一種化學(xué)誘導(dǎo)玉米孤雌生殖的處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于玉米育種技術(shù)領(lǐng)域，特別是玉米自交系的選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]選育玉米自交系的常規(guī)方法，育成一個自交系至少需要經(jīng)過連續(xù)7代以上的自交才能達到基因型純合，對于遺傳背景復(fù)雜的材料所需的代數(shù)要更多。為了加快自交系的選育速度，縮短育種周期和提高純度，國內(nèi)外通常采用的方法主要有Stock 6遺傳誘導(dǎo)單倍體法和化學(xué)誘導(dǎo)孤雌生殖法:
1.Stock 6誘導(dǎo)法
用遺傳誘導(dǎo)系Stock 6給被誘導(dǎo)的對象授粉，誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生單倍體種子。之后再用秋水仙素等染色體加倍處理劑將其加倍成二倍體植株。此方法被認(rèn)為是目前世界上最先進的方法。然而，仍存在以下問題:
(1)誘導(dǎo)產(chǎn)生的少量單倍體種子，需要利用標(biāo)記性狀對整個穗上的種子逐粒進行篩選，從中挑選出真正是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體種子，淘汰雙受精種子。因此，工作量大、效率低、人工挑選枯燥乏味，難以實現(xiàn)機械化；
(2)對于一部分誘導(dǎo)對象，由于遺傳背景、成熟度、籽粒形狀、果皮厚度等原因，還存在顯色效果不佳甚至不顯色問題，因此難以辨認(rèn)；
(3)由于用Stock6誘導(dǎo)產(chǎn)生的種子屬于單倍體，須再經(jīng)過染色體加倍才能成為正常的二倍體，而加倍過程繁瑣、加倍率又低；
(4)在利用秋水仙素對單倍體種子或幼苗進行染色體加倍時，處理后的廢液屬于劇毒、高致癌物質(zhì)，需要嚴(yán)格的無害化處理；
(5)使用Stock6遺傳誘導(dǎo)方法，需要用人工授粉來完成。為了使誘導(dǎo)系與被誘導(dǎo)對象的花期相遇，要進行錯期播種，調(diào)節(jié)父、母本的開花時間。但是，往往由于試驗材料對光、溫的反應(yīng)不同，或因土壤、肥力差異而常常發(fā)生花期不遇。
[0003]2.秋水仙素誘導(dǎo)法
在玉米吐絲期，用秋水仙素作為染色體加倍處理劑處理花絲，使其不經(jīng)過雙受精而是通過孤雌生殖直接產(chǎn)生純合的二倍體種子。
[0004]秋水仙素是常用的染色體加倍處理劑，其突出優(yōu)點是誘導(dǎo)率高，因此在教學(xué)和科研中被廣泛使用。然而，盡管秋水仙素誘導(dǎo)玉米孤雌生殖已是一種成熟的玉米自交系選育技術(shù)。但是該方法主要存在兩大問題，使其難以在育種上規(guī)?；瘧?yīng)用:
一是安全問題。秋水仙素屬于劇毒試劑，致癌性強，對人體健康威脅大。因此現(xiàn)有技術(shù)均采取涂抹花絲或向花絲注射的方法。但是，涂抹時極易造成刮碰和藥液滴落；注射時由于花絲間的空隙很小，用量難以掌握，因此極易造成藥液溢出和流淌，對人體健康存在威脅。
[0005]二是花粉污染問題。處理時，即使在嚴(yán)格的套袋條件下操作，或遮擋，或避開散粉時間，但花粉污染也非常嚴(yán)重，產(chǎn)生大量假種子，特別是在海南氣候條件下。
