場上購買的新鮮椰果，取果內汁液并用雙層紗布過濾后備用O
[0035]改良MS 的成份及含量為:(I) NH4NO3 1650 mg/L、(2) KNO3 1900 mg/L、(3) CaCl2.2H20 440 mg/L, (4) MgSO4.7H20 370 mg/L、(5) KH2PO4 170 mg/L、(6) Na2-EDTA 37.3 mg/
L、(7) FeSO4.7H 20 27.8 mg/L, (8) MnSO4.4H20 22.3 mg/L, (9) ZnSO4.7H 20 8.6 mg/L,
(1)H3BO3 6.2 mg/L、(Il)KI 0.83 mg/L、(12)Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L、(13)CuSO4.5H200.025 mg/L, (14) CoCl2.6H20 0.025 mg/L, (15)鹽酸硫胺素 VB1 0.3 mg/L, (16)煙酸 0.5mg/L、(17)肌醇 100 mg/L、(18)甘氨酸 2 mg/L。
[0036]按照常規(guī)方法配制培養(yǎng)基，調節(jié)pH值為5.8，分裝后124°C滅菌25 min,備用。
[0037]實施例1
海菜花種苗組培快速繁殖方法，包括以下具體步驟:
(I)果實處理及消毒滅菌
從桂林永福海菜花分布地采集朔果充分膨大、果皮呈深藍色或淺黃色、無病蟲的完整海菜花果實，用保鮮袋保濕帶回實驗室，果實參見圖1。
[0038]用刀片輕輕去除果皮表面附著物，再用紗布取少量洗潔精擦洗干凈，后用150 mg/L的甲基托布津溶液浸泡0.3 h，并不斷攪拌，自來水沖洗干凈。
[0039]在超凈工作臺上先用70%(v/v)酒精浸泡2 min,后用濃度為0.2%(w/v)升汞浸泡15 min并不斷攪拌，無菌水沖洗5?6遍。消毒成功率為97.5%。
[0040](2)用手術刀將消毒滅菌后的無菌果實縱向切開，選取種皮呈黑色或褐色的種子接到萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為:MS、6-BA 2.0 mg/L,NAA 0.5 mg/L、瓊脂5.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH為5.8。培養(yǎng)基表面加4?6cm的無菌水，培養(yǎng)條件為溫度28±2°C的暗培養(yǎng)。種子萌發(fā)培養(yǎng)5天的生長情況參見圖2，15天的萌發(fā)率為95.6%。
[0041](3)以步驟(2)獲得的無菌幼芽為材料，去除胚根和葉片后，轉接到繼代增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:改良MS、6-BA 1.0 mg/L,KT 0.5 mg/L、NAA0.5 mg/L、酸水解酪蛋白0.3 g/L、椰子汁150 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L，pHS5.8。增殖倍數(shù)為3.0倍/25天，芽苗粗壯、葉色濃綠，參見圖3。
[0042](4)將植株高度達到4 cm的芽苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:MS,NAA 0.15 mg/L、瓊脂5.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH為5.8。培養(yǎng)10天可見新根形成，30天時生根率為100%，參見圖4。
[0043](5)將生根后的試管苗在水質良好、并且流動的水域中進行移栽，60天時的成活率達85%以上，植株生長良好，參見圖5。
[0044]實施例2
海菜花種苗組培快速繁殖方法，包括以下具體步驟:
(I)果實處理及消毒滅菌與實施例1相同方法采集清洗海菜花果實，后用100 mg/L的甲基托布津溶液浸泡I h，自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上先用75%(v/v)酒精浸泡I min，再用濃度為0.l%(w/v)升未浸泡20 min，無菌水沖洗5?6遍。消毒成功率為95%。
[0045](2)用手術刀將消毒滅菌后的無菌果實縱向切開，選取種皮呈黑色或褐色的種子接到萌發(fā)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:MS、6-BA 1.0 mg/L, NAA 0.1 mg/L、瓊脂5.5 g/L、蔗糖30 g/L, pH為5.8。培養(yǎng)基表面加4?6 cm的無菌水，培養(yǎng)條件為溫度28±2°C的暗培養(yǎng)。15天的萌發(fā)率98.6%。
[0046](3)以步驟(2)獲得的無菌幼芽為材料，去除胚根和葉片后，轉接到繼代增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:改良MS、6-BA 2.0 mg/L,KT 0.5 mg/L、NAA0.1 mg/L、酸水解酪蛋白0.2 g/L、椰子汁100 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L，pHS5.8。增殖倍數(shù)為2.5倍/25天，芽苗粗壯、葉色濃綠。
[0047](4)將植株高度達到4cm的芽苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:MS、NAA 0.1 mg/L、瓊脂 5.5 g/L、蔗糖 30 g/L, pH 為 5.8。30 天時生根率為 97.3%。
[0048](5)將生根后的試管苗在水質良好、并且流動的水域中進行移栽，60天時的成活率達85%以上，植株生長良好。
[0049]實施例3
海菜花種苗組培快速繁殖方法，包括以下具體步驟:
(I)果實處理及消毒滅菌與實施例1相同方法采集清洗海菜花果實，后用150 mg/L的甲基托布津溶液浸泡0.3h，自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上先用70%(v/v)酒精浸泡2 min，再用濃度為0.2%(w/v)升未浸泡20 min，無菌水沖洗5?6遍。消毒成功率為98.TL.
