一種磺酸修飾的毛細管開管柱及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磺酸修飾的毛細管開管柱及其制備方法，屬分析化學技術領域。一種磺酸修飾的毛細管開管柱，所述毛細管開管柱的管壁上鍵合的物質(zhì)是2?丙烯酰胺?2?甲基?1?丙磺酸。本發(fā)明通過在石英熔融毛細管內(nèi)壁上修飾上磺酸基，以改變其原有的物理化學性質(zhì)，相對于未修飾的毛細管具有能夠有效減少一些生物活性物質(zhì)在石英毛細管管壁上的吸附，使毛細管的性能更加穩(wěn)定。
【專利說明】
_種橫酸修飾的毛細管開管柱及其制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種毛細管柱及其制備方法，具體涉及一種磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，屬于分析化學領域。
【背景技術】
[0002]毛細管電泳自首次報道以來，已經(jīng)發(fā)展成為分析生物活性肽及氨基酸類物質(zhì)的重要工具。與一些傳統(tǒng)的分析技術(氣相色譜或高效液相色譜)相比具有分離效率高，分析時間短，樣品需求量少等優(yōu)點。這些優(yōu)點對分析生物樣品來說至關重要，其一，生物樣品所在的基質(zhì)非常復雜，干擾較為嚴重，對它們的分離需要一種高效的分離技術。其二，生物樣品的獲得非常難，樣品量很少，這和毛細管電泳技術本身的特點相吻合。其三，很多生物活性物質(zhì)在高溫下容易變性，使得這些物質(zhì)用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜分析相當困難。
[0003]在分離生物活性肽或氨基酸等生物活性物質(zhì)時，被分析物與熔融石英毛細管管壁的相互作用會導致分離效率降低，迀移時間延長，嚴重時會致使被分析物完全吸附到石英毛細管的管壁上，使得毛細管失去分離能力。在過去的幾年時間里，人們相繼發(fā)展了一些方法用來減小或消除被分析物與管壁的相互作用，改變電滲流的大小以獲得快速分離的效果，或者用于提高系統(tǒng)的重現(xiàn)性。這些方法包括采用極端pH值，較高離子強度的緩沖溶液，添加銨鹽及兩性物質(zhì)，或采用涂層毛細管。在毛細管電泳系統(tǒng)中，采用極端PH條件下分離肽及氨基酸等生物活性物質(zhì)，由于較低PH值的緩沖溶液產(chǎn)生的電滲流非常小，使得被分析物的迀移時間很長，導致較長的分離時間。采用高濃度的緩沖溶液或者添加非揮發(fā)性的電解質(zhì)，會產(chǎn)生較大的焦耳熱導致系統(tǒng)電流的不穩(wěn)定。因此，涂層毛細管通常被認為是解決上述問題的一種最佳方式。
[0004]涂層毛細管根據(jù)制備涂層的方法不同，可大致分為三種類型，即動態(tài)吸附、物理涂布和化學鍵合。動態(tài)吸附涂層技術是在毛細管電泳緩沖溶液中加入少量預涂布的物質(zhì)，并讓緩沖液與毛細管充分平衡。該方法的優(yōu)點是，涂層被緩沖液中的涂布試劑連續(xù)更新，缺點是涂布試劑可能影響樣品和緩沖溶液性質(zhì)。物理涂布技術制備的基本過程包括對毛細管管壁的預處理、涂布、后處理等過程，適合涂布吸附性強，粘度大的試劑?；瘜W涂層技術是采用化學修飾的方法制備涂層的一種技術，其核心是利用熔融石英毛細管內(nèi)表面的硅羥基的化學性質(zhì)，使之與涂層材料分子化合成鍵?；瘜W涂層方法制備的毛細管涂層具有性能穩(wěn)定、有效時間長等優(yōu)點。
[0005]綜上所述，如何提尚毛細管的性能穩(wěn)定性以及延長其有效時間是亟待解決的冋題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，該方法制備的毛細管涂層具有性能穩(wěn)定、有效時間長等優(yōu)點，適用于分析一些生物活性小分子化合物。
[0007]本發(fā)明提供一種磺酸修飾的毛細管開管柱，所述毛細管開管柱的管壁上鍵合的物質(zhì)是2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸。
[0008]本發(fā)明提供一種磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，包括如下步驟:
[0009](I)對熔融石英毛細管進行預處理
[0010](2)對預處理過的毛細管進行硅烷化反應
[0011](3)對硅烷化反應后的毛細管進行磺酸化反應
