可降解吡啶和氨氮的菌株、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株可高效降解化晚和氨氮的菌株、制 備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 化晚作為工業(yè)溶劑和多種化合物合成的基礎(chǔ)化工原料，應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料、 日用化工、香料、飼料添加劑、橡膠助劑等領(lǐng)域。化晚是典型的含氮雜環(huán)化合物，易溶于水， 容易擴散進入環(huán)境，且難W生物降解，嚴重威脅人類的健康，屬于"立致"類環(huán)境污染物。
[0003] 與傳統(tǒng)物理化學(xué)處理法相比，生物修復(fù)具有高效、投入資金少、運營成本低、且較 少產(chǎn)生二次污染，生態(tài)可承受等優(yōu)點，能夠高效治理大面積的污染，大量的微生物對環(huán)境可 W起到一定的修復(fù)作用，通過生物修復(fù)，可W使受污染生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)正常的生態(tài)功能及效 應(yīng)，其在環(huán)境污染治理中占有極其重要的地位。目前已從環(huán)境中篩選出一些對化晚具有一 定的降解能力的細菌，但大多耐受及降解化晚的能力較低。
[0004] 化晚降解菌在降解化晚的過程中會產(chǎn)生代謝產(chǎn)物氨，氨的積累會對化晚降降解產(chǎn) 生反饋抑制，從而顯著降低該菌的化晚降解能力，運也是目前所篩選的化晚降解菌降解能 力不強的重要原因之一。而且氨氮本身就是一種廣泛存在于工農(nóng)業(yè)及生活廢水中的環(huán)境污 染物，若擴散進入環(huán)境會造成極大的危害，是引起水體富營養(yǎng)化的主要成因之一，同時廢水 中存在的高濃度氨氮會顯著抑制微生物的生長及代謝，也對化晚及其他污染物的生物降解 及環(huán)境的生物修復(fù)帶來顯著的負面影響，而目前篩選和應(yīng)用于氨氮廢水處理的氨氮降解 菌大多降解能力較弱，不能在短時間內(nèi)快速降低廢水中的氨氮濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種針對目前化晚降解菌降解能力較低，對氨氮的耐受力 不強的狀況，能降解高濃度化晚且耐受氨氮的菌株，該菌株可用于含高濃度化晚廢水的生 物強化處理。
[0006] 另一個目的是針對部分類型廢水中氨氮濃度較高的特點，檢測所篩選菌株耐受及 降解高濃度氨氮的能力，并將其應(yīng)用于高濃度氨氮廢水處理。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的可高效降解化晚和氨氮的菌株，它于2014年4月25 日在中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、CCTCC保藏，保藏編號CCTCC M 2014165,該菌株屬于節(jié)桿菌 屬（A;rth;robacter sp.)，命名為Arthrobacter ureafaciens CZ3,保藏地址為：中國武漢， 武漢大學(xué)。
[000引上述可高效降解化晚和氨氮的菌株的制備方法，包括W下步驟：
[0009] (1)、從焦化廢水生化處理車間曝氣池和二沉池中取樣，將污泥置于=角瓶中，放 置玻璃珠，于 150- 200rpm，30°C - 33°C，震蕩25- 35min，每3000g離屯、10-12min，收集沉淀，將 污泥沉淀接種至LB培養(yǎng)基，加入濃度300mg/L的化晚；
[0010] (2)、定向馴化和初篩：至步驟（1)中化晚降解完，按體積分數(shù)5%轉(zhuǎn)接于濃度為 500mg/L的MSP液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基W化晚作為唯一碳、氮源和能源，如此反復(fù)，繼續(xù)增 加化晚濃度，依次增加至800mg/L，lOOOmg/L，1500mg/L，2000mg/L，3000mg/l;將馴化后的菌 液按l(T 2-l(r7不同稀釋比例鋪MSP固體平板，挑單菌落，在LB固體平板劃線純化S次，將純 化后的單菌落分別保種；