[0050](2)用手術刀將消毒滅菌后的無菌果實縱向切開，選取種皮呈黑色或褐色的種子接到萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:MS、6-BA 0.5 mg/L, NAA 0.1 mg/L、瓊脂5.5 g/L、蔗糖30 g/L,pH為5.8。培養(yǎng)基表面加4?6 cm的無菌水，培養(yǎng)條件為溫度28±2°C的暗培養(yǎng)。15天的萌發(fā)率90.8%。
[0051](3)以步驟(2)獲得的無菌幼芽為材料，去除胚根和葉片后，轉接到繼代增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:改良MS、6-BA 1.0 mg/L, KT 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、椰子汁200 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L, pH為5.8。增殖倍數(shù)為2.1倍/25天，芽苗粗壯、葉色濃綠。
[0052](4)將植株高度達到4 cm的芽苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為:MS、NAA 0.2 mg/L、瓊脂 5.5 g/L、蔗糖 30 g/L, pH 為 5.8。30 天時生根率為 99%。
[0053](5)將生根后的試管苗在水質良好、并且流動的水域中進行移栽，60天時的成活率達85%以上，植株生長良好。
【主權項】
1.一種海菜花種苗組培快速繁殖方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將處理干凈的海菜花果實置于100?200mg/L的甲基托布津溶液浸泡0.3?I h，自來水沖洗干凈后，在超凈工作臺上先用70?75%(v/v)酒精浸泡I?2 min，再用濃度為.0.1?0.2% (w/v)升未浸泡15?20 min，無菌水沖洗5?6遍，獲得無菌果實； (2)將步驟(I)獲得的無菌果實用手術刀縱向切開，選取種皮為黑色或褐色的種子接到萌發(fā)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)形成幼芽； (3)以步驟(2)獲得的無菌幼芽為材料，去除胚根和葉片后，轉接到繼代增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，獲得叢生芽； (4)經(jīng)過增殖擴繁后，將植株高度達到4cm的小苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，獲得完整試管苗； (5)將完整試管苗直接在水質良好的水域中進行移栽定植； 其中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基為:MS、6-BA 0.5?2.0 mg/L,NAA 0.1?0.5 mg/L、瓊脂4.5?.6.0 g/L、鹿糖 30 g/L，pH 為 5.8 ?6.2 ; 所述繼代增殖培養(yǎng)基為:改良MS、6-BA 1.0?2.0 mg/L, KT 0.5?1.0 mg/L, NAA.0.1?0.5 mg/L、酸水解酪蛋白0.2?0.5 g/L、椰子汁100?200 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂.4.5 ?6.0 g/L, pH 為 5.8 ?6.2 ; 所述生根培養(yǎng)基為:改良MS、ΝΑΑ0.1?0.2 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5?6.0 g/L,pH 為 5.8 ?6.2。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述萌發(fā)培養(yǎng)基表面加4?6cm的無菌水；培養(yǎng)條件:溫度28 ±2 °C的暗培養(yǎng)。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)、(4)中所述培養(yǎng)基表面加4?6cm的無菌水；培養(yǎng)條件:光照強度2000 lux，光照時間10±2 h/d，溫度25±2°C。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)、(4)中所述的改良MS為:(I)NH4NO3 1650 mg/L, (2) KNO3 1900 mg/L, (3) CaCl2.2H 20 440 mg/L, (4) MgSO4.7H 20 370mg/L、(5) KH2PO4 170 mg/L、(6) Na2-EDTA 37.3 mg/L, (7) FeSO4.7H20 27.8 mg/L, (8) MnSO4.4H20 22.3 mg/L, (9)ZnSO4.7H20 8.6 mg/L, (1)H3BO3 6.2 mg/L, (Il)KI 0.83 mg/L,(12) Na2MoO4.2H 20 0.25 mg/L, (13) CuSO4.5H 20 0.025 mg/L, (14) CoCl2.6H 20 0.025mg/L、(15)鹽酸硫胺素 VB1 0.3 mg/L、(16)煙酸 0.5 mg/L、(17)肌醇 100 mg/L、(18)甘氨酸 2 mg/Lο
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述甲基托布津的濃度為150mg/L，浸泡時間為0.3 h ;酒精濃度為70%(v/v)，浸泡時間為2 min ;升汞濃度為0.2%(w/v)，浸泡時間為15 min。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為:MS、6-BA 1.0 mg/L, NAA 0.1 mg/L、瓊脂 5.5 g/L、蔗糖 30 g/L，pH 為 5.8。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)所述繼代增殖培養(yǎng)基為:改良MS、6-BA 1.0 mg/L,KT 0.5 mg/L,NAA 0.1 mg/L、酸水解酪蛋白 0.3 g/L、椰子汁 150 mg/L,蔗糖 20 g/L、瓊脂 5.5 g/L, pH 為 5.8。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)所述生根培養(yǎng)基為:改良MS、NAA.0.15 mg/L、鹿糖 30 g/L、瓊脂 4.5 ?6.0 g/L, pH 為 5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海菜花種苗組培快速繁殖方法，通過誘導海菜花種子萌發(fā)形成無菌幼芽，再以無菌幼芽為材料接種于篩選出的繼代增殖培養(yǎng)基上，繼代25天繁殖系數(shù)達3倍以上，且芽苗粗壯、葉色濃綠，之后再將植株高度達到4cm的芽苗轉接到生根培養(yǎng)基，30天時生根率高達100%，將生根后的試管苗在水質良好、并且流動的水域中進行移栽，成活率達85%以上，能在較短時間內獲得大量增殖，一定程度上可實現(xiàn)工廠化組培苗生產(chǎn)。還具有繁殖速度快、產(chǎn)量大、種苗質量優(yōu)、需時短、實際操作性強、應用價值高等特點，對海菜花物種保護和可持續(xù)利用具有重要意義和良好的應用前景。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104604683
【申請?zhí)枴緾N201510040301
【發(fā)明人】唐鳳鸞, 黃寧珍, 何金祥, 趙健, 付傳明, 冼康華, 仇碩, 黃惠錦
【申請人】廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月27日