專利名稱：沿階草胚狀體誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種沿階草胚狀體誘導(dǎo)及 培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
沿階草(Ophi叩ogonjaponicus )乂名麥冬，屬百合科單子葉植物。沿階草植 株低矮，四季常綠，具有抗逆性強(qiáng)，耐熱、抗病抗蟲(chóng)性好，喜光、耐陰，無(wú)需 太多修剪等性質(zhì)，近年來(lái)成為園林中不可或缺的構(gòu)景植物和草坪地被植物。而 且沿階草具有藥用性，是用藥調(diào)劑量的品種之一。因其用途廣泛，近年來(lái)對(duì)沿階 草的需求量逐年上升。
但沿階草結(jié)實(shí)率低、種子繁殖難。通常沿階草采用分株繁殖或施用多效唑 提高產(chǎn)量，但分株繁殖繁殖系數(shù)極低，生長(zhǎng)緩慢，而且長(zhǎng)期無(wú)性繁殖，導(dǎo)致沿階 草品種退化，多發(fā)病毒病，影響產(chǎn)量和質(zhì)量；而施用多效唑，會(huì)嚴(yán)重影響沿階 草品質(zhì)。
人們?cè)噲D通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)大量快速繁殖具有良好特性的沿階草種苗?，F(xiàn) 有的沿階草組培快繁報(bào)道，均是由器官發(fā)生的再生植株，即首先是通過(guò)芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽，之后是繼代增殖培養(yǎng)基擴(kuò)繁芽，最后是生根培養(yǎng)基生根。(楊 乃博，沿階草葉片愈傷組織的誘導(dǎo)與其植株再生植物，生理學(xué)通訊，1992， 28 (5) : 365;雷家容等，麥冬組培與快速繁殖技術(shù)研究，西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005， 18 (3) : 368-369;王蔚等，川麥冬脫病毒和組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，藥物生物 技術(shù)，2006， 13 (4) : 274-278;史清云等，日本矮生沿階草的快繁技術(shù)，江 蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007， (3) : 132-133 ;鄭志仁等，黑麥冬的組織培養(yǎng)和快速繁 殖，植物生理學(xué)通訊，2008， 44 (1) : 119-120)。這種培養(yǎng)過(guò)程將幾種基本 培養(yǎng)基和激素配合使用，不僅培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成本高，而且在組培過(guò)程中易發(fā)生變 異，也不是最好的育種材料，更達(dá)不到種苗脫毒、提純復(fù)壯的作用。
絕大多數(shù)體細(xì)胞胚源于單細(xì)胞，胚狀體再生系統(tǒng)是制造人工種子、誘導(dǎo)體細(xì)胞變異或基因轉(zhuǎn)化的理想的受體系統(tǒng)。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑重演了合子 胚形態(tài)發(fā)生的過(guò)程，也是快速繁殖、高效再生種子來(lái)源困難植株的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種沿階草胚狀體誘導(dǎo) 及培養(yǎng)方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種沿階草胚狀體誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法， 其特征在于包括以下步驟
(1) 、采用沿階草的芽基部作外植體，清洗、消毒殺菌，在無(wú)菌苗培養(yǎng)基 上培養(yǎng)無(wú)菌苗；
(2) 、將無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接到初生胚狀體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，將胚性愈傷組 織繼代培養(yǎng)，分化形成初生胚狀體；
(3) 、將初生胚狀體轉(zhuǎn)接到次生胚狀體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)次生胚狀體；
(4) 、將次生胚狀體轉(zhuǎn)接至成苗培養(yǎng)基上產(chǎn)生完整植株；