[0012]將偶氮二異丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二異丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的質(zhì)量比為1:2-4:316.7，超聲處理，然后注入到硅烷化處理過的毛細管中，兩端封口，在70-90°C條件下反應11-13h，然后沖洗，得到所述磺酸修飾的毛細管開管柱。
[0013]進一步地，所述步驟(I)對毛細管進行預處理的過程為:熔融石英毛細管依次用去離子水、鹽酸溶液、去離子水、氫氧化鈉溶液、丙酮沖洗，然后經(jīng)氮氣吹干。
[0014]進一步地，所述步驟(2)對預處理過的毛細管進行硅烷化反應的過程為:將3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷與等體積的甲醇混合均勻，然后注射到預處理過的毛細管中，兩端封口反應，去掉封口，用甲醇沖洗毛細管，然后進行干燥，得到硅烷化反應后的毛細管。
[0015]進一步地，所述步驟(3)中將偶氮二異丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二異丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的質(zhì)量比為1: 3:316.7，超聲處理20min，然后注入到硅烷化處理過的毛細管中，兩端封口，在80°(:條件下反應12h，然后分別用甲醇和水沖洗，得到所述磺酸修飾的毛細管開管柱。
[0016]本發(fā)明通過在石英熔融毛細管內(nèi)壁上修飾上磺酸基，以改變其原有的物理化學性質(zhì)，相對于未修飾的毛細管具有能夠有效減少一些生物活性物質(zhì)在石英毛細管管壁上的吸附，使毛細管的性能更加穩(wěn)定。
【附圖說明】
[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0018]圖1為一種磺酸修飾的毛細管開管柱制備示意圖；
[0019]圖2為未修飾的熔融石英毛細管的掃描電鏡圖；
[0020]圖3為磺酸修飾的熔融石英毛細管的掃描電鏡圖；
[0021]圖4為未修飾的熔融石英毛細管和制備的磺酸修飾的熔融石英毛細管的電滲流表征圖；
[0022]圖5為未修飾的熔融石英毛細管和制備的磺酸修飾的熔融石英毛細管分離4種生物活性肽對比譜圖；
[0023]圖6為未修飾的熔融石英毛細管和制備的磺酸修飾的熔融石英毛細管分離3種氨基酸對比譜圖。
【具體實施方式】
[0024]下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限定。
[0025]實施例1:磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，包括如下步驟:
[0026](I)對毛細管進行預處理
[0027]I)去離子水沖洗0.5h;
[0028]2)2mol/L 鹽酸溶液沖洗 0.5h;
[0029]3)去離子水沖洗0.5h;
[0030]4) 2mo I/L氫氧化鈉溶液沖洗0.5h ；
[0031]5)丙酮沖洗0.511;
[0032]6)將經(jīng)上述處理后的毛細管接到氣相色譜上，將柱溫箱溫度設置為200°C，通高純N2條件下熱處理I小時備用；
[0033]預處理步驟使石英毛細管管壁裸露硅羥基的數(shù)目增多，提高了毛細管涂層的重現(xiàn)性。
[0034](2)對預處理過的毛細管進行硅烷化反應
[0035]將3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷與等體積的甲醇混合均勻，然后注射到預處理過的毛細管中，兩端封口，在80°C下反應12h，去掉封口，用甲醇沖洗毛細管，以洗掉沒有反應的殘留溶劑，然后在80°C條件下用他進行吹風干燥，得到硅烷化反應后的毛細管；
[0036](3)對硅烷化反應后的毛細管進行磺酸化反應
[0037]將10.0mg的偶氮二異丁腈和20.0mg的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到4.0OmL的甲醇溶液中，超聲處理20min，然后注入到硅烷化處理過的毛細管中，兩端封口，在70°C條件下反應13h，然后分別用甲醇和水沖洗毛細管以除掉未反應的物質(zhì)。
[0038]實施例2:磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，包括如下步驟:
[0039](I)對熔融石英毛細管進行預處理
[0040]I)去離子水沖洗Ih;
