基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種繁殖白及種苗的方法，具體涉及一種基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法，即先將白及種子在無菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成原球莖，再將原球莖播種到栽培基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)，屬于植物種苗快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蘭科植物種子非常小，被稱為“粉塵”種子(dust seed)，是蘭科植物的一個(gè)重要特征。蘭科植物的種子長0.05-6.0mm，直徑0.01-0.9mm，單粒種子重約0.31-24 μ g，種胚也非常小，如壇花蘭(Acanthephippium sylhetense) 0.058X0.042mm, 一枚果實(shí)中種子數(shù)量最高達(dá)4百萬粒！Roberts、張燕對白及的種子測量為:長1.20mm,寬0.23mm，種胚長0.38mm,寬0.22mm，Kiyohara的測量結(jié)果為:種子長1.80mm,寬0.23mm,種胚長0.49mm,寬0.21mm。
[0003]由于蘭科植物種子非常小，通常認(rèn)為蘭科植物種子中所儲藏的營養(yǎng)物質(zhì)不足以使其萌發(fā)并產(chǎn)生一株自養(yǎng)性的幼苗，因此與真菌共生是必需的，但是現(xiàn)有資料顯示蘭科植物對真菌的依賴程度存在差異。不同類型的蘭科植物對菌根真菌(mycorrhiza)營養(yǎng)性依賴差異非常大；附生型的可能在種子萌發(fā)階段與真菌相關(guān)聯(lián)，而成年個(gè)體在營養(yǎng)上可能不依賴菌根真菌；陸生型的種類則表現(xiàn)對菌根真菌為持續(xù)性依賴，美國的舌唇蘭(Plantanthera)、歐洲的蜂蘭(Ophrys)及澳洲的蜘蛛蘭(Caladenia)是陸生型的代表，菌根真菌對其生長發(fā)育至關(guān)重要。
[0004]白及(Bletilla Striata，亦稱白芨)系蘭科白及屬多年生陸生型草本，本屬約6種，我國4種，陜南分布3種，不僅觀賞價(jià)值較高，亦是常用中藥之一，其作用為收斂止血，消腫生肌，用于咯血吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂，肺結(jié)核咯血，潰瘍病出血。白及不僅藥用價(jià)值高，而且極具觀賞價(jià)值，也是我國現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原材料。
[0005]近年來，隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，白及在臨床上的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，白及的用藥需求急劇增加。
[0006]白及種子非常細(xì)小且無胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)和生長。目前白及繁殖主要采用營養(yǎng)繁殖，有兩種方式:
[0007]1、分株繁殖，為白及常規(guī)繁殖方式，即將白及塊莖一分為二，分株繁殖春季或秋季均可進(jìn)行，但其周期長，繁殖效率低，而且耗種量大，加之長期無性繁殖易引起種質(zhì)退化，很難適應(yīng)規(guī)模化種植的需要及滿足大量栽培的需要。
[0008]2、植物組織培養(yǎng)，在1960年前后Morel首先發(fā)現(xiàn)利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以無性繁殖蘭科植物，隨后該技術(shù)廣泛應(yīng)用于多種蘭科繁殖，尤其是對人工培育雜交品種的繁殖；國內(nèi)外研宄人員對白及也進(jìn)行了廣泛的離體培養(yǎng)研宄，主要使用的是固體培養(yǎng)基，袁寧利用白及種子進(jìn)行無菌萌發(fā)(亦稱為非共生萌發(fā))，形成試管苗；田英翠等采用白芨幼根作為外植體誘導(dǎo)出白芨原球莖，楊俊慧等切取白芨無菌幼苗的莖尖誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽生根培養(yǎng)為成株；朱玉球等則利用白芨種子萌發(fā)形成的原球莖作為外植體，誘導(dǎo)形成原球莖；余朝秀等利用栽培植株的莖尖及側(cè)芽，誘導(dǎo)增殖芽形成根后移栽，試管苗成活率達(dá)90%以上；付志惠等對不同胚齡白芨種子的無菌播種技術(shù)進(jìn)行了探索；Arditti描述了利用根尖(Root Tip)、莖節(jié)(Stem Node)及假鱗莖(Pseudobulb)離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽發(fā)生進(jìn)行離體繁殖。
[0009]利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行白及快速繁殖是可行的，目前已經(jīng)在生產(chǎn)上應(yīng)用，但該技術(shù)存在以下不足之處:
[0010]1、需要較為復(fù)雜的技術(shù)條件；
[0011]2、無菌操作勞動強(qiáng)度大，并且人員需要技術(shù)培訓(xùn)；
[0012]3、試管苗馴化成活率低。
