血小板源性生長因子受體β檢測試劑盒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及血小板源性生長因子受體β檢測試劑盒及其用途。本發(fā)明的目的是為非肌層侵襲性膀胱癌的預(yù)后分析提供一種新選擇。本發(fā)明的技術(shù)方案是血小板源性生長因子受體β檢測試劑盒，包含能特異識別尿液中腫瘤蛋白標志物血小板源性生長因子受體β的檢測劑和捕捉劑。本發(fā)明的血小板源性生長因子受體β檢測試劑盒將會對臨床判斷膀胱癌患者的預(yù)后具有重要作用，肌層侵襲性膀胱癌的預(yù)后分析提供一種新選擇。
【專利說明】血小板源性生長因子受體β檢測試劑盒及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及血小板源性生長因子受體β檢測試劑盒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]泌尿系統(tǒng)的微環(huán)境情況對于泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生和演進具有重要作用。尿液蛋白能夠反映泌尿系統(tǒng)的微環(huán)境情況，而尿液來源簡單方便無損傷，病人容易接受，無不適感，沒有禁忌癥。因此尿液是一種理想的用于泌尿系統(tǒng)疾病診斷的生物樣品。
[0003]目前臨床上通過檢測尿液的各項生化指標來反映泌尿系統(tǒng)功能的改變，協(xié)助臨床診療。但這些指標是不能對泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生或發(fā)展給予提示。對此，大量的研究集中在尿液中尋找一些疾病相關(guān)蛋白標志物，或能夠早期靈敏地提示泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生并對其預(yù)后提供參考。近年來，有文獻報道了一些蛋白標志物。然而，由于尿液蛋白的來源十分復(fù)雜，并且受環(huán)境飲食等因素影響，生理波動十分巨大，從而導(dǎo)致了這些疾病相關(guān)蛋白標志物由于特異性和穩(wěn)定性等問題都沒有被臨床廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為非肌層侵襲性膀胱癌的預(yù)后分析提供一種新選擇。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是血小板源性生長因子受體β檢測試劑盒，包含能特異識別尿液中腫瘤蛋白標志物I3DGFRB的檢測劑和捕捉劑。
[0006]具體的，所述的捕捉劑為人TOGFRB蛋白抗體。
[0007]進一步的，所述的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或重組抗體。
[0008]具體的，所述的檢測劑為可檢測的標記物。
[0009]進一步的，所述的可檢測的標記物成份包括酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)或放射活性物質(zhì)。
[0010]進一步的，所述的酶是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、beta —半乳糖酶或乙酰膽堿醋酶。
[0011]進一步的，所述的輔基為鏈霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素蛋白。
[0012]進一步的，所述的熒光物質(zhì)為傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸醋、若丹明、丹磺酰氯或藻紅蛋白。
[0013]進一步的，所述的發(fā)光物質(zhì)為發(fā)光氨。
[0014]進一步的，所述的生物發(fā)光物質(zhì)為熒光素酶、熒光素或水母發(fā)光蛋白。
[0015]進一步的，所述的放射活性物質(zhì)為1251、35S、14C、3H或52Mg。
[0016]本發(fā)明還提供了所述試劑盒在非肌層侵襲性膀胱癌預(yù)后分析中的用途。
[0017]上述捕捉劑可以和TOGFRB蛋白分裝，也可以偶聯(lián)。
[0018]本發(fā)明的檢測樣品為非肌層侵襲性膀胱癌患者的尿液；上述檢測試劑盒還含有必要的檢測所需的稀釋試劑或緩沖試劑，及用作診斷標準用途的特定濃度的TOGFRB蛋白標準品。
[0019]上述抗體可通過商業(yè)途徑獲得，還可以通過抗體制備的常規(guī)方法來完成，如通過重組方法制備的杭體，如噬菌體展示抗體，從轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)中分離的抗體，用轉(zhuǎn)入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體，從重組組合抗體文庫中分離的抗體。此外，也可以通過表達和純化上述人源TOGFRB蛋白，用其免疫動物以獲得免疫血清，再用常規(guī)的方法純化血清中的抗體而獲得。
[0020]制備本發(fā)明檢測試劑盒，可以通過市場商業(yè)途徑獲得試劑盒中的捕捉劑、和必要的稀釋緩沖液，其中本發(fā)明的實施例中的捕捉試劑采用的是商業(yè)來源的特異抗體，當然也可以按常規(guī)抗體制備的方法制備得到。上述試劑盒的各組分只需常規(guī)使用，無需特別操作，可以按照各組成試劑使用說明來進行或按照常規(guī)實驗方法操作，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠結(jié)合樣品的特點正確使用檢測試劑盒。
[0021]上述TOGFRB蛋白的識別檢測載體不限于試劑盒的方式，其它檢測載體如蛋白芯片、檢測試紙等也可以被用來檢測上述蛋白標志物。