[0011] (3)、復(fù)篩:將步驟(2)中初步篩選的化晚降解菌接種至MSP培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基W 濃度為2000mg/L的化晚作為唯一碳源和能源，HPLC檢測不同細菌的化晚降解率，篩選化晚 降解菌，篩選在30-32小時內(nèi)完全降解2000mg/L化晚的菌株。
[0012] 上述的可降解化晚和氨氮的菌株應(yīng)用于含化晚廢水的處理。
[0013] 進一步地，上述可降解化晚和氨氮的菌株，應(yīng)用于化晚濃度低于3000mg/L的廢水 處理。
[0014] 上述的可降解化晚和氨氮的菌株應(yīng)用于濃度高于4000mg/L的高濃度氨氮(NH4+-N) 廢水生物處理中。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于，針對高濃度化晚對細菌生長會產(chǎn)生顯著抑制，對化晚降 解菌進行初步馴化和篩選后，采用高濃度化晚作為唯一碳、氮源和能源進一步篩選化晚降 解菌，獲得了 一株能W化晚作為唯一碳、氮源和能源生長的高效化晚降解菌Arthrobacter ureafaciens CZ3。將菌株CZ3應(yīng)用于含化晚廢水的實驗結(jié)果表明，該菌具有高效降解高濃 度化晚的能力，菌株CZ3在32小時內(nèi)即可完全降解2329mg/L化晚，與其他化晚降解菌相比， 具有較強的化晚降解能力，可應(yīng)用于含高濃度化晚廢水的生物強化處理。
[0016] 本發(fā)明還進一步將CZ3應(yīng)用于含高濃度氨氮廢水的處理中，在2617mg/L的高氨氮 初始濃度的模擬廢水中，CZ3的氨氮去除速率可達104.1mg-N/l/h，具有較強的氨氮快速去 除能力和很高的氨氮耐受力。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明所述菌株CZ3菌落形態(tài)(圖IA為LB培養(yǎng)基;圖IB為MSP培養(yǎng)基）；
[0018] 圖2為本發(fā)明所述菌株CZ3不同培養(yǎng)時期掃描電鏡圖(A.她，B.12h，C.16h，D.26h);
[0019] 圖3為本發(fā)明所述不同初始化晚濃度對化晚降解的影響；
[0020] 圖4為本發(fā)明所述不同初始化晚濃度對菌株生長的影響；
[0021] 圖5為本發(fā)明所述不同初始氨氮濃度對氨氮降解速率的影響；
[0022] 圖6為本發(fā)明所述不同初始氨氮濃度對氨氮降解率的影響；
[0023] 圖7為本發(fā)明所述菌株的16s rRNA序列圖。
【具體實施方式】
[0024] 為便于更好的理解本發(fā)明的目的、特征W及有益效果等，現(xiàn)結(jié)合附圖和具體實施 例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0025] 實施例1化晚降解菌的篩選和鑒定
[0026] (1)化晚降解菌馴化和篩選
[0027] 本實施例中的菌株CZ3是從武漢鋼鐵公司焦化廢水生化處理車間曝氣池和二沉池 中取樣，經(jīng)過富集、初篩和復(fù)篩得到的。
[00%]實施例中的LB液體培養(yǎng)基組成:酵母提取物5g/L，膜蛋白腺lOg/L，化Cl lOg/LcLB 固體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基中加入1.8 %瓊脂。
[0029] MSP無機鹽培養(yǎng)基組成如下：Na2HP〇4 6.78g/L，K出P〇4 3.0g/L，化Cl 0.5g/L， MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，CaCl2 O.Ollg/L，化晚500-3000mg/L，微量元素2ml/L。微量元素組成： MnS〇4 ?此0 1.69g/L，CoCl2*6H2〇 0.24g/L，曲B03 1.16g/L，化2Mo〇4*2出0 0.024g/L， FeS04.7H20 2.78g/L，ZnS04?7H20 1.15g/L，CuS〇4?5H2〇 O.SSg/LsMSP固體培養(yǎng)基含 1.8%瓊脂。