[0013]因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行白及快速繁殖的生產(chǎn)成本較高。而對蘭科植物種子進(jìn)行液體培養(yǎng)以形成原球莖有一些報(bào)道，包括Chu(2006)、Gangaprasad(2013)、Hsu (2012)、Popov (2004)、Pedroso (1992)、Popova (2003)、Hossain (2010)、Nhut (2005)、Minea (2004)、Paul (2012)、Nagananda (2012)、Thorpe (2011)，最近王楷等人(王楷，李玥，張?jiān)品澹飳殢?qiáng)，楊秀梅，普家寧，嚴(yán)勝柒.白芨種子的高效萌發(fā)及其無性繁殖體系的構(gòu)建.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，34 (4):71-78)對白及種子進(jìn)行液體培養(yǎng)，結(jié)果顯示添加1.0mg/L 6-BA的1/2MS液體培養(yǎng)基是種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為；他們的工作主要是進(jìn)行理論研宄，包括固體、液體培養(yǎng)基對比，種子活力檢測、不同培養(yǎng)基的影響、不同發(fā)育狀態(tài)種子萌發(fā)效應(yīng)等，開展的研宄都是在較小體積的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，種子萌發(fā)形成原球莖后，都沒有將原球莖轉(zhuǎn)入土壤基質(zhì)培養(yǎng)成苗，從而形成大規(guī)模繁殖技術(shù)。
[0014]此外，與本發(fā)明相關(guān)的專利文獻(xiàn)有:
[0015]1、白芨種莖的生產(chǎn)方法(申請?zhí)?201310579744.9)，
[0016]2、一種白芨種子的育苗方法(申請?zhí)?201210350910.3)，
[0017]3、白芨的種子組培繁殖方法(申請?zhí)?201310282939.7)，
[0018]4、利用白芨種子快速繁殖小苗的方法(申請?zhí)?200910102668.6)，
[0019]5、通過靜態(tài)液體培養(yǎng)生產(chǎn)蘭花實(shí)生苗的方法(美國:7073289),
[0020]上面5種方法都是采用白及成熟種子，進(jìn)行無菌播種，即植物離體培養(yǎng)。
[0021]6、白及快速繁殖育苗的方法(申請?zhí)?201310152721.X)，
[0022]該方法需采用噴灑多菌靈和殺蟲劑以抑制雜菌及害蟲發(fā)生。
[0023]7、一種白及種子的繁殖方法(申請?zhí)?201310085109.5)，
[0024]該方法需對培養(yǎng)基質(zhì)噴灑1/2MS無糖培養(yǎng)液，播種后需定時(shí)噴霧營養(yǎng)液(組分:6-芐氨基嘌呤O?2.0mg/L，1-萘乙酸O?1.0mg/L，溶劑為1/2MS或MS無糖培養(yǎng)液)。
[0025]可見，目前尚未見到利用白及種子在液體培養(yǎng)基中形成原球莖，再將原球莖播種到栽培基質(zhì)中進(jìn)行快速種苗繁殖的技術(shù)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0026]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用白及種子在無菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成原球莖，再將原球莖播種到栽培基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)快速繁殖白及種苗的方法，該方法對環(huán)境友好、工藝簡單、育苗周期短，并且種子萌發(fā)率和成苗率均較高。
[0027]為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0028]一種基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0029]Stepl:將白及種子消毒后無菌接種到液體培養(yǎng)基中，置于光照下靜置培養(yǎng)，每10ml液體培養(yǎng)基中接種20mg白及種子；
[0030]St印2:待獲得直徑l_2mm的原球莖后，將原球莖取出培養(yǎng)基，沖洗后播種到經(jīng)消毒處理、富含腐殖質(zhì)的栽培基質(zhì)中；
[0031]Step3:原球莖在栽培基質(zhì)中萌發(fā)生長，待小塊莖直徑達(dá)0.5-2cm時(shí)即可用于銷售或定植大田。
[0032]前述的基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法，其特征在于，在Stepl中，對白及種子消毒所使用的消毒劑為70%酒精與0.1%取(:12或20%的次氯酸鈉進(jìn)行配合使用。
[0033]前述的基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法，其特征在于，在Stepl中，前述液體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基或Knudson培養(yǎng)基。
[0034]前述的基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法，其特征在于，在Stepl中，光照下靜置培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為20-25°C，濕度為50% -90%，光照強(qiáng)度為3000-6000勒克斯。
[0035]前述的基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法，其特征在于，在Step2中，前述土壤基質(zhì)為泥炭與普通栽培土壤或自然土壤的混合物，前述泥炭的質(zhì)量百分含量為20-50%。
[0036]前述的基于種子液體培養(yǎng)的快速繁殖白及種苗的方法，其特征在于，在Step3中，原球莖在栽培基質(zhì)中生長的初期用遮陰網(wǎng)遮陰，生根后逐漸增加光照強(qiáng)度，整個(gè)栽培過程中通過搭建塑料棚或者通過噴霧加濕保持栽培基質(zhì)的含水量在75% -95%的范圍內(nèi)。
[0037]本發(fā)明的有益之處在于:
[0038](I)本方法不需要大量使用殺蟲劑、滅菌劑，對環(huán)境友好；
[0039](2)生產(chǎn)工藝簡單，在整個(gè)生產(chǎn)過程中僅需要一次無菌操作，使用液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，避免了使用固體培養(yǎng)基帶來的播種量小、需要多次繼代培養(yǎng)、形成的幼苗根系相互纏繞、定植土壤時(shí)需要較多人工等問題，從而在總體上對