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一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的制備方法

文檔序號(hào):578467閱讀:366來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種制備重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhHGF)的生產(chǎn)工藝。該工藝是通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)相結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)體系表達(dá)產(chǎn)生真核基因產(chǎn)物的一種新方法,應(yīng)用該工藝可以大量制備rhHGF。
為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用了以下技術(shù)路線和步驟進(jìn)行一、技術(shù)路線(圖1)1.hHGFα、hHGFβ基因的獲??;2.pBV220-hHGFα、pBV220-hHGFβ重組質(zhì)粒的構(gòu)建;3.hHGFα、hHGFβ重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到不同的大腸桿菌內(nèi);4.hHGFα和hHGFβ蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化;5.異源蛋白體外共復(fù)性和活性測(cè)定。
二、步驟1.hHGFα和hHGFβ原核表達(dá)體系的構(gòu)建1).HGF基因結(jié)構(gòu)分析從GENBANK獲取HGFcDNA全序列,其序列為1 actgactccg aacaggattc tttcacccag gcatctcctc cagagggatccgccagcccg61 tccagcagca ccgattgggt gaccaaactc ctgccagccc tgctgctgcagcatgtcctc121 ctgcatctcc tcctgctccc catcgccatc ccctatgcag agggacaaaggaaaagaaga181 aatacaattc atgaattcaa aaaatcagca aagactaccc taatcaaaatagatccagca241 ctgaagataa aaaccaaaaa agtgaatact gcagaccaat gtgctaatagatgtactagg301 aataaaggac ttccattcac ttgcaaggct tttgtttttg ataaagcaagaaaacaatgc361 ctctggttcc ccttcaatag catgtcaagt ggagtgaaaa aagaatttggccatgaattt421 gacctctatg aaaacaaaga ctacattaga aactgcatca ttggtaaaggacgcagctac481 aagggaacag tatctatcac taagagtggc atcaaatgtc agccctggagttccatgata541 ccacacgaac acagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctacaggaaaactac601 tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaatccagaggta661 cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgacctgcaatggg721 gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca agatttgtcagcgctgggat781 catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat atcccgacaagggctttgat841 gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat ggtgctatactcttgaccct901 cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg acaatactatgaatgacact961 gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggctacaggggcact1021 gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg attctcagtatcctcacgag1081 catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac gagaaaattactgccgaaat1141 ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccgagttggctac1201 tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcgtgggaatggc1261 aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttcaatgtgggac1321 aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaagtaagctgaat1381 gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgctacacgggaaat1441 ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgataccacacctaca1501 atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaattgcgagttgta1561 aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta gtttgagatacagaaataaa1621 catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc ttactgcacgacagtgtttc1681 ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgtccacggaaga1741 ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc tggtatatggccctgaagga1801 tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattttgttagtacg1861 attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcagtgtttatggc1921 tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac gagtggcacatctctatata1981 atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaatgagtctgaa2041 atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg agggggattatggtggccca2101 cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcctggtcgtgga2161 tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag catattatgcaaaatggata2221 cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatagc tgaagtaagtgtgtctgaag2281 cacccaccaa tacaactgtc ttttac2).hHGFα原核表達(dá)體系的構(gòu)建a.根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的要求和hHGFα基因序列分析結(jié)果,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,上游引物是5’-ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA-3’下游引物是5’-ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTCTTTCG-3’上游引物長(zhǎng)度為27個(gè)核苷酸,含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)、起始密碼ATG及與編碼HGF的N末端基因相同的18個(gè)核苷酸;下游引物長(zhǎng)度為29個(gè)核苷酸,含有終止密碼子、BamHI識(shí)別位點(diǎn)及與編碼HGF的C末端基因互補(bǔ)的20個(gè)核苷酸。以pRC/CMV-HGF(由美國(guó)著名科學(xué)家閆占清饋贈(zèng))為模板,通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),擴(kuò)增得到了去除N端54肽前體序列(包括信號(hào)肽在內(nèi)),并加上起始密碼ATG、串聯(lián)終止密碼TAA、TGA及適于克隆和表達(dá)的酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI的hHGFαcDNA(1.34bp)。
b.將hHGFαcDNA基因片段以Xho1切為386bp、954bp兩個(gè)片段,分別以EcoRI/XhoI、XhoI/BamHI重組到克隆載體pBSKS(全長(zhǎng)2.96kb,由本室保存)上,形成pBSKS-HGF386、pBSKS-HGF954兩個(gè)亞克隆重組質(zhì)粒(圖2);將EcoRI/XhoI、XhoI/BamHI從pBSKS-HGF386、pBSKS-HGF954中酶切回收的EcoRI-XhoI(386bp)、XhoI-BamHI(954bp)兩個(gè)片段與表達(dá)載體pBV220連接克隆,經(jīng)篩選、酶切分析、克隆片段全序列測(cè)定證實(shí),正確構(gòu)建了pBV220-hHGFα重組表達(dá)質(zhì)粒(圖3)。
hHGFα的基因序列為1 actgactccg aacaggattc tttcacccag gcatctcctc cagagggatccgccagcccg61 tccagcagca ccatgtgggt gaccaaactc ctgccagccc tgctgctgcagcatgtcctc121 ctgcatctcc tcctgctccc catcgccatc ccctatgcag agggacaaaggaaaagaaga181 aatacaattc atgaattcaa aaaatcagca aagactaccc taatcaaaataga tccagca241 ctgaagataa aaaccaaaaa agtgaatact gcagaccaat gtgctaatagatgtactagg301 aataaaggac ttccattcac ttgcaaggct tttgtttttg ataaagcaagaaaacaatgc361 ctctggttcc ccttcaatag catgtcaagt ggagtgaaaa aagaatttggccatgaattt421 gacctctatg aaaacaaaga ctacattaga aactgcatca ttggtaaaggacgcagctac481 aagggaacag tatctatcac taagagtggc atcaaatgtc agccctggagttccatgata541 ccacacgaac acagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctacaggaaaactac601 tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaatccagaggta661 cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgacctgcaatggg721 gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca agatttgtcagcgctgggat781 catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat atcccgacaagggctttgat841 gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat ggtgctatactcttgaccct901 cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg acaatactatgaatgacact961 gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggctacaggggcact1021 gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg attctcagtatcctcacgag1081 catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac gagaaaattactgccgaaat1141 ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccgagt tggctac1201 tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcgtgggaatggc1261 aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttcaatgtgggac1321 aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaagtaagctgaat1381 gagaattact gccgaAatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgctacacgggaaat1441 ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgataccacacctaca1501 atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaac3).hHGFβ原核表達(dá)體系的構(gòu)建a.根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的要求和hHGFβ基因序列分析結(jié)果,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,上游引物是5’-CATACCCGGGATGGTTGTAAATGGGATTC-3’