[0030] ①富集:將3克污泥置S角瓶(放置玻璃珠)于18化pm，30°C，震蕩30min，3000g離 屯、lOmin，收集沉淀，將Ig污泥沉淀接種至LB(加入化晚，濃度300mg/L)培養(yǎng)基；
[0031] ②定向馴化和初篩：至①中化晚降解完，按體積分數(shù)5%轉(zhuǎn)接于W化晚作為唯一 碳、氮源和能源，濃度為500mg/L的MSP液體培養(yǎng)基中，如此反復(fù)，繼續(xù)增加化晚濃度，依次增 加至 800mg/L，1 OOOmg/L，1500mg/L，2000mg/L，3000mg/l;將馴化后的菌液按 10 ―2 -10 ―7不同 稀釋比例鋪MSP固體平板，挑單菌落，在LB固體平板劃線純化S次，將純化后的單菌落分別 保種。
[0032] ③復(fù)篩:將②中初步篩選的化晚降解菌接種至化晚(濃度約2000mg/L)作為唯一碳 源和能源的MSP培養(yǎng)基中，HPLC檢測不同細菌的化晚降解率，篩選化晚降解菌，篩選到一株 可W在32小時左右可W完全降解2000mg/L化晚的菌株，初步命名為CZ3,用于后續(xù)研究。
[0033] (2)菌株鑒定
[0034] 從形態(tài)學(xué)、生理生化及分子遺傳學(xué)=方面對CZ3進行菌株鑒定
[0035] ①菌株CZ3菌落形態(tài)觀察:將菌株CZ-3挑單菌落分別于營養(yǎng)瓊脂平板和MSP固體平 板劃線，置生化培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)，24-48h后觀察該菌在不同培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)，見圖1。在 營養(yǎng)瓊脂平板上，菌落呈現(xiàn)乳白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊，易挑起，置4 °C放置后菌落呈 現(xiàn)非擴散性的巧樣黃;在MSP基礎(chǔ)無機鹽平板上的菌落相對較小，半透明且無色素生成，表 面平滑，易挑起，邊緣隆起。該菌呈現(xiàn)革蘭氏染色陽性的特征，在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對 數(shù)期時形態(tài)為桿狀或鑲刀形等不規(guī)則形態(tài)，在MSP基礎(chǔ)無機鹽固體培養(yǎng)基中為球狀，說明菌 株桿球狀的形態(tài)變化與培養(yǎng)的環(huán)境條件有關(guān)，尤其是培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件。該菌株無鞭毛，無 芽抱生成。
[0036] 通過掃描電鏡(SEM)進一步了解菌株外部形態(tài)特征，制備好的樣品表面噴金后用 掃描電鏡觀察細菌外部形態(tài)。掃描電鏡觀察菌株外部形態(tài)特征是菌種鑒定的常用方法之 一，將菌株CZ3接種至完全培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)，在不同時期取樣，制備樣品后采用場發(fā)射掃 描電鏡觀察。觀察結(jié)果(如圖2所示)發(fā)現(xiàn)，完全培養(yǎng)基中，細菌在不同的培養(yǎng)時期呈現(xiàn)不同 的形態(tài)，是一種變形菌，在培養(yǎng)初期，菌株CZ3為形態(tài)不規(guī)則的長桿狀，包括直、彎曲、棒狀、V 字形等多種形態(tài);對數(shù)生長期時，其長度逐步縮短，菌體形態(tài)變成短桿狀;至穩(wěn)定期和衰亡 期，桿狀細胞逐步為球狀細胞所取代。桿狀細胞的大小0.4-0.5 X 1-6皿，球狀細胞的直徑約 0.5-0.9 皿。
[0037] ②生理生化分析：菌株CZ3的生理生化