[0041 ] 2)2mol/L 鹽酸沖洗 Ih;
[0042]3)去離子水沖洗Ih;
[0043]4)2mol/L氫氧化鈉沖洗Ih;
[0044]5)丙酮沖洗Ih;
[0045]6)將經(jīng)上述處理后的毛細管接到氣相色譜上，將柱溫箱溫度設置為200°C，通高純N2條件下熱處理I小時備用；
[0046](2)對預處理過的毛細管進行硅烷化反應將3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷與等體積的甲醇混合均勻，然后注射到預處理過的毛細管中，兩端封口，在80°C下反應12h，去掉封口，用甲醇沖洗毛細管，以洗掉沒有反應的殘留溶劑，然后在80°C條件下用犯進行吹風干燥，得到娃燒化反應后的毛細管；
[0047](3)對硅烷化反應后的毛細管進行磺酸化反應
[0048]將10.0mg的偶氮二異丁腈和30.0mg的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到4.0OmL的甲醇溶液中，超聲處理20min，然后注入到硅烷化處理過的毛細管中，兩端封口，在80°C條件下反應12h，然后分別用甲醇和水沖洗毛細管以除掉未反應的物質(zhì)。
[0049]2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸被原位嫁接技術鍵合到石英毛細管的管壁上，減少生物活性物質(zhì)在石英毛細管管壁上的吸附，能夠快快速分離一些生物活性物質(zhì)，縮短系統(tǒng)的分析時間和提高系統(tǒng)重現(xiàn)性，達到在較低pH值條件下能夠獲得較強的電滲流的目的。
[0050]圖1為本發(fā)明的磺酸修飾的毛細管開管柱制備示意圖。圖2為未修飾的熔融石英毛細管放大5000倍后的SEM圖，可以觀察到熔融石英毛細管的內(nèi)表面光滑。圖3為化學修飾后的涂層毛細管在放大5000倍數(shù)條件下的SEM圖，觀察到修飾過的毛細管管壁上出現(xiàn)薄層，這個薄層即為通過原位嫁接反應制備的高聚物，通過化學鍵和毛細管管壁結(jié)合成一個整體。圖4中A線為未修飾的熔融石英毛細管EOF隨pH值變化的折線圖，A線為磺酸修飾的涂層毛細管EOF隨pH值變化的折線圖。從圖4可知，磺酸修飾的涂層毛細管在pH 3.0到9.0范圍內(nèi)能夠提供穩(wěn)定的較強的電滲流，EOF的大小幾乎不受支持電解質(zhì)pH的影響。
[0051]為了驗證采用以上技術方案制備的磺酸修飾的毛細管開管柱的有益效果，下面對磺酸修飾的毛細管開管柱在分離生物活性肽和分離氨基酸兩個方面進行如下研究。
[0052]1、磺酸修飾的毛細管開管柱分離生物活性肽
[0053]毛細管電泳作為一種新型高效的分離工具，近年來被廣泛應用于復雜生物樣品如活性肽和氨基酸的分離，然而，熔融石英毛細管管壁的硅羥基與活性肽的相互作用會引起活性肽等生物大分子樣品吸附到毛細管管壁表面，導致毛細管的電滲流不穩(wěn)定，迀移時間的重現(xiàn)性變差，產(chǎn)生嚴重的峰拖尾現(xiàn)象，嚴重時會喪失分離效率。通常采用在極端pH值條件下操作(如PH小于3.0，硅羥基電離度很小)，減小活性肽的在石英毛細管管壁上的吸附。在較低的PH條件下，由于熔融石英毛細管產(chǎn)生的電滲流很小，會導致分析時間很長。
[0054]分別研究了4 種生物活性肽(D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-L-Leu、Gly-D_Phe 和 L-Leu-D-Leu)在熔融石英毛細管和涂層毛細管上的分離行為。在較高pH值條件下，4種生物活性肽在熔融石英毛細管上無法實現(xiàn)分離，吸附現(xiàn)象較為嚴重，因此選擇在較低PH值(3.0)條件下進行。4種活性肽在熔融石英毛細管上分離的譜圖見圖5，從圖5中可以得出在pH3.0的條件下，4種活性肽在熔融石英毛細管上的分離時間為20min。在相同實驗條件下，考察了 4種活性肽在涂層毛細管上的分離情況。從圖5可以看出，4種生物活性肽通過制備的涂層毛細管在5.6min內(nèi)得到完全的基線分離，且色譜峰具有良好的對稱性，沒有前展峰和拖尾峰出現(xiàn)。4種生物活性肽在涂層毛細管中的分析時間相對于熔融石英毛細管節(jié)省了大約14min，且制備的新型涂層毛細管能夠提供良好的峰型。
[0055]2、磺酸修飾的毛細管開管柱分離氨基酸
