMicroscopes(Germany)的產(chǎn)品）。使用100X油浸鏡頭獲得圖像。[0175]上述共培育實驗也在不同的實驗條件下進行，例如在室溫下、在37°C和4°C培育。另外，共培育時間是變化的，分別包括1小時、2小時、4小時和12小時。[0176]如圖1B所示，完整的siRNA分子快速擴散進入小細胞。在37°C的2個小時的培育足以獲得相當大量的小細胞的包裹。[0177]為了確定siRNA分子是位于小細胞內(nèi)還是粘附在小細胞表面上，將具有Cy3_熒光標記的siRNA小細胞與核酸外切酶培育過夜，隨后重復(fù)熒光顯微鏡檢術(shù)。結(jié)果與圖1B所示的相同，顯示siRNA被小細胞內(nèi)化，并非粘附在小細胞表面上。[0178]2.使用包裹RNA的、雙特異性抗體靶定的小細胞體外轉(zhuǎn)染人乳癌細胞[0179]為證實攜帶調(diào)節(jié)性RNA的小細胞在體外的血清中是穩(wěn)定，且為證實它們可被特異性靶定的哺乳動物細胞內(nèi)化，進行了以下的實驗。[0180]使用靶標序列5'-GGTGGATGTGTGGTCCATTTT-3'合成導(dǎo)向polo激酶l(Plk1)的siRNA，并使用焚光標記物(AlexaFluor488)標記該siRNAJolo激酶在進入有絲分裂期間、中心體成熟期間、兩極紡錘體形成期間、染色體分離期間和胞質(zhì)分裂期間有多種功能，且特別重要的是，在檢查點控制的保真性監(jiān)控中有多種功能(Glover等，1998;Barr等，2004;vandeWeerdt和Medema2006)。在人類中，Plkl是此家族中特性描述最充分的成員。Plkl與腫瘤發(fā)生有關(guān)，且屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，該家族是新型化學(xué)療法的有吸引力的靶標。因此，Plkl被視為抗癌藥開發(fā)的有前景的祀標(Strebhardt和Ullrich,2006)。[0181]如在實施例1中所描述的，純化小細胞并將109個小細胞與抗AF488PlklsiRNA-起包裹。制備攜帶抗鼠傷寒沙門氏菌〇-抗原特異性和抗人EGFR特異性的雙特異性抗體(BsAb)，并將該雙特異性抗體附著至如PCT公布申請TO05/056749中所描述的小細胞AF488-Plkl-siRNA。所產(chǎn)生的小細胞被命名為EGFM、細胞AF488-Plkl-SiRNA。在組織培養(yǎng)液中，以10000個小細胞：1個腫瘤細胞的密度，將這些小細胞(1〇9)與人乳癌細胞一起培育。培育進行1個小時、2個小時、4個小時和24個小時。在每個時間點，收集細胞并用DAPI(核染劑，藍色熒光)染色。使用1X81共焦顯微鏡(Olympus)和CellR軟件觀察細胞。[0182]經(jīng)1個小時，發(fā)熒光的、攜帶siRNA的小細胞已粘附至MDA-MB-468細胞(見圖2)。這種附著被認為是由于結(jié)合至附著在小細胞上的BsAb引起的，該BsAb靶定MDA-MB-468細胞上的EGF受體，因為使用非靶定的小細胞AF488-Plkl-SiRNA的對照培育被洗掉，且未顯示出與MDA-MB-468細胞有關(guān)的任何綠色熒光。經(jīng)2個小時的后培育嚴FR小細胞AF488-Plki-SiRNA被內(nèi)化進入MDA-MB-468細胞，且顯示出強烈的綠色熒光。經(jīng)24個小時，大多數(shù)綠色熒光消失，表明內(nèi)化的小細胞已被分解(大概被在吞噬溶酶體中分解）。[0183]3.從完整小細胞中提取和量化siRNA[0184]因為siRNA不會在細菌細胞或細菌衍生的小細胞中自然出現(xiàn)，不存在已確定的用于從這種粒子中提取siRNA的方法也不足為怪。因此，根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明人開發(fā)出一種定量提取被包裹在完整小細胞內(nèi)的siRNA的方法。[0185]紡錘體驅(qū)動蛋白（KSP)(也稱作"驅(qū)動蛋白-5"和"Eg5"）是微管驅(qū)動蛋白。