褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的NlAKTIP基因、編碼蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的 Nl AKTIP 基因、編碼蛋白及其應(yīng)用。調(diào)控褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育的AKT互作蛋白編碼基因 NlAKTIP ，含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列及其同源突變序列，該基因在維持褐飛虱正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能，其功能受到抑制會(huì)導(dǎo)致褐飛虱生長(zhǎng)變緩，體型變小，成蟲羽化時(shí)間推遲。所述的褐飛虱 NlAKTIP 基因編碼的蛋白，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列及其同源突變序列，該基因功能受到抑制會(huì)導(dǎo)致褐飛虱生長(zhǎng)變緩，體型變小，成蟲和羽化時(shí)間推遲。所述的褐飛虱 NlAKTIP 基因的RNA干擾在控制褐飛虱方面的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)該基因成功實(shí)施了RNA干擾，結(jié)果表明害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育受到明顯抑制，體型減小，體重減輕，成蟲羽化時(shí)間延遲。
【專利說(shuō)明】褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的NIAKTIP基因、編碼蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因、編碼蛋白及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 褐飛虱（Nilaparvata .Stlil )是一種遠(yuǎn)距離遷飛性水稻害蟲，主要以刺吸 韌皮部汁液和傳播水稻病毒的方式為害水稻植株。近年來(lái)，褐飛虱已發(fā)展成為亞洲稻區(qū)的 重要害蟲，常年危害面積在2, 000萬(wàn)hm2以上，造成稻谷產(chǎn)量損失數(shù)十億公斤（林擁軍等， 2011)。目前，針對(duì)褐飛虱的主要應(yīng)急防治措施為噴施化學(xué)農(nóng)藥。化學(xué)農(nóng)藥的大量濫用，不僅 嚴(yán)重污染環(huán)境，而且長(zhǎng)期施用化學(xué)農(nóng)藥可誘使褐飛虱產(chǎn)生抗藥性（王鵬等，2013)。在防治 褐飛虱的農(nóng)藥中，曾經(jīng)發(fā)揮過(guò)較好效果的有效農(nóng)藥，如氟蟲腈、吡蟲啉、噻嗪酮等，均已淘汰 出局或限制使用，而近年出現(xiàn)的取代農(nóng)藥品種數(shù)量不多，很多地方在開展防治時(shí)，在農(nóng)藥的 選擇上感到策手無(wú)策，化學(xué)防治面臨防不勝防的尷尬局面。究其原因，此類化學(xué)農(nóng)藥多以大 規(guī)模高強(qiáng)度殺滅害蟲為目標(biāo)，但是，由于褐飛虱種群遺傳多樣性非常復(fù)雜等現(xiàn)實(shí)原因，其中 往往有部分個(gè)體能夠存活下來(lái)，高選擇壓的作用結(jié)果，最終會(huì)導(dǎo)致適應(yīng)性更強(qiáng)的種群形成。 另一方面，化學(xué)農(nóng)藥在殺死害蟲的同時(shí)，也會(huì)危及包括天敵在內(nèi)的非靶標(biāo)生物，不可避免的 會(huì)給農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)造成負(fù)面影響，生態(tài)防治功能沒(méi)有等到應(yīng)有的發(fā)揮。因此，調(diào)整目前的褐 飛虱防治策略勢(shì)在必行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種在褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用 的基因 N1AKTIP、編碼蛋白及其應(yīng)用。對(duì)該基因成功實(shí)施了 RNA干擾，結(jié)果表明害蟲的生長(zhǎng) 發(fā)育受到明顯抑制，體型減小，體重減輕，成蟲羽化時(shí)間延遲。
[0004] 本發(fā)明首先在研究思路上進(jìn)行創(chuàng)新，即改變了現(xiàn)有化學(xué)防治以"殺滅"為目標(biāo)的褐 飛虱防治策略，可以避免高選擇壓力下，強(qiáng)抗藥性種群的形成。本發(fā)明注重從整體上弱化害 蟲種群的致害能力，而不以殺滅為目標(biāo)。一方面，通過(guò)抑制害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，控制褐飛虱體 型，減少害蟲取食的直接為害；另一方面，根據(jù)褐飛虱的遷飛特性，在防控區(qū)適宜爆發(fā)的時(shí) 間窗口有限等特點(diǎn)，通過(guò)延遲成蟲的羽化時(shí)間，減少害蟲的世代更替速度，控制種群基數(shù)， 降低在適宜氣候條件下蟲害爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種調(diào)控褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育的AKT互作蛋白編碼基因 N1AKTIP，含有SEQ ID NO: 1所 示的核苷酸序列及其同源突變序列，該基因在維持褐飛虱正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要 功能，其功能受到抑制會(huì)導(dǎo)致褐飛虱生長(zhǎng)變緩，體型變小，成蟲羽化時(shí)間推遲。
