專利名稱:燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及一種經(jīng)發(fā)酵能夠產(chǎn)生抗腫瘤及具有治療人類心腦血管疾病藥用成份的微生物。
燈盞細(xì)辛為菊科植物短葶飛蓬的全草。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為它有散寒解表、止痛舒絡(luò)、活血治癱瘓的功效。臨床用于治療腦血栓形成、腦栓塞、多發(fā)性神經(jīng)炎、慢性蛛網(wǎng)膜炎等腦血管意外所致的癱瘓,效果十分顯著,主要藥用成分為燈盞花乙素。目前由于燈盞花素的來(lái)源主要是從植物中提取獲得,而以其它方式的獲得途徑尚有待于研究。
本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)發(fā)酵能夠產(chǎn)生抗腫瘤及具有治療人類心腦血管疾病藥用成份的微生物——燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌。
本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌命名為交鏈孢霉(Alternaria sp.),保藏登記號(hào)為CCTCC NOM201028。
本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌是從短葶飛蓬[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz]菊科植物活體中采用內(nèi)生真菌微生物分離技術(shù)分離獲得的,經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定為交鏈孢霉Alternaris sp.,該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位保藏,保藏日期2001年7月27日,保藏登記號(hào)為CCTCC NOM201028。
本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌的固體培養(yǎng)特征為一、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天,菌落直徑47mm,7天75mm,11天90mm。菌落鋪展較疏松,灰黑色絮狀,邊緣整齊,背面黑色;二、麥芽法培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天,菌落直徑45mm,7天75mm,11天90mm。菌落隆起較疏松,邊緣整齊,黃灰褐色絨絮狀,背面黑色;三、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天,菌落直徑33mm,7天70mm,11天mm 90mm。菌落疏松扁平,黃褐色長(zhǎng)絨狀,邊緣整齊,背面肉褐色。
本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)特征為
一、培養(yǎng)基PDA,搖瓶培養(yǎng)時(shí)間5天,培養(yǎng)溫度28℃±2℃;二、發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天,菌種有零星的自色菌絲點(diǎn);培養(yǎng)第2天,長(zhǎng)滿白色菌絲;培養(yǎng)第3天,發(fā)酵液菌絲體密集,菌絲體呈淡褐色;培養(yǎng)第4天,長(zhǎng)滿深黑褐色菌絲體,發(fā)酵液粘稠,培養(yǎng)第5天,發(fā)酵液菌絲體密集成塊狀,黑褐色菌絲體。
形態(tài)特征一、無(wú)性世代,菌絲橄欖褐色有隔,分生孢子梗分化明顯,分枝淡褐色,分生孢子聚為分枝的鏈,倒梨形或卵形,縱橫分隔,具短喙,淡褐至金黃褐色,光滑,孢子直徑10.0~13.75×25.0~43.75微米。
二、有性世代,未發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌菌株18SRNA堿基組成系列CTAAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACCGGGAAANCTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTGGATAGTACCTTACTNACTNGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCCCAANCTTCGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTNTCTTGGTGATTCATGATAACTTCACGGATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGANCGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAGGTATTGGCNTTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGNGGAGCCTGAGAAACGGTTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAANTTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGNCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTCCAATTTAAACCTCTTAACGANN本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌,經(jīng)發(fā)酵可獲得異香豆素化合物及黃酮類化合物,其工藝步驟為菌種→試管斜面→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→發(fā)酵物提取→分離化合物→有效成分。
其中,發(fā)酵原料為馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA),發(fā)酵方式為液態(tài)發(fā)酵;菌種斜面試管斜面菌種培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(固體PDA);種子培養(yǎng)為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(液體PDA);發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA),PH自然,培養(yǎng)時(shí)間試管斜面菌種活化培養(yǎng)96小時(shí),種子搖床培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí),發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5天,培養(yǎng)溫度試管斜面菌種培養(yǎng)溫度28℃±1℃種子搖床培養(yǎng)28℃±1℃溫度,發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃±2℃;發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢,收集發(fā)酵液,按常規(guī)化學(xué)提取方法,采用95%乙醇4分級(jí)提取黃酮類化合物,采用三氯甲烷、丙酮溶系統(tǒng)提取異香素類化合物;分離化合物采用硅膠柱層析方法分離純化獲得燈盞花乙素;采用葡聚糖凝膠柱層析方法分離純化獲得異香豆素類化合物。
本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌,該菌株最顯著的特征是該菌株液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生抗心血管疾病的臨床有效成分燈盞花乙素及黃酮類化合物,能夠產(chǎn)生抗腫瘤的藥用成分異香豆素化合物,如鏈格孢菌素(Alternariol)、鏈格孢醇甲基醚(Alternariol Monomethyl Ether)等,是尋找具有抗腫瘤和治療人類心腦血管疾病藥用成份生物資源的重要微生物。
