一種海菜花種苗組培快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種含高蛋白的水生植物海菜花種苗組培快速繁殖方法。
【背景技術】
[0002]海菜花Ottelia ac應i/?aia(Gagnep.)Dandy是一種多年生大型沉水植物，我國特有種，國家二級保護植物。海菜花能大量吸收水中的營養(yǎng)物質(zhì)，減少氮、磷含量，還可分泌一些化感物質(zhì)抑制藻類生長，因此在解決水體富營養(yǎng)化及水華爆發(fā)等生態(tài)問題中具有重要作用，被譽為凈化水質(zhì)的“試金石”。海菜花含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷等多種營養(yǎng)成分，是一種非常受歡迎的綠色蔬菜，同時也是產(chǎn)區(qū)人們發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)的主要飼料來源。此外，海菜花花期長、觀賞性好，還能形成“花一魚一鳥”的獨特立體生態(tài)景觀，具有良好的開發(fā)應用前景。
[0003]然而，在自然條件下由于水流、底質(zhì)及動物取食等原因，萌發(fā)的海菜花種子幼苗很難成活；再加上其雌雄佛焰苞及花莖大多被采摘食用，又進一步減少了種子數(shù)量。而分株繁殖時，I株成年植株每年也只能分殖3?5株苗，繁殖系數(shù)相當?shù)停液２嘶ǖ那o極度短縮，植株成叢生狀，分株時容易受傷并難以成活。近年來由于濕地破壞及人類過渡采挖等因素的影響，海菜花種群數(shù)量急劇減少，已處于瀕危狀態(tài)，嚴重制約了海菜花的應用?？梢?，與其它沉水植被一樣，海菜花的種苗快速規(guī)?；敝痴抢_其植被恢復，以及開發(fā)利用的關鍵所在。
[0004]植物組織培養(yǎng)技術在種苗繁育中得到廣泛應用，技術也相對成熟。利用組織培養(yǎng)技術繁殖海菜花，可在短期內(nèi)獲得大量優(yōu)良種苗，為海菜花種質(zhì)資源的保護及開發(fā)利用提供技術支撐，具有良好的應用前景。目前，針對海菜花的研宄多集中于生物學、生態(tài)學及分類學領域，而對于海菜花種苗組織培養(yǎng)技術的研宄尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用植物組織培養(yǎng)技術快速獲得大量海菜花種苗的繁殖方法，具有繁殖速度快、種苗質(zhì)量好、可操作性強等特點，并克服了水生植物組織培養(yǎng)中外植體消毒滅菌困難的問題。
[0006]本發(fā)明以蛋白含量高、觀賞性好并具有水質(zhì)凈化功能的大型沉水植物海菜花為材料，利用植物組織培養(yǎng)技術進行種苗快速繁殖研宄，通過果實處理及消毒滅菌、種子萌發(fā)誘導培養(yǎng)、芽繼代增殖培養(yǎng)、生根誘導及試管苗移栽研宄，獲得海菜花種苗快速繁殖的方法，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0007]本發(fā)明一種海菜花種苗組培快速繁殖方法，包括以下步驟:
(I)從野外采集朔果充分膨大、果皮呈深藍色或淺黃色、無病蟲的完整海菜花果實，去除果皮表面附著物，并用洗潔精擦洗干凈，后用100?200 mg/L的甲基托布津溶液浸泡0.3?lh，自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上先用70?75%(v/v)酒精浸泡I?2 min，再用濃度為0.1?0.2%(w/v)升汞浸泡15?20 min，無菌水沖洗5?6遍，獲得無菌果實； (2)將步驟(I)獲得的無菌果實用手術刀縱向切開，將種子接到萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成幼芽；
(3)以步驟(2)獲得的無菌幼芽為材料，去除胚根和葉片后，轉接到繼代增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，獲得叢生芽；
(4)經(jīng)過增殖擴繁后，將植株高度達到4cm的小苗轉接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，獲得完整試管苗；
(5)將完整試管苗直接在水質(zhì)良好的水域中進行移栽定植；
其中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基為:MS、6-BA 0.5?2.0 mg/L,NAA 0.1?0.5 mg/L、瓊脂4.5?
