血管緊張素Ⅰ檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種用于檢測(cè)血管緊張素 I的化學(xué)發(fā)光免 疫檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法，以及使用該試劑盒來檢測(cè)血管緊張素 I濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管緊張素 I (Angiotensin I，A I )是由腎素作用于肝臟分泌的血管緊張素原 而產(chǎn)生，A I產(chǎn)生的速率是表示腎素活性（PRA)的重要指標(biāo)之一。
[0003] 腎素-血管緊張素-酸固酬系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)是一個(gè)激素系統(tǒng)，當(dāng)大量失血或血壓下降時(shí)，腎臟分泌腎素，腎素催化血管緊 張素原水解產(chǎn)生A I，A I基本沒有生物學(xué)活性，而是經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Emzyme，ACE)剪切C-末端兩個(gè)氨基酸殘基而形成A II。A II具有高效的收縮 血管作用，從而使血壓升高。A II也能刺激腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，醛固酮能促進(jìn)腎臟對(duì)水 和鈉離子的重吸收，繼而增加體液容量，升高血壓。
[0004] 目前，臨床上測(cè)定A I的方法主要有放射性免疫法、酶聯(lián)免疫法等。例如，北京 北方生物技術(shù)研宄所生產(chǎn)的碘[125I]A I放射免疫分析藥盒采用競(jìng)爭(zhēng)法原理測(cè)定血漿中的 A I含量。加入樣本和兔抗-A I抗體（藍(lán)色）及125I-A I標(biāo)記物（紅色）后，125I-A I標(biāo)記 物與樣本中的A I競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合兔抗-A I抗體，加入驢抗兔免疫分離劑，充分搖勻后，室溫放置 15min，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，去上清，測(cè)沉淀管的放射性計(jì)數(shù)（cpm)。樣本中的A I濃度 依據(jù)由校準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的放射性計(jì)數(shù)建立的Log-Logit數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量，從而檢測(cè)樣 本中的A I含量。
[0005] 然而，放射性免疫法及酶聯(lián)免疫法存在諸多不足。例如，上述放射性免疫法存在放 射性污染、標(biāo)記物半衰期短、對(duì)操作者具有放射性損傷，且操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低，檢 測(cè)范圍窄，且不能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的缺陷。傳統(tǒng)的放射性免疫法或酶聯(lián)免疫法方法檢測(cè)時(shí)間 長(zhǎng)，同時(shí)主要依靠純手工加樣等系列繁瑣操作，效率低，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差大；由于酶 促反應(yīng)不夠徹底，且易受外部干擾因素影響，如溫度、時(shí)間及材料濃度影響，因此檢測(cè)時(shí)特 異性低，靈敏度差，檢測(cè)范圍窄。因此，本領(lǐng)域亟需一種在靈敏度高的同時(shí)提高檢測(cè)試劑的 安全性和穩(wěn)定性，操作更加簡(jiǎn)便，還能夠借助分析儀器實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過程全自動(dòng)化的檢測(cè)A I 的檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)A I的 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，以獲得高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，還能提高檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性， 延長(zhǎng)檢測(cè)試劑的保存時(shí)間。
[0007] 本發(fā)明還提供用于檢測(cè)A I的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法。
[0008] 另外，本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明提供的A I化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，尤 其是采用該試劑盒，通過全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行A I檢測(cè)的方法，減少操作時(shí)間，降低人為 操作誤差，同時(shí)利用化學(xué)示蹤標(biāo)記物的特異性，提高檢測(cè)靈敏度。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于檢測(cè)A I的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒 包括組分A和組分B，所述組分A為A I抗原或A I抗原與蛋白載體的連接物，組分B為抗 A I抗體，所述組分A和組分B中的一種標(biāo)記示蹤標(biāo)記物，另一種包被磁球。