(5) 、組栽苗的移栽和成活。 前述沿階草胚狀體誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法，其特征在于所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基為
1/2MS + 3 5 mg/L GA+l 3mg/L BA+0. 1 mg/L IBA +蔗糖20g/L +0.7%瓊脂； 所述初生胚狀體培養(yǎng)基為MS+0. 1 0. 5 mg/L BA+ 0. 1 0. 5 mg/L NAA+0. 5
1 mg/L 2. 4D+蔗糖30g/L +0. 7%瓊脂；所述次生胚狀體培養(yǎng)基為MS+2 4 mg/L
BA + 0. 2 0. 5mg/L NAA +白糖30g+0. 7%瓊脂; 所述成苗培養(yǎng)基為MS+蔗糖30g+0. 7%瓊脂。
所述步驟1的培養(yǎng)條件溫度25士rC，光照強(qiáng)度為500-10001x，光照時(shí)間為 每天10-14小時(shí)。
本發(fā)明的有益效果是體細(xì)胞胚胎形成的胚狀體是兩極結(jié)構(gòu)，具有胚根和 胚芽，不僅能形成根葉正常的完整植株，而且具有再生容易，繁殖效率高、后 代性狀穩(wěn)定，快速成苗，再生植株移栽成活率高的優(yōu)點(diǎn)，并在生長(zhǎng)勢(shì)、株型結(jié) 構(gòu)上明顯優(yōu)于同期扦插苗。所以建立沿階草體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)和快速成苗體 系，不僅開(kāi)辟了沿階草產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的新途徑，而且對(duì)快速繁殖種子來(lái)源困難的沿 階草,具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明在沿階草初生胚狀體形成后對(duì)其在形成完整植株和次生胚兩個(gè)方向 上進(jìn)行調(diào)控，不僅可在短時(shí)間內(nèi)獲得完整植株，而且通過(guò)對(duì)次生胚誘導(dǎo)和分化 的調(diào)控，可大大提高成苗率。歩驟簡(jiǎn)潔，培養(yǎng)成本低，繁殖率高。僅通過(guò)葉(芽) 基部一初生胚狀體一次生胚一完整植株一個(gè)完整的循環(huán)， 一個(gè)葉(芽)基部外 植體在120天平均形成完整植株為初生胚狀體/外植體X次生胚狀體發(fā)生頻率X
次生胚狀體數(shù)/初生胚狀體X次生胚狀體成苗率=12 X 100%X 15 X 95%=171株，另 外每個(gè)芽苗及次生胚繼代后又使得胚狀體數(shù)成倍增加，按每月 一個(gè)芽平均擴(kuò)贈(zèng)5 個(gè)計(jì)算，那么單個(gè)葉(芽)基部外植體在一年中的成苗率至少為171X5X8二6840 株。


圖l:沿階草葉(芽)培養(yǎng)30天形成的初生胚； 圖2:沿階草葉(芽)培養(yǎng)45天形成的初生胚狀體和叢生芽； 圖3:初生胚狀體在次生胚狀體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成的次生胚； 圖4:初生胚狀體在成苗培養(yǎng)基上發(fā)育形成完整植株； 圖5:次生胚狀體在次生胚狀體培養(yǎng)基上發(fā)育形成的完整植株； 圖6:次生胚在次生胚狀體培養(yǎng)基上形成的大量次生胚； 圖7:細(xì)葉沿階草在次生胚狀體培養(yǎng)基上形成次生胚和完整植株； 圖8:黑沿階草在次生胚狀體培養(yǎng)基上形成次生胚和完整植株； 圖9:在穴盤中移栽成活的組培苗； 圖10:根系發(fā)育良好的穴盤苗。
具體實(shí)施例方式
1、菌苗培養(yǎng)取沿階草健康植株，切除根及基部老莖段，依次剝?nèi)ダ先~片，
只留下包裹莖尖的幼嫩葉片6張，先在自來(lái)水下沖洗l 2h，然后用洗滌劑浸泡IO min，再用自來(lái)水沖洗數(shù)遍，無(wú)菌水沖洗4 6次，用2。/。次氯酸鈉消毒15min，無(wú)菌 水沖洗4 6次，吸干表面水分，在超凈工作臺(tái)上將材料放入O. 1%升汞溶液中消 毒8min，無(wú)菌水沖洗8 10次，剝?nèi)ネ饷? 3張葉片，將包裹莖尖的幼嫩葉片2 3張接種于1/2MS + GA 5mg/L+BA3mg/L十IBA 0. 1 mg/ L+蔗糖20g/L+0. 7%瓊脂 無(wú)菌苗培養(yǎng)基中無(wú)菌萌發(fā)。培養(yǎng)條件溫度為25士rC，光照強(qiáng)度為500 10001x，光時(shí)間為10 14h，培養(yǎng)25 30天莖尖分化出苗。