下游引物是5’-ACATCTGCAGCTTCAGCTATGACTGT-3’上游引物含有SmaI識(shí)別位點(diǎn)和起始密碼子,下游引物含有PstI識(shí)別位點(diǎn)和終止密碼子。以pRC/CMV-HGF為模板,經(jīng)過(guò)PCR后,擴(kuò)增得到了含有翻譯起始密碼子ATG和SD序列及SD序列間隔,加上SmaI和PstI酶切位點(diǎn)的hHGFβcDNA(700bp)。
b.利用SmaI和PstI的酶切位點(diǎn)將hHGFβcDNA定向克隆到pBV220表達(dá)載體上,經(jīng)過(guò)篩選、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和hHGFβ基因可表達(dá)全序列測(cè)序后,正確構(gòu)建了pBV220-hHGFβ(圖4)。HGF-β的基因序列為1 gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt gagatacaga61 aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag121 tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac181 ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt atatggccct241 gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga tgattttgtt301 agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag ttgcagtgtt361 tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt ggcacatctc421 tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac tctgaatgag481 tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg ggattatggt541 ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt601 cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata ttatgcaaaa661 tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag1.hHGFα和hHGFβ蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化1)hHGFα蛋白質(zhì)的表達(dá)將構(gòu)建正確的pBV220-hHGFα重組表達(dá)質(zhì)粒用氯化鈣等轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α(來(lái)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)中。10L發(fā)酵罐裝料7L,菌種接種量2-4%(V/V),采用改良的M9+LB培養(yǎng)基(以M9+LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ),經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)出的最適細(xì)菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基),用溫控誘導(dǎo)表達(dá)的方法,培養(yǎng)溫度30℃,誘導(dǎo)溫度42℃,讓陽(yáng)性克隆菌株DH5α-hHGFα表達(dá)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子重鏈蛋白,SDS-PAGE(10%)分析表達(dá)產(chǎn)物。
2)HGFβ蛋白質(zhì)的表達(dá)將正確構(gòu)建的pBV220-hHGFβ轉(zhuǎn)化到大腸桿菌pLysS菌株(來(lái)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)內(nèi),用1)中a的方法,讓pLysS-hHGFβ表達(dá)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子輕鏈蛋白,SDS-PAGE(12%)分析表達(dá)產(chǎn)物。
3)hHGFα和hHGFβ蛋白質(zhì)的分離純化人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子hHGFα和hHGFβ在大腸桿菌中以包涵體的形式存在,其分離純化大致上采取先分離包涵體,將菌體懸于Tris緩沖液中,加入溶菌酶,消化,冰浴超聲破菌,加入脫氧膽酸鈉,離心取沉淀得到包涵體,將沉淀充分重懸于變性液尿素緩沖液中,靜置,離心棄上清。用尿素的緩沖液洗滌沉淀,直到上清無(wú)明顯變化為止。最后,將包涵體沉淀溶于含尿素緩沖液中,離心,回收包涵體溶解液上清,再用凝膠過(guò)濾層析法做進(jìn)一步純化,分部收集洗脫峰,SDS-PAGE鑒定目的蛋白所在峰。
3.異源蛋白體外共復(fù)性及活性測(cè)定1).人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子重鏈和輕鏈蛋白的體外共復(fù)性由于包涵體蛋白的空間結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤,沒(méi)有生物學(xué)活性,必須為其提供一定的氧化還原環(huán)境,讓兩種蛋白質(zhì)之間形成正確的二硫鍵和空間結(jié)構(gòu)。本發(fā)明采用梯度稀釋的方法,將目的峰中蛋白質(zhì)濃度調(diào)至1mg/mL,然后調(diào)整rhHGF-α蛋白與用類似方法分離純化的rhHGF-β蛋白的摩爾比為1∶1,每隔20min用含有1~3mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)和0.1~0.3mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)的20~50mmol/L Tris-Cl,pH 8.0的復(fù)性液,將尿素濃度逐步降低到1mol/L,然后在20~50mmol/L Tris-Cl、pH 8.0的透析液中4℃充分透析。將透析后的共復(fù)性樣品經(jīng)過(guò)離子交換層析純化。