6.0 g/L、鹿糖 30 g/L，pH 為 5.8 ?6.2 ;
所述繼代增殖培養(yǎng)基為:改良MS、6-BA 1.0?2.0 mg/L, KT 0.5?1.0 mg/L, NAA0.1?0.5 mg/L、酸水解酪蛋白0.2?0.5 g/L、椰子汁100?200 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂
4.5 ?6.0 g/L, pH 為 5.8 ?6.2 ;
所述生根培養(yǎng)基為:改良MS、ΝΑΑ0.1?0.2 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5?6.0 g/L,pH 為 5.8 ?6.2。
[0008]所述培養(yǎng)基中，6-BA為6-芐氨基腺嘌呤；NAA為1-萘乙酸；KT為6-糠氨基嘌呤(激動素)。
[0009]MS 主要包含以下成分:(I) NH4NO3 1650 mg/L, (2)KNO3 1900 mg/L, (3)CaCl2.2H20 440 mg/L, (4) MgSO4.7H 20 370 mg/L, (5) KH2PO4 170 mg/L, (6) Na2-EDTA 37.3 mg/L、(7) FeSO4.7H 20 27.8 mg/L, (8) MnSO4.4H20 22.3 mg/L, (9) ZnSO4.7H 20 8.6 mg/L,
[10]H3BO36.2 mg/L、(Il)KI 0.83 mg/L、(12)Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L、(13)CuSO4.5H200.025 mg/L, (14) CoCl2.6H20 0.025 mg/L, (15)鹽酸硫胺素 VB1 0.1 mg/L, (16)煙酸 0.5mg/L、(17)肌醇 100 mg/L、(18)甘氨酸 2 mg/L、(19)鹽酸P比唆醇 VB6 0.5 mg/L。
[0010]步驟(3)、(4)中所述的改良MS 為:(1) NH4NO3 1650 mg/L、⑵ KNO3 1900 mg/L, (3)CaCl2.2H20 440 mg/L, (4) MgSO4.7H20 370 mg/L、(5) KH2PO4 170 mg/L、(6) Na2-EDTA 37.3mg/L, (7) FeSO4.7H20 27.8 mg/L, (8) MnSO4.4H20 22.3 mg/L, (9) ZnSO4.7H 20 8.6 mg/L、(1)H3BO3 6.2 mg/L, (Il)KI 0.83 mg/L, (12)Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L, (13)CuSO4.5H20 0.025 mg/L, (14) CoCl2.6H20 0.025 mg/L, (15)鹽酸硫胺素 VB1 0.3 mg/L, (16)煙酸 0.5 mg/L、(17)肌醇 100 mg/L、(18)甘氨酸 2 mg/L。
[0011]內(nèi)源維生素在植物代謝過程中起著重要的催化作用，而當細胞或組織處于離體培養(yǎng)時自身合成的維生素不能滿足生長需要，因此必須在培養(yǎng)基中添加生長所需的維生素。鹽酸硫胺素(VB1)和鹽酸吡哆醇(VB6)是兩種常用的維生素，但鹽酸硫胺素(VB1)是所有細胞和組織必需的基本維生素，而鹽酸吡哆醇(VB6)對許多植物的細胞可能不是必需的。
[0012]所述步驟(3)、(4)中所用的改良MS，則是根據(jù)海菜花培養(yǎng)叢生芽和生根苗的生長需要增加鹽酸硫胺素(VB1)用量，減少鹽酸吡哆醇(VB6)用量。經(jīng)改良MS培養(yǎng)的叢生芽和生根苗比用MS培養(yǎng)的粗壯、生長好，形成叢生芽和生根所需的時間也較短，減少了培養(yǎng)基制作程序和培養(yǎng)用電量，可節(jié)約種苗培養(yǎng)成本。
[0013]由于海菜花特殊的生活環(huán)境和組織結構，使其葉片、芽、花及根等均非常難消毒滅菌，存在很高的污染率和死亡率。厚實的果皮及表面網(wǎng)紋結構，可保護果實內(nèi)部的種子在消毒滅菌時不受傷害。本發(fā)明利用海菜花果實進行消毒滅菌，即保證了消毒成功率又不損傷種子。
[0014]所述海菜花果實從野外采集并用保鮮袋保濕，回實驗室后馬上處理應用；果實處理為先用自來水清洗果實表面后，用刀片輕輕除掉果皮上不易洗掉的污物，再用紗布取少許洗潔精擦洗。整個過程要輕，不能損壞果皮，否則會導致消毒不徹底，消毒液還會損傷種胚。
[0015]海菜花果實生長在水面下，表面附著有大量微生物，用單一的殺菌劑效果不理想。采用甲基托布津、酒精與升汞聯(lián)合使用達到消毒滅菌目的，但要嚴格控制好使用濃度及作用時間。