2、 初生胚的誘導(dǎo)和繼代剪取無(wú)菌苗葉(芽)基部接入MSJ (MS+BA 0. lmg/L+ NAA 0.5 mg/L+2. 4D0. 5mg/L+蔗糖30g/L +瓊脂O. 7%)初生胚狀體培養(yǎng)基上，每 瓶接2片。5 7天開(kāi)始有愈傷形成，20天后開(kāi)始形成淡黃色胚性愈傷組織，30天 后有顆粒狀或盤旋條狀胚狀體，愈傷組織團(tuán)塊產(chǎn)生白色或綠色芽點(diǎn)，45天后有 大量初生胚狀體產(chǎn)生，平均12個(gè)。
3、 次生胚的誘導(dǎo)和繼代將初生胚狀體轉(zhuǎn)入次生胚狀體培養(yǎng)基(MS +BA 2 mg/ L+ NAA 0.5 mg/ L+蔗糖30g/L +瓊脂O. 7%)中誘導(dǎo)和繼代，65 70%的初 生胚狀體會(huì)形成完整植株，其余初生胚和胚性愈傷組織上會(huì)形成大量次生胚， 平均為15個(gè)次生胚/初生胚，且次生胚畸形率很低(《2%)，個(gè)體健壯，質(zhì)量較 初生胚狀體要高。
4. 完整植株的產(chǎn)生將次生胚狀體轉(zhuǎn)入新鮮配制的次生胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中 后，在25天左右大部分直接發(fā)育成完整植株，但根不象正常根那樣細(xì)長(zhǎng)發(fā)綠， 而是較粗發(fā)白，少部分會(huì)繼續(xù)產(chǎn)生次生胚，因而次生胚培養(yǎng)基也可以作為次生 胚的繼代培養(yǎng)基，重復(fù)循環(huán)繼代獲得再生植株。將次生胚轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基(MS + 白糖30g+0.7。/。瓊脂)中，次生胚不再形成，25天后統(tǒng)計(jì)成苗率達(dá)到90%， 35天 后達(dá)到100%，植株健壯，根細(xì)長(zhǎng)發(fā)綠。
5. 組培苗的移栽與成活當(dāng)根長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，揭去培養(yǎng)瓶的封口膜，在室 內(nèi)煉苗2 3d，從瓶中取出小苗，小心洗凈根上附著的培養(yǎng)基后，移栽到裝有基 質(zhì)(泥炭園土=2:1)的穴盤中，溫室溫度為22"C 28。C，空氣相對(duì)濕度為80% 90%，適當(dāng)遮蔭，使光照強(qiáng)度為50 70%自然光，或?qū)⒁圃院玫男∶绶诺矫绱蚕拢?及時(shí)噴霧，在移栽后的前20d內(nèi)，要始終保持種苗濕潤(rùn)，20d后逐漸減少噴霧次 數(shù)，40d后移栽于肥沃的砂壤土里，注意保溫保濕，小苗的成活率為95%以上。 通常選擇天氣溫暖的陰天移栽成活率最高(可達(dá)98%以上)。而在苗床培養(yǎng)二個(gè) 月的小苗生長(zhǎng)旺盛，對(duì)移栽大田的條件要求也不高，極易種植大田，成活率可達(dá) 100%。
實(shí)施例l
取矮生沿階草的健康植株，切除根及基部老莖段，依次剝?nèi)ダ先~片，只留下包裹莖尖的幼嫩葉片6張，先在自來(lái)水下沖洗1-2h左右，然后用洗滌劑溶液浸泡
10min，再用自來(lái)水反復(fù)沖洗數(shù)遍，無(wú)菌水沖洗4 6次，用2。/。次氯酸鈉消毒15min , 并用無(wú)菌紙吸干表面水分；在超凈工作臺(tái)上將材料放入O. 1%升汞溶液中消毒8 min ，無(wú)菌水沖洗8 10次，剝?nèi)ネ鈱尤~片，將包裹莖尖的幼嫩外植體接種于已經(jīng) 過(guò)高壓滅菌的盛有25ml的l/2MS + GA(5mg/L)+BA(3mg/L) + IBA (0.1mg/L)+蔗糖 20g/L+0.7呢瓊脂培養(yǎng)基(pH值5. 8-6.0，下同)的三角瓶中，每瓶3個(gè)，無(wú)菌培養(yǎng)， 溫度為白天25士2。C，晚上20士2。C，光照強(qiáng)度為500 1000 1x.，光照時(shí)間為10 14h，培養(yǎng)25-30天莖尖分化出苗。取無(wú)菌苗葉(芽)基部接入高壓滅菌過(guò)的盛有 25ml的MS+BA(0. 2 mg/L) + NAA(O. 5 mg/L)+2. 4D (0. 5 mg /L)+蔗糖30g/ L +0. 7% 瓊脂培養(yǎng)基上，每瓶接4片(附圖l) 。 26-45天后有顆粒狀綠芽或盤旋條狀初生 胚狀體形成(附圖1和圖2)，將初生胚狀體轉(zhuǎn)入次生胚狀體培養(yǎng)基(MS +BA 2mg/L+ NAA 0. 5mg/L +蔗糖30§/1^ +0.7%瓊脂)誘導(dǎo)及繼代，會(huì)產(chǎn)生大量次生胚狀體和 完整植株(附圖3、 4)，或?qū)⒊跎郀铙w轉(zhuǎn)入無(wú)激素的成苗培養(yǎng)基(MS+白糖30g/ L+0.7。/。瓊脂)，可終止次生胚的形成，20-26天后產(chǎn)生完整植株，但成苗率較低 (附圖5)。若將芽苗繼代在次生胚狀體培養(yǎng)基中，大部分會(huì)在23-30天內(nèi)繼續(xù)產(chǎn) 生再生植株(附圖6)，單個(gè)葉(芽)外植體在一年中的增值率最低為6000-7500