[0007] 所述的褐飛虱N1AKTIP基因編碼的蛋白，含有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列及 其同源突變序列，該基因功能受到抑制會(huì)導(dǎo)致褐飛虱生長(zhǎng)變緩，體型變小，成蟲和羽化時(shí)間 推遲。
[0008] -種所述的褐飛虱N1AKTIP基因的RNA干擾在控制褐飛虱方面的應(yīng)用。
[0009] 所述N1AKTIP基因的RNA干擾抑制褐飛虱的生長(zhǎng)，導(dǎo)致褐飛虱體型變小，體重減 輕，減輕褐飛虱的取食量和危害程度。
[0010] 所述N1AKTIP基因的RNA干擾遲滯褐飛虱的羽化，延長(zhǎng)世代周期，抑制種群增長(zhǎng)速 度，減輕褐飛虱危害程度。
[0011] 所述的應(yīng)用，基于該核酸和蛋白序列用于農(nóng)藥研發(fā)和生物防治。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：（1)褐飛虱生長(zhǎng)受到抑制，體型減小，可以減輕害蟲取食對(duì)水 稻作物的直接危害。（2)褐飛虱為r-對(duì)策者，采取最大生殖策略，因此，世代更替速度對(duì)種 群的放大具有非常重要的作用。本發(fā)明可以遲滯褐飛虱的羽化時(shí)間達(dá)到8天以上，減緩了 褐飛虱世代更替的速度，降低了在有限時(shí)間窗口蟲災(zāi)爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。（3)本發(fā)明雖然抑制了褐 飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育，但對(duì)害蟲的存活率沒(méi)有造成顯著影響，可以避免噴施農(nóng)藥實(shí)踐中高選擇 壓導(dǎo)致強(qiáng)抗藥性種群的后果。（4)本發(fā)明避免對(duì)天敵等非靶標(biāo)生物的傷害，有望在實(shí)現(xiàn)抑制 害蟲的同時(shí)，充分發(fā)揮生態(tài)防治的功能。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是褐飛虱AKTIP 5' RACE電泳圖。
[0014] 圖中，產(chǎn)物-627bp，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0015] 圖2是褐飛虱AKTIP 3' RACE電泳圖；
[0016] 圖中，產(chǎn)物_499bp，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0017] 圖3是褐飛虱AKTIP全長(zhǎng)cDNA電泳圖；
[0018] 圖中，cDNA964bp，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0019] 圖4是AKTIP在不同褐飛虱種群懷卵雌蟲中的表達(dá)規(guī)律分析。
[0020] 圖5是AKTIP基因干擾片段dsRNA的電泳圖；
[0021] 圖中，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；合成的dsAKTIP 390bp ;合成的dsGFP 350bp。
[0022] 圖6是褐飛虱取食營(yíng)養(yǎng)液，dsGFP，dsAKTIP后mRNA表達(dá)量變化；
[0023] 圖中，數(shù)值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤；和分別表示統(tǒng)計(jì)分析表明飼喂?fàn)I養(yǎng)液與 飼喂dsAKTIP存在顯著（T檢驗(yàn)，P〈0. 05)和極顯著差異（T檢驗(yàn)，P〈0. 01)。
[0024] 圖7是褐飛虱取食營(yíng)養(yǎng)液，dsGFP，dsAKTIP對(duì)存活率的影響；
[0025] 圖中數(shù)值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤；和分別表示統(tǒng)計(jì)分析表明飼喂?fàn)I養(yǎng)液與 飼喂dsAKTIP存在顯著（T檢驗(yàn)，P〈0. 05)和極顯著差異（T檢驗(yàn)，P〈0. 01)。
[0026] 圖8是褐飛虱取食營(yíng)養(yǎng)液，dsGFP，dsAKTIP對(duì)羽化速率的影響；
[0027] 圖中，數(shù)值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤；和"**"分別表示統(tǒng)計(jì)分析表明飼喂?fàn)I養(yǎng)液與 飼喂dsAKTIP存在顯著（T檢驗(yàn)，P〈0. 05)和極顯著差異（T檢驗(yàn)，P〈0. 01)。
[0028] 圖9是取食營(yíng)養(yǎng)液，dsGFP，dsAKTIP褐飛虱的體重大小；