2).生物活性測(cè)定a.分離的肝細(xì)胞懸浮于含10%小牛血清、青霉素(104U/L)、鏈霉素(100mg/L)、胰島素(10-8mol/L)的DMEM中,按每孔細(xì)胞數(shù)2×104接種于96孔培養(yǎng)板,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。
b.肝細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
c.rhHGF樣品準(zhǔn)備復(fù)性的HGF樣品根據(jù)測(cè)算用DMEM稀釋成蛋白濃度為200ng/ml,與培養(yǎng)液混合后倍比稀釋成100ng/ml、50ng/ml。
d.將肝細(xì)胞培養(yǎng)液更換成無(wú)血清、含不同濃度rhHGF樣品的DMEM培養(yǎng)液,陰性對(duì)照孔不加HGF樣品。細(xì)胞在5%CO2,37℃飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)。
e.向培養(yǎng)的肝細(xì)胞中加入5mg/ml MTT(四甲基偶氮唑鹽)顯色液10μ1,繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí),然后棄去培養(yǎng)液,再加入100μl DMSO終止反應(yīng)并溶解細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色結(jié)晶,用空白孔(不含肝細(xì)胞及HGF樣品的培養(yǎng)液)調(diào)零,570nm波長(zhǎng)比色,得出在不同復(fù)性HGF濃度下刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)的OD值。
f.以復(fù)性的HGF樣品的蛋白濃度為橫坐標(biāo),OD570nm比色值為縱坐標(biāo),作二者之間關(guān)系變化的直方圖(圖5)。
分 組 OD570nm陰性對(duì)照組 0.29±0.0550ng/ml0.72±0.07100ng/ml 0.91±0.10200ng/ml 0.98±0.03重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhHGF)是一種能有效促進(jìn)肝細(xì)胞損傷后有序再生的重要細(xì)胞因子。它在肝炎、肝硬化、肝癌等肝損傷的修復(fù)中起到不可替代的作用。目前市場(chǎng)尚無(wú)此類作用藥物。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多科研機(jī)構(gòu)都致力于HGF的開(kāi)發(fā)和研制,但由于受到來(lái)源和相關(guān)技術(shù)的限制,一直未能投入生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于用基因工程的方法并首次將蛋白質(zhì)工程技術(shù)和基因工程技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于rhHGF生產(chǎn),建立了一條體外大量獲得rhHGF的途徑,對(duì)于治療多種原因引起的肝細(xì)胞壞死、肝硬化、肝癌以及其它損傷具有重要的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景,對(duì)于研究肝細(xì)胞分化和增殖調(diào)控、肝癌等腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有著重要意義,同時(shí)為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)基因工程藥物提供了一種新思路和新方法。


圖1重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhHGF)制備技術(shù)路線圖2PBSKS-HGF386、PBSKS-HGF954亞克隆質(zhì)粒的構(gòu)建示意3表達(dá)質(zhì)粒的pBV220-hHGFα構(gòu)建示意4表達(dá)質(zhì)粒的pBV220-hHGFβ構(gòu)建示意5用MTT法測(cè)定的復(fù)性HGF的活性圖6rhHGFα凝膠過(guò)濾色譜7rhHGFβ凝膠過(guò)濾色譜圖序列表<110>協(xié)和生物工程研究所有限公司<120>一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的制備方法<160>3<210>1<211>2306<212>DNA<213>人種(human)<220><221>gene<400>11 actgactccg aacaggattc tttcacccag gcatctcctc cagagggatc cgccagcccg61 tccagcagca ccgattgggt gaccaaactc ctgccagccc tgctgctgca gcatgtcctc121 ctgcatctcc tcctgctccc catcgccatc ccctatgcag agggacaaag gaaaagaaga181 aatacaattc atgaattcaa aaaatcagca aagactaccc taatcaaaat agatccagca241 ctgaagataa aaaccaaaaa agtgaatact gcagaccaat gtgctaatag atgtactagg301 aataaaggac ttccattcac ttgcaaggct tttgtttttg ataaagcaag aaaacaatgc361 ctctggttcc ccttcaatag catgtcaagt ggagtgaaaa aagaatttgg ccatgaattt421 gacctctatg aaaacaaaga ctacattaga aactgcatca ttggtaaagg acgcagctac481 aagggaacag tatctatcac taagagtggc atcaaatgtc agccctggag ttccatgata541 ccacacgaac acagcttttt gccttcgagc 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權(quán)利要求