實(shí)施例2
取細(xì)葉沿階草的健康植株，切除根及基部老莖段，依次剝?nèi)ダ先~片，只留 下包裹莖尖的幼嫩葉片6張，先在自來(lái)水下沖洗1-2h，然后用洗滌劑溶液浸泡IO min，再用自來(lái)水反復(fù)沖洗數(shù)遍，無(wú)菌水沖洗4 6次，用2%次氯酸鈉消毒10 min， 并用無(wú)菌紙吸干表面水分；在超凈工作臺(tái)上將材料放入O. 1%升汞溶液中消毒 15min，無(wú)菌水沖洗8 10次，剝?nèi)ネ鈱尤~片，將包裹莖尖的幼嫩外植體接種于己 經(jīng)過(guò)高壓滅菌的盛有251111的1/21^+0眾(31^/0十8厶(21^幾)+工BA(O. lmg/L)十蔗糖 20g/L+0.7。/。瓊脂培養(yǎng)基(pH值5. 8-6.0，下同)的三角瓶中，每瓶3個(gè)，無(wú)菌培養(yǎng)， 溫度為白天25士2。C,晚上20士2。C，光照強(qiáng)度為500 1000 1x.，光照時(shí)間為10 14h，培養(yǎng)25-30天莖尖分化出苗。取無(wú)菌苗葉(芽)基部接入高壓滅菌過(guò)的盛有 25ml的MS+BA(0. 5mg/L)+ NAA(O. 1 mg/L)+2. 4D(0. 5rag/L)+蔗糖3(^/ L+0. 7%瓊脂培養(yǎng)基上，每瓶接4片，26-45天后有棒狀綠芽或盤旋條狀初生胚狀體形成，將初 生胚狀體轉(zhuǎn)入次生胚狀體培養(yǎng)基(MS +BA2mg/L+ NAAO. 2mg/L+白糖30g/ L +0. 7% 瓊脂)誘導(dǎo)和繼代，會(huì)產(chǎn)生大量次生胚狀體和完整植株(附圖7)，或?qū)⒊跎?狀體轉(zhuǎn)入無(wú)激素的成苗培養(yǎng)基(MS +白糖30#0.7%瓊脂)，可終止次生胚的形 成，20-26天后產(chǎn)生完整植株，但成苗率較低。若將芽苗繼代在次生胚狀體培養(yǎng) 基中，大部分會(huì)在20-25天內(nèi)繼續(xù)產(chǎn)生再生植株，單個(gè)葉(芽)外植體在一年中的 增值率最低為7500-9000株。 實(shí)施例3
將黑沿階草按矮生沿階草和細(xì)葉沿階草相同的實(shí)施方式進(jìn)行無(wú)菌苗的培養(yǎng) (培養(yǎng)基1/2^^+0八(4:118/0+8八(11^/10+ IBA(O. lmg/L) +白糖20g/ L +0. 7%瓊脂)， 初生胚狀體(培養(yǎng)基MS+BA(0. lmg/L)+ NAA(O. 2 mg/L)+2. 4D(lmg/L)+蔗糖30§/ L +0.7%瓊脂)及次生胚狀體(培養(yǎng)基MS+BA(4mg/L)+ NAA(0.2 mg/L) +蔗糖30§/ L +0. 7%瓊脂)的誘導(dǎo)和繼代。在此需要指出的是黑沿階草是一個(gè)較難再生的品種， 本發(fā)明人以SH改良培養(yǎng)基、B5和Ne培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同類型的激素對(duì) 其進(jìn)行胚狀體的誘導(dǎo)，均未能得到理想的胚狀體發(fā)生率。而使用MS初生胚狀體 培養(yǎng)基，最初的無(wú)菌苗外植體長(zhǎng)出初生胚狀體至少要三個(gè)月，在初生胚狀體培 養(yǎng)基中繼代3次才會(huì)有大量胚狀體產(chǎn)生，比率為70%，但用胚狀體再生苗的葉(芽) 基部再在初生胚狀體培養(yǎng)基上進(jìn)行初生胚狀體的誘導(dǎo)和繼代，就會(huì)縮短時(shí)間， 大約45天左右就有大量初生胚狀體產(chǎn)生，平均為16個(gè)初生胚/再生葉(芽)，比率 為95%，將初生胚狀體轉(zhuǎn)入次生胚狀體培養(yǎng)和繼代，95%的初生胚會(huì)產(chǎn)生大量次 生胚和完整植株，平均為12個(gè)次生胚/初生胚，將次生胚轉(zhuǎn)入同上述實(shí)施相同的 成苗培養(yǎng)基中，30天后統(tǒng)計(jì)形成完整植株率為90%， 50-60天后形成完整植株率 為100%。因此黑沿階草單個(gè)無(wú)菌苗外植體一初生胚狀體一次生胚狀體一完整植 株單一一個(gè)循環(huán)，180天時(shí)間內(nèi)的有效增殖率為70%乂95%乂12乂90%=7株，后 半年按45天增殖一次，則在一年中的增殖率最低為7X 16X95°/。X 12X90%X 4=4596株。