它對于有絲分裂期間兩極紡錘體的形成以及姐妹染色單體的適當分離是必要的（Enos和Morris，1990;Blangy等，1995;Sawin和Mitchison，1995;Dagenbach和Endow，2004)dKSP的抑制導(dǎo)致單極有絲分裂紡錘體的形成，激活紡錘體組裝檢查點并使細胞停留在有絲分裂期，導(dǎo)致后續(xù)的細胞死亡(Blangy等，1995;Caner等，1999;Kapoor等，2000;Tao等，2005)〇[0186]選擇抗KSP的siRNA用于包裹在小細胞中，以顯示（inform)本發(fā)明的從小細胞提取81尺祖的最優(yōu)化條件((^1：；[1111231：；[011)。更具體地，1(3?-1-811?祖雙鏈寡核苷酸序列（正義鏈：5'-AACTGGATCGTAAGAAGGCAG-3'）被合成并根據(jù)前述實施例1中的程序包裹進小細胞。[0187]使用許多商業(yè)上可獲得的核酸提取試劑盒，處理小細胞slRNA-KSP(101())和相當量的對照空小細胞。結(jié)果顯示，mirVanamiRNA分離試劑盒(Ambion)提供從完整小細胞中定量提取siRNA-KSP。程序根據(jù)制造商的說明書進行。[0188]被純化的siRNA首先用超敏焚光核酸染料RiboGreen?(MolecularProbesInc.(Eugene，0reg〇nUSA)的產(chǎn)品）染色，隨后使用NanoDropND-3300熒光分光光度計(NanoDropTechnologiesInc.(Wilmington，DelawareUSA)的產(chǎn)品）定量（同樣根據(jù)制造商的說明書進行）ANA結(jié)合的RiboGreen?的最大激發(fā)波長為~500nm，最大發(fā)射波長為~525nm〇[0189]結(jié)果顯示，小細胞能夠攜帶siRNA。101(3個空小細胞攜帶~1.4ygRNA，大概是內(nèi)源性形成的細菌RNA的背景水平。相同數(shù)目的小細胞siRNA-KSP攜帶~2.7ygRNA，包含內(nèi)源性細菌RNA和外源性包裹的siRNA-KSP。因此，這些數(shù)據(jù)證實，101()個小細胞可包裹至少~1.3yg的外源性包裹的siRNA。[0190]4.包裹有調(diào)節(jié)性RNA的小細胞所達到的抗腫瘤效果的體內(nèi)證實[0191]進行了以下研究，以顯示包裹有調(diào)節(jié)性RNA的小細胞可以以治療上有效濃度將完整的調(diào)節(jié)性RNA遞送至體內(nèi)的腫瘤細胞。[0192]如實施例3中所描述的抗KSP的siRNA被選擇用來依照本發(fā)明包裹在小細胞中。如實施例1所描述的，純化小細胞并將1〇9個小細胞與抗KSPsiRNA-起包裹。如實施例2所描述，還制備了BsAb并將其附著至小細胞siRNA-KSP，以產(chǎn)生EGFM、細胞siRNA-ksp。[0193]用在此實施例中的小鼠是從AnimalResourcesCentre(Perth，WA,Australia)購買的，且所有動物實驗都遵循實驗動物飼養(yǎng)管理及使用規(guī)范且獲得動物倫理委員會批準。試驗在EnGeneICPtyLtd(Sydney,NSW,Australia)的經(jīng)NSW農(nóng)業(yè)部批準的小動物設(shè)備上進行。[0194]在補充有GIBC0-BRL5%小牛血清（InvitrogenCorporation(Carlsbad,CaliforniaUSA)的產(chǎn)品）和谷酰胺（Invitrogen)的RPMI1640培養(yǎng)基中，在95%空氣和5%C02的潮濕氣氛中，在37°C時以組織培養(yǎng)的方式培養(yǎng)人乳癌細胞(MDA-MB-468，ATCC)。將在50yl無血清培養(yǎng)基中的1X106個細胞與50yl生長因子減少的基質(zhì)膠（BDBiosciences(FranklinLakes，NewJerseyUSA)的產(chǎn)品）混合在一起。通過使用23G針，將細胞皮下注射至每個小鼠的肩胛之間。使用電子數(shù)字測徑器(精確至0.0011^此〇7〇(如口&11)的產(chǎn)品）每周測量兩次腫瘤，使用下式計算平均腫瘤體積:長度(mm)X寬度2(mm)X0.5=體積(mm3)。[0195]當腫瘤體積達到170mm3至200mm3之間時，開始各種治療，將小鼠隨機分成兩個不同的組，每組8只。對照組1接受無菌生理鹽水，而實驗組2接受EeFM、細胞siRNA-KSP(109)，每周四次。