[0022]上述TOGFRB蛋白具有制備用于非肌層侵襲性膀胱癌預(yù)后分析的特異抗體的用途，利用其特異抗體可以制備用于非肌層侵襲性膀胱癌預(yù)后判斷的試劑盒、蛋白芯片或檢測試紙等檢測產(chǎn)品。
[0023]本發(fā)明通過對大規(guī)模健康人群尿液進行蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)分析、GO分析，腫瘤相關(guān)蛋白間相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗驗證，最終尋找到了 TOGFRB作為非肌層侵襲性膀胱癌復(fù)發(fā)的標志蛋白。本發(fā)明的TOGFRB檢測試劑盒將會對臨床判斷膀胱癌患者的預(yù)后具有重要作用，肌層侵襲性膀胱癌的預(yù)后分析提供一種新選擇，并將產(chǎn)生極大的市場價值。本發(fā)明利用生物化學(xué)試驗來分析非肌層侵襲性膀胱癌患者尿液中的PDGFRB蛋白標志物，達到預(yù)存膀胱癌復(fù)發(fā)可能性的目的，檢測方法獨特，特異性高，因此具有極大的市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為通過蛋白質(zhì)組系統(tǒng)分析健康人群尿液流程圖。其中:HPLC，高效液相色譜；麗，分子量；RP，反相色譜；MS，質(zhì)譜；LC，液相色譜；MARs，高豐度蛋白去除系統(tǒng)；CHIP，微流控芯片；SCX，強陽離子交換.[0025]圖2為選取的鑒定出具有4個以上獨特肽段或10個以上光譜數(shù)據(jù)的592個高豐度蛋白，通過Cytoscape軟件進行BinGOplug-1n分析后,其中373個蛋白標記為細胞外蛋白或胞漿蛋白。
[0026]圖3為上述373個蛋白通過STRING分析繪制出包含有312個節(jié)點，與1779個相互作用的蛋白-蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)。
[0027]圖4 為通過 Cytoscape 及 ClueGO+Cluepediaplug-1n 軟件對 KEGG 數(shù)據(jù)庫中的 6個腫瘤相關(guān)關(guān)鍵詞對上述蛋白-蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)進行分析檢索。
[0028]圖5為通過STRING軟件構(gòu)建的包含15個腫瘤相關(guān)尿蛋白的蛋白_蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)。
[0029]圖6為酶聯(lián)免疫吸附法檢測膀胱癌患者電切術(shù)前及術(shù)后尿液TOGFRB水平。[0030]圖7為術(shù)后3年內(nèi)膀胱復(fù)發(fā)患者和未復(fù)發(fā)患者尿液TOGFRB蛋白水平。
[0031]圖8為TOGFRB作為膀胱癌復(fù)發(fā)的檢測指標的受試者工作曲線(R0C)。
[0032]圖9為TOGFRB結(jié)合患者年齡、腫瘤直徑、癌灶數(shù)量等臨床指標后的受試者工作曲線(ROC)。
【具體實施方式】
[0033]發(fā)明人經(jīng)過對大規(guī)模健康人群尿液樣品進行蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)分析、腫瘤相關(guān)蛋白間相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出 APC，APC2, CDHl，C0L4A1, C0L4A2, C0L4A3, C0L4A6,CSF1R, CTNNA3, EGF, FGFR2, FNl, KLK3, LAMCl 和 PDGFRB 這 15 個尿液中高豐度的腫瘤相關(guān)蛋白。進一步研究通過對185名非肌層侵襲性膀胱癌患者尿液中TOGFRB表達水平的ELISA檢測，以及對患者進行為期3年的隨訪，證實了尿液中TOGFRB蛋白相對濃度與非肌層侵襲性膀胱癌的復(fù)發(fā)關(guān)系密切。
[0034]血小板衍生生長因子受體(platelet-derivedgrowthfactorreceptor,PDGFR)屬受體酪氨酸激酶跨膜糖蛋白二聚體分子，在正常的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞以及神經(jīng)細胞等多種細胞中均有分布，且在多種人腫瘤細胞呈高表達。PDGFR主要包含兩種結(jié)構(gòu)相似的受體亞型I3DGFR-a (TOGFRA)和TOGFR-β (PDGFRB)0 二聚體的配體分子使得與之結(jié)合的受體分子也形成同源或異源二聚體。
[0035]PDGFR與相應(yīng)配體發(fā)生特異性結(jié)合使其二聚化，并導(dǎo)致I3DGFR的自體磷酸化和胞內(nèi)酪氨酸激酶激活，酪氨酸殘基暴露SH2結(jié)構(gòu)域/ PTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點和底物蛋白分子結(jié)合，從而激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TOGFR的兩個亞型與配體結(jié)合后可誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)邊緣波動現(xiàn)象和應(yīng)力纖維的消失、調(diào)節(jié)鈣磷代謝、促進細胞的趨化及細胞間信號交流等作用。PDGFR的過度激活可促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移，并增強腫瘤血管生成作用，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲具有重要作用。