1.一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhHGF)的制備方法,其特征在于所述方法是將基因工程技術(shù)與蛋白質(zhì)工程技術(shù)相結(jié)合,對(duì)HGF基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄前加工、修飾,分別構(gòu)建HGF重鏈(α鏈)表達(dá)體系和HGF輕鏈(β鏈)表達(dá)體系,分別表達(dá)HGF的重鏈蛋白和輕鏈蛋白,然后利用異源蛋白體外共復(fù)性技術(shù),制備有野生活性的HGF蛋白。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征是hHGFα原核表達(dá)體系的構(gòu)建采取以下步驟A)根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的要求和hHGF基因序列分析結(jié)果,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,以HGF為模板,通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),擴(kuò)增得到相應(yīng)序列并加上起始密碼ATG、串聯(lián)終止密碼TAA、TGA及適于克隆和表達(dá)的酶切位點(diǎn)的hHGFαcDNA;B)將hHGFαcDNA基因片段經(jīng)合適的酶切重組到原核表達(dá)克隆載體上,構(gòu)建得到含hHGFα的重組質(zhì)粒。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征是hHGFβ基因表達(dá)體系的構(gòu)建采取以下步驟A)根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的要求和hHGFβ基因序列分析結(jié)果,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,以HGF為模板,經(jīng)過(guò)PCR后,擴(kuò)增得到含有翻譯起始密碼的ATG和SD序列及SD間隔,加上相應(yīng)酶切位點(diǎn)的hHGFβcDNA;B)利用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)將hHGFβcDNA定向克隆到原核表達(dá)載體上,經(jīng)過(guò)篩選、限制性內(nèi)切酶切,構(gòu)建得到含hHGFβ的重組質(zhì)粒。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的制備方法,其特征是hHGFα蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化步驟如下A)將構(gòu)建的含hHGFα重鏈表達(dá)質(zhì)粒用氯化鈣等轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,經(jīng)選用最適細(xì)菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng),經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的方法,表達(dá)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子重鏈蛋白hHGFα,SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物;B)以包涵體形式存在于大腸桿菌中的表達(dá)菌體按一定比例重懸于Tris緩沖液中,加溶菌酶消化,超聲破菌,加脫氧膽酸納,離心取沉淀,將其重懸于尿素緩沖液中,離心棄上清,用含尿素的緩沖液II洗滌沉淀,將沉淀溶于含尿素的緩沖液,離心回收包涵體溶解液上清,用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化,分部收集洗脫峰,SDS-PAGE鑒定目的蛋白所在峰。
5.按照權(quán)利要求1或3所述的制備方法,其特征是hHGFβ蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化步驟如下A)將構(gòu)建的含hHGFβ轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,經(jīng)選用最適細(xì)菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng),用誘導(dǎo)表達(dá)的方法,表達(dá)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子輕鏈蛋白hHGFβ,SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物;B)以包涵體形式存在于大腸桿菌中的hHGFβ蛋白質(zhì)的分離純化步驟如下離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體,加入緩沖液,攪拌,使菌體分散均勻;加蛋白酶抑制劑、溶菌酶,攪拌,加脫氧膽酸納;超聲破菌,低溫高速離心,沉淀中加入Tris溶液,攪拌,低溫離心,沉淀重懸于尿素緩沖液;包涵體按濃度比加入含尿素的變性液中室溫作用,離心沉淀,包涵體溶解液經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化目的蛋白,將純度較高的收集液合并,用于復(fù)性。
6.按照權(quán)利要求1、4或5所述的制備方法,其特征是hHGFα與hHGFβ蛋白的體外共復(fù)性是采用梯度稀釋的方法,將目的峰中蛋白質(zhì)調(diào)至規(guī)定濃度,然后調(diào)整hHGF-α與hHGF-β蛋白的摩爾比,間隙使用含還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)的復(fù)性液,降低尿素的濃度,在透析液中充分透析,將透析后的共復(fù)性樣品經(jīng)離子交換層析純化,最終得到有野生活性的HGF。
全文摘要
重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhHGF)是一種能有效促進(jìn)肝細(xì)胞損傷后有序再生的重要細(xì)胞因子,本發(fā)明涉及其制備生產(chǎn)工藝,它是通過(guò)基因工程技術(shù)與蛋白質(zhì)工程技術(shù)相結(jié)合,對(duì)HGF基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄前加工、修飾,分別構(gòu)建HGF重鏈(α鏈)表達(dá)體系和HGF輕鏈(β鏈)表達(dá)體系,分別表達(dá)HGF重鏈蛋白和輕鏈蛋白,然后利用異源蛋白體外共復(fù)性技術(shù),制備有野生活性的HGF蛋白,本發(fā)明首次將蛋白質(zhì)工程技術(shù)與基因工程技術(shù)結(jié)合用于生產(chǎn)rhHGF,建立了一條體外大量獲得rhHGF的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1385533SQ0114020
公開(kāi)日2002年12月18日 申請(qǐng)日期2001年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月5日
發(fā)明者牛勃, 向前, 解軍, 常冰梅, 楊濤, 楊琦, 張悅紅 申請(qǐng)人:協(xié)和生物工程研究所有限公司
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