[0196]如圖3所示，EGFM、細胞slRNA-KSP與生理鹽水對照相比提供了高度顯著的抗腫瘤效果。結(jié)果證實，（a)siRNA在體內(nèi)小細胞內(nèi)是穩(wěn)定的，（b)完整的且完全有功能的siRNA被遞送至體內(nèi)的腫瘤細胞，和(c)小細胞將治療上有意義濃度的siRNA遞送至體內(nèi)腫瘤細胞。[0197]5.通過使用包裹有調(diào)節(jié)性RNA的小細胞治療、隨后用包裹有藥物的小細胞治療來證實定制(tailor-made)癌癥療法[0198]大多數(shù)抗癌療法都伴隨抗藥性。調(diào)節(jié)性RNA治療也是這樣，因為如果靶標基因在被調(diào)節(jié)性RNA靶定的序列內(nèi)突變的話，腫瘤細胞中的基因突變可使調(diào)節(jié)性RNA失效。[0199]之前沒有解決在癌癥患者體內(nèi)的抗藥性的有效策略。取而代之的是，必須服用新藥物以避開突變。但是，這種方法面臨嚴重困難，因為多數(shù)抗癌藥是高度有毒的，而組合療法增大了該毒性，導(dǎo)致當患者不再能對抗毒性時限制治療的劑量和經(jīng)常發(fā)生放棄治療。進行以下研究是為了評估包裹有調(diào)節(jié)性RNA的小細胞在解決這種抗藥性方面的功效。[0200]如上所述，純化小細胞并包裹（109)抗KSP或抗PlklsiRNA。同樣如前所述，制備雙特異性抗體（攜帶抗鼠傷寒沙門〇-抗原特異性和抗人EGFR特異性），并將其附著至小細胞siRNA-KSP以產(chǎn)生EGFR小細胞siRNA-KSP。[0201]如在實施例3中所述，在裸鼠中建立人結(jié)腸癌(HCT116;ATCC)異種移植物，并在體內(nèi)按如下方式處理:組1小鼠接受無菌生理鹽水，組2、組3和組4小鼠的最初10次劑量(見圖4)分別使用109個￡<；?小細胞siRNA-Plkl、EGFR小細胞siRNA-KSP-1和￡(；?小細胞siRNA-KSP-2來處理。Plkl序列和KSP-1序列顯示在以上實施例中。siRNA-KSP-2(正義鏈:5'CTGAAGACCTGAAGACAAT3'）靶定KSPmRNA的不同片段。第33天后，組2、組3和組4的小鼠使用兩份劑量的EGFM、細胞咖處理。[0202]結(jié)果顯示（圖4)，第26天后，腫瘤變得對siRNA治療有抗性。因此，組2、組3和組4小鼠的后續(xù)四次劑量使用以相等數(shù)量組合的所有三份劑量（EG?小細胞SlRNA-Plkl+EGFR小細胞siRNA-KSP-l+EGFR小細胞siRNA-KSP-2)處理（即，每種小細胞類型為~3X108個）。另外，至第33天，腫瘤對所有siRNA都具有高度抗性（圖4)。服用EeFM、細胞咖后，組3和組4小鼠的腫瘤生長顯著放緩。服用_小細胞微后，組3小鼠顯示出腫瘤體積的顯著退化。[0203]這些數(shù)據(jù)顯示，根據(jù)本發(fā)明，抗藥性腫瘤細胞可在體內(nèi)被有效地的處理。特別地，(1)連續(xù)服用攜帶被設(shè)計用來顯著減小腫瘤重量(burden)的調(diào)節(jié)性RNA序列的靶定小細胞后，當腫瘤細胞對siRNA介導(dǎo)的抗腫瘤效果變得有抗性時，（2)服用攜帶的藥物的靶定小細胞，該藥物并不作用于由調(diào)節(jié)性RNA靶定的相同蛋白質(zhì)。[0204]6.靶向遞送被包裹在完整小細胞內(nèi)的治療有效量的調(diào)節(jié)性RNA后，腫瘤細胞靶定蛋白質(zhì)擊倒和所導(dǎo)致的細胞生長停滯的證實[0205]為證實本發(fā)明的方法將治療上有效量的調(diào)節(jié)性RNA包裹在完整的小細胞中，需要證實雙特異性抗體靶定的、包裹有調(diào)節(jié)性RNA的小細胞可以有效率地且有效地引起腫瘤細胞生長停滯和誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡。[0206]在95%空氣和5%⑶2的潮濕氣氛中，在37°C，在補充有5%小牛血清和谷酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中，以組織培養(yǎng)的方式培養(yǎng)人結(jié)腸上皮癌細胞(HCT116)。如上所述，純化小細胞并使用抗Plkl或KSP的siRNA包裹，并將其附著至攜帶抗鼠傷寒沙門0-抗原特異性和抗人EGFR特異性的BsAb上。