[0006]此外，由于花絲生長緊密，注射時對藥液的容納量少，大量花絲不容易接觸到藥液。又由于花絲親水性差，涂抹時難以附著，處理效果不理想；為了安全使用秋水仙素，對處理的要求極其嚴(yán)格，操作十分謹(jǐn)慎。因此，速度慢、效率低，難以規(guī)模化應(yīng)用。
[0007]3.低毒的化學(xué)試劑誘導(dǎo)法
用低毒的、具有誘導(dǎo)染色體加倍作用的化學(xué)試劑替代秋水仙素，誘導(dǎo)孤雌生殖產(chǎn)生二倍體種子。這些試劑主要有氟樂靈、甲基胺草磷、炔苯酰草胺等，解決了秋水仙素誘導(dǎo)對人畜安全的問題。與Stock 6誘導(dǎo)單倍體方法相比，具有程序簡化、方法簡單、操作容易、成本低、效率高等優(yōu)點；
但是，這種用低毒化學(xué)試劑誘導(dǎo)的方法，雖然避免了秋水仙素對人體健康的安全問題。而在誘導(dǎo)劑的使用方法上，現(xiàn)有技術(shù)均采用向花絲注射、涂抹或噴霧的方法。而這些方法必須在嚴(yán)格的、絕對隔離條件下操作，特別是噴霧時要求更高，但實踐操作中卻難以做到。因此，花粉污染嚴(yán)重，經(jīng)常產(chǎn)生大量的假種子，使其規(guī)?；瘧?yīng)用受到限制。此外，也同樣存在不是所有花絲都能接觸到誘導(dǎo)劑，以及藥液容納量少和誘導(dǎo)劑停留時間短的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題:一是徹底解決在誘導(dǎo)處理操作中大量產(chǎn)生的花粉污染問題，不再產(chǎn)生假種子；二是可使所有花絲都能接觸到藥液，并延長藥液在花絲上的停留時間，進而提高誘導(dǎo)效果；三是可避免涂抹或注射方法產(chǎn)生的藥液大量流淌，以及噴霧造成的藥液浪費，降低了成本；四是簡化處理程序，提高誘導(dǎo)率，減少誘導(dǎo)劑用量，使操作簡單、易于規(guī)模化應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
1.配制誘導(dǎo)劑
用低毒的氟樂靈、甲基胺草磷或炔苯酰草胺配制誘導(dǎo)劑，及以其復(fù)配而成的誘導(dǎo)劑；或用秋水仙素(COL)配制誘導(dǎo)劑，或以秋水仙素為主與二甲基亞砜(DMSO)復(fù)配而成的誘導(dǎo)劑。
[0010]2.制備紙漿糊
采用生活用卷紙，將卷紙和誘導(dǎo)劑藥液加入容器中，攪拌成稀的紙漿糊，其稀稠程度以用20cm敷料鑷能夾取即可。對于秋水仙素誘導(dǎo)劑則要稠些，以用20cm敷料鑷能夾取但藥液又不至滴落為宜。
[0011]3.誘導(dǎo)前的果穗處理
在吐絲前對雌穗套袋；當(dāng)大部分花絲吐出時，摘掉紙袋，在雌穗花苞頂部、幼穗以上的位置，將外部的多層苞葉向下扒開，僅剩下花絲和貼近花絲的內(nèi)層苞葉，之后用刀片將未被扒開部分在基部橫向切掉，形成一個中間是花絲周圍是苞葉的圓形斷面；
4.施入誘導(dǎo)劑
用20cm敷料鑷夾取紙漿糊，將其放在斷面上并使其與斷面密切接觸，填充切割后所形成的空間，之后將被扒開的苞葉復(fù)回原位，使紙漿糊包在苞葉內(nèi)。最后將紙袋套回，完成處理過程。
[0012]由于紙漿糊充滿藥液，加之鮮嫩的苞葉保濕保水能力較強，可使花絲較長時間保持與藥液接觸；又由于花粉遇到處理液后會因吸收藥液而膨脹死亡，斷面上即使有花粉落入也不會造成任何污染。因此，徹底解決了花粉污染問題，確保種子真實可靠。處理時，不需要密封、遮擋或時間隔離，整個過程在完全開放條件下自由操作。