[0010] 應(yīng)理解，在本發(fā)明提供的上述試劑盒中，所述抗A I抗體可以是一種或多種抗A I 單克隆抗體和/或抗A I多克隆抗體。實(shí)際上，在本發(fā)明中所提及的抗體都可以是單克隆 抗體和/或多克隆抗體。
[0011] 本發(fā)明適用的蛋白載體可以選自本領(lǐng)域常用的蛋白載體中的至少一種。例如，所 述蛋白載體選自牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)、兔血清白蛋白（RSA)、血藍(lán)蛋白 (KLH)、牛IgG、人IgG、卵清蛋白（OVA)、肌紅蛋白和甲狀腺球蛋白中的至少一種。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標(biāo)記物可以選自本領(lǐng)域中常用于標(biāo)記抗原或抗體的示蹤標(biāo) 記物，例如選自金剛烷、魯米諾及其衍生物、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯、堿性磷酸酶和辣 根過氧化物酶中的至少一種，優(yōu)選為N-(4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標(biāo)記物直接標(biāo)記或者間接標(biāo)記A I抗原（或其與蛋白載體 的連接物）或抗A I抗體。其中，間接標(biāo)記包括但不限于通過異硫氰酸熒光素（FITC)與抗 FITC抗體體系或鏈霉親和素（SA)與生物素（Biotin)體系間接標(biāo)記。所述"直接標(biāo)記"是 指ABEI直接與待測(cè)抗原或針對(duì)待測(cè)抗原的抗體連接進(jìn)行標(biāo)記；所述"間接標(biāo)記"是指通過 中間媒介鏈接體系使得ABEI標(biāo)記A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）或抗A I抗體，所 述中間媒介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系。 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，間接標(biāo)記有利于減弱空間效應(yīng)，有利于信號(hào)的放大，使得檢測(cè)更加靈敏。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）或抗A I抗體直接包被磁球， 或者通過FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系間接包被磁球。所述"直接 包被"是指利用A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）或抗A I抗體直接對(duì)磁球進(jìn)行包被； 所述"間接包被"是指通過中間媒介鏈接體系，使得A I抗原（或其與蛋白載體的連接物） 或抗A I抗體對(duì)磁球進(jìn)行包被，所述中間媒介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體 體系或鏈霉親和素與生物素體系。同樣，間接包被的優(yōu)點(diǎn)在于，有利于減弱空間效應(yīng)，有利 于信號(hào)的放大，使得檢測(cè)更加靈敏。
[0015] 適用于本發(fā)明的磁球也稱為磁珠，可以是本領(lǐng)域中常用的磁性微球。優(yōu)選的是，本 發(fā)明使用的磁球，是將納米級(jí)的Fe 2O3或Fe3O4磁性粒子和有機(jī)高分子材料進(jìn)行復(fù)合，形成具 有超順磁性和極大量蛋白吸附容量的微米級(jí)的固相微球，具有在外加磁場(chǎng)作用下可迅速被 磁化，在撤走磁場(chǎng)后剩磁為零的屬性。其中，所述有機(jī)高分子材料的種類沒有特別限制，可 根據(jù)需要進(jìn)行選擇。
[0016] 本發(fā)明所使用的磁性微球應(yīng)能滿足直徑為0. 1-5 μ m，磁性微球還可以通過表面改 性而帶有多種活性功能基團(tuán)，包括但不限于-OH、-C00H、-NH2。
[0017] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述磁球?yàn)镕e2O3或Fe 304磁性納米粒子與有機(jī)高分子材料 的復(fù)合體，并具有〇. 1-5 μ m的粒徑；并且，所述磁球任選地通過表面改性而帶有一種或多 種活性功能基團(tuán)。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述試劑盒包括選自組分Al和組分A2中的任意一 種的組分，以及選自組分B1、組分B2和組分B3中的任意一種的組分；其中，組分Al為ABEI 直接標(biāo)記的A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）；組分A2為鏈霉親和素標(biāo)記的ABEI和生 物素化的A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）；組分Bl為抗A I抗體直接包被的磁球； 組分B2為生物素化的抗A I抗體和鏈霉親和素包被的磁球；以及組分B3為抗A I抗體標(biāo) 記的FITC和抗FITC抗體包被的磁球。