因此，由小細胞siRNA-KSP、小細胞siRNA-Plkl和小細胞（對照）產(chǎn)生了EeFM、細胞siRNA-KSP、EeFM、細胞siRNA-Plkl和EeFM、細胞。HCT116細胞被接種在6孔平板中，以5000個小細胞：1個HCT116細胞的比率轉(zhuǎn)染實驗組和對照組。該實施例還包括額外的只有細胞的對照組。[0207]在用小細胞培育2個小時后，使用新鮮的roS將孔洗滌三次。在轉(zhuǎn)染后的4小時、8小時、16小時、24小時、32小時和48小時的時候收集孔內(nèi)細胞，將細胞在冷的70%乙醇中固定，并在4°C培育30分鐘。在磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH7.8)中將細胞洗滌兩次，并使用100mg/ml的RNA酶處理，以保證只有DNA被染色。使用碘化丙啶（核酸染料）染色細胞，隨后使用FACSCalibur?流式細胞儀（BectonDickinson(FranklinLakes，NewJerseyUSA)的產(chǎn)品，MacquarieUniversity(Sydney，Australia))和CELLQuest獲得和分析軟件（同樣是BectonDickinson產(chǎn)品）分析。[0208]細胞的FACS分析顯示，轉(zhuǎn)染后4小時和8小時（圖5A)，使用EGFM、細胞siRNA-KSP或EGFM、細胞siRNA-pm#理的細胞的特點在于強健的(robust)G2細胞周期停滯。對照細胞(只有細胞或使用EGFM、細胞處理的細胞)未顯示出不利效果。這些細胞顯示出細胞周期的正常G1期、S期和62期。至16小時和24小時，實驗細胞不僅顯示出強健的G2停滯，還顯示出大量的凋亡細胞（圖6)。至32小時和48小時，實驗組的大多數(shù)細胞凋亡且已變成細胞殘骸(參見，特別是圖7中的括號處）。[0209]這些結(jié)果證實，被靶定的完整小細胞被包裹有治療上有效量的調(diào)節(jié)性RNA，并且本發(fā)明的小細胞在腫瘤細胞中的靶定蛋白質(zhì)擊倒方面高度有效率且顯著有效，導(dǎo)致凋亡性細胞死亡。[0210]引用的公開文獻[0211]Barr，F(xiàn)?A?，Si11je，H?H?，andNigg,E.A.Polo1ikekinasesandtheorchestrationofcelldivision.Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.5:429-40(2004).[0212]Batra,R.K.,ffang-Johanning,F.,ffagner,E.,Garver,R.I.Jr.,Curiel,D.T.[0213]Receptor-mediatedgenedeliveryemployinglectin-bindingspecificity.GeneTher.1:255~260(1994).[0214]Becker,CM.,Farnebo,F.A.,Iordanescu,I.,Behonick,D.J.,Shih,M.C,Dunning,P.,Christofferson,R.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所述共培育是在約37°C的溫度下進行的。36.如權(quán)利要求29至35任一項所述的方法，其中所述共培育包含約107、108、109、101Q、10n、1012或1013個小細胞。37.-種將功能性核酸遞送至靶標哺乳動物細胞的方法，其包括：(a)提供在藥學(xué)上可接受的載體中的多個完整的小細胞，所述多個完整的小細胞中的每個小細胞包含無質(zhì)粒的功能性核酸，和(b)將所述多個小細胞與所述靶標哺乳動物細胞接觸，使得所述哺乳動物細胞吞噬所述多個小細胞，從而使所述功能性核酸被釋放進入所述哺乳動物細胞的細胞質(zhì)中。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述功能性核酸是調(diào)節(jié)性RNA或DNA。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)性RNA選自siRNA、miRNA、shRNA、反義ssRNA、核酶和誘殺RNA。40.