[0013]5.鑒定與繁殖
種子成熟時收獲，即得到基因型純合的二倍體種子；下一季播種，按常規(guī)方法套袋自交，根據(jù)表型進行真?zhèn)魏蛢?yōu)劣鑒定，淘偽劣植株，得到單穗。并可以其作父本提前測配；將收獲的果穗繼續(xù)播種下一代，種成穗行，根據(jù)植株、果穗、籽粒等性狀的一致性鑒別出純合穗行，選擇符合育種目標(biāo)的穗行，即獲得純合的玉米自交系。在此世代可進行大量測配。
[0014]本發(fā)明的積極效果如下:
1.徹底解決了現(xiàn)有化學(xué)誘導(dǎo)方法的花粉污染問題
由于半固態(tài)的含有大量處理液的紙漿糊覆蓋了花絲和整個切面，即使有花粉落入也會因花粉遇到處理液后而膨脹死亡。因此，徹底解決了現(xiàn)有的化學(xué)誘導(dǎo)技術(shù)中難以解決的花粉污染問題。
[0015]2.操作時無需任何隔離
誘導(dǎo)處理時不需要在套袋、遮擋、隔離區(qū)或時間隔離條件，可在完全開放條件下和在任何時間里自由操作。
[0016]3.誘導(dǎo)率提高
使所有花絲的斷面都能與藥液接觸，避免了注射法和涂抹法與藥液接觸少的問題。又使藥液停留時間延長，因而提高了誘導(dǎo)率。
[0017]4.可規(guī)模化應(yīng)用
程序簡便，操作簡單容易，不受隔離區(qū)限制，因此可規(guī)模化應(yīng)用。
[0018]5.節(jié)省藥液
藥液集中，不發(fā)生注射法、涂抹法和噴霧法的藥液流淌、滴落、霧滴飄散等藥液浪費，降低了用藥成本。
[0019]6.程序簡單
直接形成二倍體種子。不需要Stock 6誘導(dǎo)單倍體技術(shù)的染色體加倍、種子鑒別程序，不存在種子鑒別難的問題。
[0020]7.選育速度快
比常規(guī)玉米自交系選育方法的選育周期縮短5代以上。由于可確保誘導(dǎo)結(jié)籽的真實性，因此從單株世代開始就可以其作父本提前測配，雜交種選育速度比Stock 6誘導(dǎo)技術(shù)還要提前I代。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
(I)配制誘導(dǎo)劑
選用市場上銷售的48%濃度氟樂靈，用水稀釋成80 ymol/L濃度的誘導(dǎo)劑。
[0022](2)制備紙漿糊
采用市場上出售的生活用卷紙，將適量的卷紙和誘導(dǎo)劑藥液加入容器中，攪拌成稀的紙漿糊，其稀稠程度以用20cm敷料鑷能夾取即可。
[0023](3)選擇處理材料
處理對象為玉米雜交種“遼單565”。
[0024](4)處理果穗
在吐絲前對雌穗套袋；當(dāng)花絲完全吐出時，摘掉紙袋，在雌穗花苞頂部、幼穗以上位置將外部的多層苞葉向下扒開，僅剩下花絲和貼近花絲的內(nèi)層苞葉，之后用刀片將其未被扒開部分在基部橫向切掉，形成一個中間是花絲周圍是苞葉的圓形斷面。
[0025](5)施入誘導(dǎo)劑
用20cm敷料鑷夾取紙漿糊，將盡量多的紙漿糊放在斷面上并使其與斷面密切接觸，填充切后形成的空間，之后將被扒開的苞葉復(fù)回原位，使紙漿糊包在苞葉內(nèi)。最后將紙袋套回，完成處理過程。處理50穗。
[0026](6)收獲
成熟時收獲果穗，收獲90粒種子，做好標(biāo)記。
[0027](7)鑒定與繁殖
在下一季將種子單粒播種，淘汰