以上已以較佳實(shí)施例公開(kāi)了本發(fā)明，然其并非用以限制本發(fā)明，凡采用等 同替換或者等效變換方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種沿階草胚狀體誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、采用沿階草的芽基部作外植體，清洗、消毒殺菌，在無(wú)菌苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌苗；(2)、將無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接到初生胚狀體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，將胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)，分化形成初生胚狀體；(3)、將初生胚狀體轉(zhuǎn)接到次生胚狀體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)次生胚狀體；(4)、將次生胚狀體轉(zhuǎn)接至成苗培養(yǎng)基上產(chǎn)生完整植株；(5)、組栽苗的移栽和成活。所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基為1/2MS+3～5mg/L GA+1～3mg/L BA+0.1mg/L IBA+蔗糖20g/L+0.7％瓊脂；所述初生胚狀體培養(yǎng)基為MS+0.1～0.5mg/L BA+0.1～0.5mg/L NAA+0.5～1mg/L2.4D+30g/L蔗糖+0.7％瓊脂；所述次生胚狀體培養(yǎng)基為MS+2～4mg/L BA+0.2～0.5mg/L NAA+白糖30g/L+0.7％瓊脂；所述成苗培養(yǎng)基為MS+蔗糖30g/L+0.7％瓊脂。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種沿階草胚狀體誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法，其特征在于所 述步驟1的培養(yǎng)條件溫度25土rC，光照強(qiáng)度為500-1000k，光照時(shí)間為每天 10-14小時(shí)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種沿階草胚狀體誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法，其特征在于所 述步驟(2)中將胚性愈傷組織繼代1次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種沿階草胚狀體誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法，包括以下步驟采用沿階草的芽基部作外植體在無(wú)菌苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌苗；將無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接到初生胚狀體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)，分化形成初生胚狀體；將初生胚狀體轉(zhuǎn)接到次生胚狀體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)次生胚狀體；將次生胚狀體轉(zhuǎn)接至成苗培養(yǎng)基上產(chǎn)生完整植株。本發(fā)明在沿階草初生胚狀體形成后對(duì)其在形成完整植株和次生胚兩個(gè)方向上進(jìn)行調(diào)控，不僅可在短時(shí)間內(nèi)獲得完整植株，而且通過(guò)對(duì)次生胚誘導(dǎo)和分化的調(diào)控(誘導(dǎo)率達(dá)到100％)，成苗率提高至95％，步驟簡(jiǎn)潔，培養(yǎng)成本低，繁殖率高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101422136SQ200810244728
公開(kāi)日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者何任紅, 巫建新, 朱洪生, 晶 李, 梁慧敏, 鮑榮靜 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院