如權(quán)利要求37至39任一項所述的方法，其中所述多個小細胞的至少一部分包含治療上有效量的所述功能性核酸。41.如權(quán)利要求37至40任一項所述的方法，其中，所述功能性核酸革E1定選自以下的轉(zhuǎn)錄體：(a)編碼有助于抗藥性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體；(b)P-糖蛋白、MDR-2或MDR-3的轉(zhuǎn)錄體；(c)MRP2、BCR-ABL、STI-571耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥相關(guān)蛋白、環(huán)氧酶-2、核因子κ、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突變的β-微管蛋白或生長因子的轉(zhuǎn)錄體；(d)有助于抗凋亡性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體；(e)Be1-2、Be1-XL、A1/Bf11、黏著斑激酶或p53蛋白的轉(zhuǎn)錄體；(f)有助于瘤生成的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體;和(g)P_聯(lián)蛋白、？隊-<1、(：-1^卩、1(-1^18、0?97〇63(1框1?祖解旋酶、。(^1、0匪1'1、卩1^1?、(：-5&、53BPI、聚梳家族蛋白EZH2、ErbBl、HPV-16E5和E7、Fortilin&MCIlP、DIP13α、KSP、MBD2、p21、KLF4、tpt/TCTP、SPKl&SPK2、P300、PLKl、Trp53、Ras、ErbBl、VEGF或BAG-l的轉(zhuǎn)錄體。42.如權(quán)利要求37至41任一項所述的方法，其進一步包含步驟(c):將藥物遞送至所述靶標哺乳動物細胞。43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述功能性核酸靶定有助于抗所述藥物的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體。44.如權(quán)利要求42或43所述的方法，其中所述藥物被包裹在完整的小細胞內(nèi)。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述功能性核酸和所述藥物被包裹在相同的小細胞內(nèi)。46.如權(quán)利要求42至45任一項所述的方法，其中：(a)步驟(c)發(fā)生在步驟(a)和步驟(b)之后;或(b)遞送所述藥物與步驟(b)是同時發(fā)生的。47.如權(quán)利要求37至46任一項所述的方法，其中步驟(b)包括將雙特異性配體與所述完整的小細胞中的至少一些小細胞和所述靶標哺乳動物細胞接觸，使得所述雙特異性配體導(dǎo)致小細胞結(jié)合至所述哺乳動物細胞。48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述靶標哺乳動物細胞是非噬菌性細胞。49.如權(quán)利要求47或48所述的方法，其中所述雙特異性配體包含：(a)攜帶對小細胞表面結(jié)構(gòu)特異性的第一個臂，其中所述小細胞表面結(jié)構(gòu)是在所述小細胞表面上的脂多糖的〇-多糖成分;和(b)攜帶對非噬菌性哺乳動物細胞表面受體特異性的第二個臂。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述哺乳動物細胞表面受體能夠激活所述小細胞的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。51.如權(quán)利要求47至50任一項所述的方法，其中所述雙特異性配體包含抗體或抗體片段。52.如權(quán)利要求49至51任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞具有噬菌或內(nèi)吞的功能?！疚臋n編號】C12N15/113GK105854029SQ201610277472【公開日】2016年8月17日【申請日】2008年3月26日【發(fā)明人】希曼休·布蘭巴特,珍妮弗·麥克迪爾米德,托比·哈爾夫【申請人】因詹尼克分子遞送控股有限公司