圖1為本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌菌絲體用400倍顯微鏡觀察到的形態(tài)圖。
圖2為本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌分生孢子用400倍顯微鏡觀察到的形態(tài)圖。
圖3為本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌菌株細(xì)微結(jié)構(gòu)圖(菌絲體電子顯微鏡圖片,放大倍數(shù)33000倍)。
圖4為本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌菌株細(xì)微結(jié)構(gòu)圖(電子顯微鏡圖片,放大倍數(shù)16000倍)。
實(shí)施例取編號(hào)為YM31961菌種,在無(wú)菌條件下(無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)),用接種針挑取少許菌種,轉(zhuǎn)接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(18×180mm)中,置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃活化培養(yǎng)96小時(shí)。
取出活化96小時(shí)的菌種,在無(wú)菌條件下,以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的種子液體PDA培養(yǎng)基中,在28℃±1℃下?lián)u床培養(yǎng)72小時(shí),即為YM31961種子。
發(fā)酵采用500毫升玻璃三角瓶,裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基100毫升,15磅滅菌30分鐘后,取出待冷卻至30℃在無(wú)菌條件下,取YM31961種子,接種子裝有100毫升液體PDA培養(yǎng)基的500毫升玻璃三角瓶中,種子接種量為5~10%(28℃±2℃轉(zhuǎn)到通氣培養(yǎng)5天。在發(fā)酵期間,注意發(fā)酵室溫度變化,檢查有無(wú)染菌現(xiàn)象。
發(fā)酵完畢,收集發(fā)酵物,裝入一定體積的容器內(nèi),按常規(guī)化學(xué)分離提取方法,采用95%乙醇分級(jí)萃取黃酮類化合物,硅膠柱層析方法分離純化可得到燈盞花乙素。采用三氯甲烷、丙酮溶劑系統(tǒng)提取異香豆素類化合物,葡聚糖凝膠柱層析方法分離純化可得到鏈格孢菌素及鏈格孢醇甲基醚。
權(quán)利要求
1.一種燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌,其特征在于命名為交鏈孢霉(Alternaria sp.),其保藏登記號(hào)為CCTCC NOM201028。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌,其特征在于所述的固體培養(yǎng)特征為一、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天,菌落直徑47mm,7天75mm,11天90mm。菌落鋪展較疏松,灰黑色絮狀,邊緣整齊,背面黑色;二、麥芽法培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天,菌落直徑45mm,7天75mm,11天90mm。菌落隆起較疏松,邊緣整齊,黃灰褐色絨絮狀,背面黑色;三、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天,菌落直徑33mm,7天70mm,11天mm 90mm。菌落疏松扁平,黃褐色長(zhǎng)絨狀,邊緣整齊,背面肉褐色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌,其特征在于所述的的液體培養(yǎng)特征為一、培養(yǎng)基PDA,搖瓶培養(yǎng)時(shí)間5天,培養(yǎng)溫度28℃±2℃;二、發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天,菌種有零星的白色菌絲點(diǎn);培養(yǎng)第2天,長(zhǎng)滿白色菌絲;培養(yǎng)第3天,發(fā)酵液菌絲體密集,菌絲體呈淡褐色;培養(yǎng)第4天,長(zhǎng)滿深黑褐色菌絲體,發(fā)酵液粘稠,培養(yǎng)第5天,發(fā)酵液菌絲體密集成塊狀,黑褐色菌絲體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌,其特征在于所述的形態(tài)特征一、無(wú)性世代,菌絲橄欖褐色有隔,分生孢子梗分化明顯,分枝淡褐色,分生孢子聚為分枝的鏈,倒梨形或卵形,縱橫分隔,具短喙,淡褐至金黃褐色,光滑,孢子直徑10.0~13.75×25.0~43.75微米。二、有性世代,未發(fā)現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌,其特征在于年述的菌株18SRNA堿基組成系列CTAAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACCGGGAAANCTGCGAATGGCTCATTAATCAGTTATCGTTTATTGGATAGTACCTTACTNACTNGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCCCAANCTTCGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTNTCTTGGTGATTCATGATAACTTCACGGATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGANCGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAGGTATTGGCNTTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGNGGAGCCTGAGAAACGGTTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAANTTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGNCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTCCAATTTAAACCTCTTAACGANN
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域,本發(fā)明所述的燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌是從短葶飛蓬菊科植物活體中采用內(nèi)生真菌微生物分離技術(shù)分離獲得的,經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定為交鏈孢霉,該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位保藏,保藏日期2001年7月27日,保藏登記號(hào)為CCTCC NOM201028。本發(fā)明最顯著的特征是該菌株液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生抗心血管疾病的臨床有效成分燈盞花乙素及黃酮類化合物,能夠產(chǎn)生抗腫瘤的藥用成分異香豆素化合物,是尋找具有抗腫瘤和治療人類心腦血管疾病藥用成份生物資源的重要微生物。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1421522SQ0113997
公開(kāi)日2003年6月4日 申請(qǐng)日期2001年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者陳有為, 楊麗源, 李紹蘭, 李治瀅, 周斌, 張琦 申請(qǐng)人:云南省微生物研究所