[0056]分別考察了3種氨基酸(glycine、glutamic acid和phenylalanine)在恪融石英毛細管和涂層毛細管上的分離行為。由于氨基酸在較高PH條件下在石英毛細管管壁上有較強的吸附作用，導致此3種氨基酸不能基線分離，且伴有嚴重的峰拖尾現(xiàn)象。因此，在pH為3.0的情況下，分別研究了 3種氨基酸在熔融石英毛細管和涂層毛細管上的分離行為。
[0057]首先對3種氨基酸在熔融石英毛細管上的分離情況進行了研究。在pH為3.0條件下，3種氨基酸的分析時間超過了 26min，且glycine的色譜峰(峰I)存在著嚴重的不對稱(見圖6)。在同樣條件下，又考察了3種氨基酸在涂層毛細管上的分離情況，實驗表明，3種氨基酸在6.0min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離，且三個色譜峰均具有良好的對稱性(見圖6)。對比3種氨基酸在熔融石英毛細管和涂層毛細管上的分離行為可知，3種氨基酸在涂層毛細管上能夠?qū)崿F(xiàn)快速分離，且具有良好的分析重現(xiàn)性和色譜峰對稱性，分析時間較熔融石英毛細管節(jié)省了約20min。
[0058]對涂層毛細管穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，在通常的實驗條件下，經(jīng)過1000次大約3個月的分析，涂層毛細管的分離效率沒有明顯的變化，這可歸因于采用的原位嫁接技術制備的毛細管涂層有良好的穩(wěn)定性。
[0059]盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領域內(nèi)的技術人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
[0060]顯然，本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。
【主權項】
1.一種磺酸修飾的毛細管開管柱，其特征在于，所述毛細管開管柱的管壁上鍵合的物質(zhì)是2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸。2.—種磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)對毛細管進行預處理 (2)對預處理過的毛細管進行硅烷化反應 (3)對硅烷化反應后的毛細管進行磺酸化反應 將偶氮二異丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二異丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的質(zhì)量比為1:2-4:316.7，超聲處理，然后注入到硅烷化處理過的毛細管中，兩端封口，在70-90 °C條件下反應I l_13h，然后沖洗，得到所述磺酸修飾的毛細管開管柱。3.如權利要求2所述的磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)對毛細管進行預處理的過程為:熔融石英毛細管依次用去離子水、鹽酸溶液、去離子水、氫氧化鈉溶液、丙酮沖洗，然后經(jīng)氮氣吹干。4.如權利要求2所述的磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)對預處理過的毛細管進行硅烷化反應的過程為:將3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷與等體積的甲醇混合均勻，然后注射到預處理過的毛細管中，兩端封口反應，去掉封口，用甲醇沖洗毛細管，然后進行干燥，得到硅烷化反應后的毛細管。5.如權利要求2所述的磺酸修飾的毛細管開管柱的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中將偶氮二異丁腈和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸溶解到甲醇中，所述偶氮二異丁腈、2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸和甲醇的質(zhì)量比為1:3:316.7，超聲處理20min，然后注入到硅烷化處理過的毛細管中，兩端封口，在80°C條件下反應12h，然后分別用甲醇和水沖洗，得到所述磺酸修飾的毛細管開管柱。
【文檔編號】G01N27/447GK106093169SQ201610566895
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月11日
【發(fā)明人】盧明華, 王友梅, 田淑芳, 朱金花
【申請人】河南大學