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施方案，所述試劑盒包括選自組分Cl和組分C2中的任意 一種的組分，以及選自組分Dl、組分D2和組分D3中的任意一種的組分；其中，組分Cl為 ABEI直接標(biāo)記的抗A I抗體；組分C2為鏈霉親和素標(biāo)記的ABEI和生物素化的抗A I抗體； 組分Dl為A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）直接包被的磁球；組分D2為生物素化的 A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）和鏈霉親和素包被的磁球；以及組分D3為A I抗原 (或其與蛋白載體的連接物）標(biāo)記的FITC和抗FITC抗體包被的磁球。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還可以包括A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）的低 點(diǎn)校準(zhǔn)品和高點(diǎn)校準(zhǔn)品，并任選地包括緩沖液。本發(fā)明所述低點(diǎn)校準(zhǔn)品與高點(diǎn)校準(zhǔn)品是兩 者相對(duì)而言，其中"低點(diǎn)校準(zhǔn)品"，是指將A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）用50%牛 血清制品稀釋成濃度為〇.2-2ng/ml得到的校準(zhǔn)品；而"高點(diǎn)校準(zhǔn)品"是指將A I抗原（或 其與蛋白載體的連接物）用50%牛血清制品稀釋成濃度為8-24ng/ml得到的校準(zhǔn)品。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，所包含的各成分濃度優(yōu)選如下：AI抗原為 0· 002-0. 01mg/ml ;抗AI 抗體為 0· 05-lmg/ml ;磁球?yàn)?0· 05-lmg/ml ;FITC為 0· 002-0.0 lmg/ ml ;抗 FITC 抗體為 0· 05-lmg/ml ;鏈霉親和素為 0· 05-lmg/ml ;生物素為 0· 002-0. 01mg/ml ; 示蹤標(biāo)記物為0.2-lmg/l ;以及如果使用了蛋白載體，其濃度為2-10mg/l。上述各成分的濃 度均基于包含該成分的單獨(dú)的試劑盒組分的量計(jì)。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，在本發(fā)明的試劑盒中，在A I抗原（或其與蛋白載體 的連接物）上標(biāo)記ABEI，并用抗A I抗體包被磁球。
[0023] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括標(biāo)記A I抗原（或其與蛋 白載體的連接物）的ABEI、抗A I抗體包被的磁球、低點(diǎn)校準(zhǔn)品和高點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0024] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括標(biāo)記A I抗原（或其與蛋 白載體的連接物）的ABEI、生物素化的抗A I抗體、鏈霉親和素包被的磁球、低點(diǎn)校準(zhǔn)品和 尚點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0025] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括標(biāo)記A I抗原（或其與蛋 白載體的連接物）的ABEI、抗A I抗體標(biāo)記的FITC、抗FITC多克隆抗體包被的磁球、低點(diǎn) 校準(zhǔn)品和尚點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0026] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括生物素化的A I抗原（或 其與蛋白載體的連接物）、鏈霉親和素標(biāo)記的ABEI、抗A I抗體包被的磁球、低點(diǎn)校準(zhǔn)品和 尚點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0027] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，在本發(fā)明的試劑盒中，在抗A I抗體上標(biāo)記ABEI， 并用A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）包被磁球。
[0028] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括標(biāo)記抗A I抗體的ABEI、 A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）包被的磁球、低點(diǎn)校準(zhǔn)品和高點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0029] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述試劑盒包括標(biāo)記抗A I抗體的ABEI、 標(biāo)記A I抗原（或其與蛋白載體的連接物）的FITC、抗FITC多克隆抗體包被的磁球、低點(diǎn) 校準(zhǔn)品和尚點(diǎn)校準(zhǔn)品。
[0030] 例如，在本發(fā)明的一個(gè)具