[0029] 圖中，數(shù)值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤；和分別表示統(tǒng)計(jì)分析表明飼喂?fàn)I養(yǎng)液與 飼喂dsAKTIP存在顯著（T檢驗(yàn)，P〈0. 05)和極顯著差異（T檢驗(yàn)，P〈0. 01)。
[0030] 圖10是不同類型營(yíng)養(yǎng)液喂養(yǎng)的褐飛虱體型比較；
[0031] 圖中，上：背面，下：腹面；從左往右分別是：營(yíng)養(yǎng)液，dsGFP，dsAKTIPO. 02， dsAKTIPO. I, dsAKTIPO. 5。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 1.材料與方法
[0035] I. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0036] 供試蟲源為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)于水稻品種TNl上的褐飛虱種群，室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為 26±2°C，相對(duì)濕度80% ±5%，光周期16L:8D。
[0037] 1. 2主要試劑
[0038] RNA 提取試劑 TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen 公司；RACE 試劑盒（BD SMART RACE Amplification Kit)購(gòu)自 Clontech 公司；凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit)購(gòu)自 Axygen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser)、突光定 量 PCR 試劑 SYBR Premix EX Taq、PCR 相關(guān)試劑、pMD-18T vector、DL2000DNA Marker 購(gòu) 自 TaKaRa 公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（MEGAscript T7High Yield Transcription Kit)購(gòu)自 Ambion 公司；Ampicillin，DEPC 購(gòu)自 BBI 公司。
[0039] 1. 3主要儀器
[0040] 突光定量 PCR 儀（ABI step one plus) ;PCR 儀（Bio-Rad My Cycler); 核酸電泳儀（Bio-Rad);微量移液器（eppendorf、Rainin);蛋白核酸定量分析儀 Nanodrop2000 (Thermo);凝膠成像分析系統(tǒng)（GeneGenius);超低溫冰箱；冷凍離心機(jī) (eppendorf);電子天平；高壓滅菌鍋；超凈工作臺(tái)。
[0041] 1.4 引物
[0042] 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供的AKT互作蛋白基因 N1AKTIP核心序列及后續(xù)測(cè)序信息，應(yīng) 用Primer Premier 5. 0和01 igo7. 55軟件設(shè)計(jì)引物（表1)。引物送鉬尚生物技術(shù)（上海） 有限公司合成。
[0043] 表1克隆、熒光定量PCR及合成dsRNA所涉及到的引物
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育的AKT互作蛋白編碼基因 Λ7Α?Τ7戶，其特征在于，含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列及其同源突變序列，該基因在維持褐飛虱正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程 中發(fā)揮重要功能，其功能受到抑制會(huì)導(dǎo)致褐飛虱生長(zhǎng)變緩，體型變小，成蟲羽化時(shí)間推遲。
2. -種如權(quán)利要求1所述的褐飛虱基因編碼的蛋白，其特征在于，含有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列及其同源突變序列，該基因功能受到抑制會(huì)導(dǎo)致褐飛虱生長(zhǎng)變緩， 體型變小，成蟲和羽化時(shí)間推遲。
3. -種如權(quán)利要求1所述的褐飛虱基因的RNA干擾在控制褐飛虱方面的應(yīng) 用。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因的RNA干擾抑制褐飛虱的 生長(zhǎng)，導(dǎo)致褐飛虱體型變小，體重減輕，減輕褐飛虱的取食量和危害程度。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因的RNA干擾遲滯褐飛 虱的羽化，延長(zhǎng)世代周期，抑制種群增長(zhǎng)速度，減輕褐飛虱危害程度。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，基于該核酸和蛋白序列用于農(nóng)藥研發(fā)和生 物防治。
【文檔編號(hào)】A01N57/16GK104293797SQ201410542681
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】郝培應(yīng), 俞曉平, 陸潮峰, 申屠旭萍, 朱家駿, 馮婭琳 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院