[0036]發(fā)明人不僅通過實驗驗證了尿液中的TOGFRB作為預(yù)測膀胱癌復(fù)發(fā)可能性及預(yù)后判斷的可行性，且提出了其診斷標準并開發(fā)相應(yīng)檢測試劑盒。
[0037]為更進一步闡述本發(fā)明為達成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及有益效果，下面并結(jié)合附圖及較佳實施例進行說明。通過生物信息學(xué)分析尋找到尿蛋白中腫瘤相關(guān)蛋白標志物的過程，以及膀胱癌復(fù)發(fā)患者尿液中出現(xiàn)的特異性I3DGFRB表達水平改變，與應(yīng)用免疫酶聯(lián)吸附的方法識別其改變的實驗結(jié)果，從而更好的解釋本發(fā)明提出的TOGFR作為一種新的生物學(xué)標志用于膀胱癌預(yù)后判斷的技術(shù)方案。
[0038]實施例1尿蛋白中腫瘤相關(guān)蛋白標志物的篩選
[0039]選取健康人群男性女性各100例，取其尿液標本，通過4不同蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法(圖1)，在健康人群尿液中共鑒定出1641個高可信度蛋白(表I)。選取鑒定出的獨特肽段多于4個或譜數(shù)目多于10個的高豐度蛋白，共592個。
[0040]通過Cytoscape軟件對592個高豐度蛋白進行BinGOplug-1n分析后，其中373個蛋白標記為細胞外蛋白或胞漿蛋白(圖2)。進一步通過STRING分析繪制出包含有312個節(jié)點，與1779個相互作用的蛋白-蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖3)。通過Cytoscape及ClueGO+Cluepediaplug-1n軟件對KEGG數(shù)據(jù)庫中的6個腫瘤相關(guān)關(guān)鍵詞對上述蛋白-蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)進行分析檢索，并最終通過STRING軟件構(gòu)建的包含15個腫瘤相關(guān)尿蛋白的蛋白-蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)(表2，圖5)。
[0041]表1在健康人群尿液中共鑒定出1641個高可信度蛋白技術(shù)方法
[0042]
【權(quán)利要求】
1.血小板源性生長因子受體3檢測試劑盒，其特征在于:包含能特異識別尿液中腫瘤蛋白標志物血小板源性生長因子受體3的檢測劑和捕捉劑。
2.如權(quán)利要求1所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的捕捉劑為人血小板源性生長因子受體P蛋白抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或重組抗體。
4.如權(quán)利要求1?3任一項所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的檢測劑為可檢測的標記物。
5.如權(quán)利要求4所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的可檢測的標記物成份包括酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)或放射活性物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的酶是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、3 -半乳糖酶或乙酰膽堿醋酶。
7.如權(quán)利要求5所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的輔基為鏈霉菌抗生物素蛋白/生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素蛋白。
8.如權(quán)利要求5所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的熒光物質(zhì)為傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸醋、若丹明、丹磺酰氯或藻紅蛋白。
9.如權(quán)利要求5所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的發(fā)光物質(zhì)為發(fā)光氨。
10.如權(quán)利要求5所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的生物發(fā)光物質(zhì)為熒光素酶、熒光素或水母發(fā)光蛋白。
11.如權(quán)利要求5所述的血小板源性生長因子受體P檢測試劑盒，其特征在于:所述的放射活性物質(zhì)為1251、35S、14C、3H或52Mg。
12.權(quán)利要求1?11任一項所述的試劑盒在非肌層侵襲性膀胱癌預(yù)后分析中的用途。
【文檔編號】G01N33/68GK103575905SQ201310475408
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】賀偉峰, 吳軍, 周俊嶧, 羅高興 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院