[0016]所述甲基托布津的優(yōu)選濃度為150 mg/L，浸泡時間為0.3 h。
[0017]所述70?75%(v/v)的酒精具有較強的滲透性，使細胞內(nèi)蛋白變性而殺死果實表面的微生物，用于海菜花果實表面消毒的優(yōu)選濃度為70%(v/v)，浸泡時間為2 min。
[0018]所述升汞是一種植物組織培養(yǎng)過程中外植體消毒滅菌常用的強力消毒劑，具有很強的滅菌作用，但也極易損傷植物材料，優(yōu)選濃度為0.2%(w/v)，浸泡時間為15 min。
[0019]所述甲基托布津溶液浸泡、酒精溶液浸泡及升汞溶液浸泡時要不斷地輕輕攪拌。
[0020]所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基優(yōu)選為:MS、6-BA 1.0 mg/L,NAA 0.1 mg/L、瓊脂5.5 g/L、蔗糖 30 g/L，pHS5.8。
[0021]所述繼代增殖培養(yǎng)基優(yōu)選為:改良MS、6-BA 1.0 mg/L,KT 0.5 mg/L,NAA 0.1 mg/L、酸水解酪蛋白0.3 g/L、椰子汁150 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L, pH為5.8。
[0022]所述生根培養(yǎng)基優(yōu)選為:改良MS、NAA0.15 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂5.5 g/L，pH為5.8 ο
[0023]步驟(2)中所述萌發(fā)培養(yǎng)基表面加4?6cm的無菌水；培養(yǎng)條件:溫度28±2°C的暗培養(yǎng)。
[0024]步驟(3) (4)中所述培養(yǎng)基表面加4?6cm的無菌水；培養(yǎng)條件:光照強度20001ux、光照時間 10±2 h/d，溫度 25±2°C。
[0025]步驟(5)中所述水質(zhì)良好的水域為水質(zhì)清澈的河流、溝壑、水塘、水田等。
[0026]步驟(2)中將無菌果實用手術刀縱向切開，選取種皮為黑色或褐色的種子接到萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天開始萌發(fā)，5?10天形成長2?6cm的幼芽。
[0027]將步驟(2)中種子萌發(fā)形成的無菌幼芽去除胚根和葉片后，轉接到繼代增殖培養(yǎng)基中，增殖倍數(shù)為3.0倍/25天，芽苗粗壯、葉色濃綠。
[0028]將植株高度達到4cm的芽苗轉接到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10天可見新根形成，30天時生根率高達100%。
[0029]將生根后的試管苗在水質(zhì)良好的水域中進行移栽，60天的成活率達85%以上，植株生長良好。
[0030]本發(fā)明的優(yōu)點為:
本發(fā)明方法有效地解決了組織培養(yǎng)過程中，沉水植物海菜花的外植體消毒滅菌難題，即控制了污染又保證了材料不受損傷，污染率控制在5%以內(nèi)。
[0031]本發(fā)明方法建立了一整套完整的海菜花種子萌發(fā)、幼芽繼代增殖、試管苗生根培養(yǎng)技術，繼代25天繁殖系數(shù)達3倍以上，且種苗質(zhì)量好，直接移栽野外60天成活率達85%以上，能在較短時間內(nèi)獲得大量增殖，一定程度上可實現(xiàn)工廠化種苗生產(chǎn)。具有繁殖速度快、產(chǎn)量大、種苗質(zhì)量優(yōu)、需時短、實際操作性強、應用價值高等特點，對海菜花物種保護和可持續(xù)利用具有重要意義和良好的應用前景。
【附圖說明】
[0032]圖1海菜花果實及種子；
圖2為實施例1海菜花種子萌發(fā)培養(yǎng)5 d的生長情況；
圖3為實施例1海菜花幼芽繼代增殖培養(yǎng)25 d的生長情況；
圖4為實施例1海菜花芽苗生根培養(yǎng)30 d的生長情況；
圖5為實施例1海菜花生根苗移栽水塘30 d的生長情況。
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例和附圖對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進一步的闡述，但不是對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體條件及操作的實驗方法，按照常規(guī)方法，或按照說明書上制造商提供的要求進行。除非特別定義，本發(fā)明中所使用的專業(yè)用語均為本領域科技人員熟悉的含義。
[0034]培養(yǎng)基的制備:
有機添加物的制備:用電子天平稱取所需量的酸水解酪蛋白直接溶解于適量的去離子水中，形成水溶液備用；椰子汁為從市