一類新的抑制新生血管的小肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類預防和抑制血管新生的多肽及其應用。本發(fā)明還涉及所述多肽的制法和應用以及含所述多肽的藥物組合物。本發(fā)明多肽具有多種優(yōu)點，例如分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度等。
【專利說明】一類新的抑制新生血管的小肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體地，涉及一類新的抑制新生血管的小肽，所述的小肽是源于人Neuropilin-Ι的多肽。本發(fā)明還涉及所述多肽的制法和應用以及含所述多肽的藥物組合物。
【背景技術】
[0002]新生血管的形成是一個極其復雜的過程，它包括:現存血管的擴張、血管通透性的增加、血管周圍基質的降解、內皮細胞的激活增殖、遷移以及新的毛細血管樣管腔的形成。
[0003]在眼部，約2/3的致盲性疾病均與病理性新生血管有關，例如:單純皰疹性角膜基質炎引起的角膜新生血管，年齡相關性黃斑變性中的脈絡膜新生血管，以及糖尿病視網膜病變或早產兒視網膜病變中的視網膜新生血管等。目前臨床上，對于眼部病理性新生血管常規(guī)運用激光光凝、光動力學療法(Photodynamic therapy, PDT)以及經瞳孔溫熱療法(Thermal transpupilIary therapy, TTT)等進行治療。然而，這些治療手段不僅對局部組織易造成破壞，其遠期療效也并不十分令人滿意。因此，近年來人們不斷嘗試開發(fā)治療眼部病理性新生血管更有效的方法。
[0004]在開發(fā)有效的血管新生抑制劑時，應充分考慮到眼科用藥的特殊性。
[0005]第一，眼部存在多個解剖性和功能性的屏障。全身給藥常常由于血-房水屏障和血-視網膜屏障而無法在眼組織局部達到足夠的藥物濃度；局部給藥，如玻璃體腔注射，大于76.5kDa的大分子在理論上很難穿透視網膜作用于視網膜和脈絡膜新生血管。對于眼表給藥，藥物必須要先后穿透親脂性的角膜上皮細胞緊密連接和親水性的角膜基質，因此只有具備適當脂溶性、低分子量或能與眼表組織內的轉運體(如:氨基酸轉運體、寡肽轉運體等)結合的藥物才能到達前房發(fā)揮作用。
[0006]第二，藥物在親水的淚液、房水、玻璃體液中溶解的程度與其有效性呈正相關。
[0007]第三，基于上述主要原因，眼科用藥的生物利用度很低；要使之提高，可加大給藥的濃度。用于治療腫瘤新生血管的化合物毒副作用較為明顯，全身和局部均無法高劑量給藥。此外，分子量較大的外源性蛋白質也是敏感的異物源，可對眼部組織(如:葡萄膜)造成免疫損傷。
[0008]第四，目前雖然已經有一系列相對安全的內源性血管新生抑制劑被先后證實，如血管抑素(angiostatin),它由纖溶酶原 Kringle 結構域 1-4(plasminogen Kringlel-4)組成，可明顯抑制血管依賴性腫瘤的生長，但由于其分子量較大且空間構象復雜，故在制備過程中存在重組表達純化工藝繁瑣和內毒素殘留等不足。正是由于上述種種條件的限制，目前用于治療眼部新生血管的藥物十分有限，比如重組抗人VEGF單克隆抗體bevacizumab (Avastin)、重組抗人 VEGF 單克隆抗體片段 ranibizumab (Lucentis)等,但它們價格高昂，并且需反復經玻璃體腔給藥，甚至可引起血管栓塞等風險。
[0009] 由此可見，尋找具有特異生物學活性和生物相容性的小分子抑制劑，經無創(chuàng)或微創(chuàng)的給藥途徑透過各種眼組織屏障，提高眼局部的生物利用度，降低給藥劑量，減少局部和全身的副作用，對新生血管性眼病的臨床防治具有十分重要的意義。因此，本領域迫切需要開發(fā)一種適于眼球組織的有效安全的小分子新生血管抑制劑。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一類適于眼球組織的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、類似物和衍生物。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供含所述多肽的制法和應用。
[0012]在本發(fā)明的第一方面，提供了在本發(fā)明的第一方面，提供了一種下式I表示的多肽，或其藥學上可接受的鹽
[0013][XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO] (I) [0014]式中，
[0015]XaaO是無，或I~2個氨基酸構成肽段；
[0016]Xaal是選自下組的氨基酸:Cys ;或Ser ;
[0017]Xaa2是選自下組的氨基酸:Ser ;或Thr ;
[0018]Xaa3是選自下組的氨基酸:Gln ；Asn ；
[0019]Xaa4 是選自下組的氨基酸:Tyr ；Trp ；Phe ；Thr ;或 Ser ；
[0020]Xaa5是選自下組的氨基酸:Ser ;或Thr ；
[0021]Xaa6是選自下組的氨基酸:Thr ;或Ser ；
[0022]Xaa7 是選自下組的氨基酸:Asn ；Gln ；His ；Lys ;*Arg ；
[0023]Xaa8是選自下組的氨基酸:Trp ;Tyr ;或Phe ；
[0024]Xaa9是選自下組的氨基酸:Cys ;或Ser ；
[0025]XaalO是無，或I~2個氨基酸構成肽段；
[0026]并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為9-13個氨基酸。
[0027]更佳地，所述的多肽中:
[0028]XaaO 是無；
[0029]Xaal是選自下組的氨基酸:Cys ;或Ser ；
[0030]Xaa2是選自下組的氨基酸:Ser ;或Thr ；
[0031]Xaa3是選自下組的氨基酸:Gln ;或Asn ;
[0032]Xaa4是選自下組的氨基酸:Tyr ；^Phe ；
[0033]Xaa5是選自下組的氨基酸:Ser ;或Thr ；
[0034]Xaa6是選自下組的氨基酸:Thr ;或Ser ；
[0035]Xaa7是選自下組的氨基酸:Asn ;*Gln ；
[0036]Xaa8是選自下組的氨基酸:Trp ;或Tyr ；
[0037]Xaa9是選自下組的氨基酸:Cys ;或Ser ；
[0038]XaalO 是無；
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述多肽的長度為9個氨基酸。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述多肽的長度為8個氨基酸。
[0041 ]在另一優(yōu)選例中，所述多肽選自下組:[0042](a)具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽；
[0043](b)將SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列經過1-3個(較佳地1-2個，更佳地I個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID NO:2的所示多肽的抑制血管新生活性。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽與SEQ ID N0:2的相同性≤80%，較佳地≤90% ；更佳地> 95%。
[0046]本發(fā)明還提供了具有抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚體和多聚體形式。
[0047]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發(fā)明上述的多肽。
[0048]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有:
[0049](a)本發(fā)明上述的多肽或其藥學上可接受的鹽；和
[0050](b)藥學上可接受的載體或賦形劑。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑(如眼周和眼內注射液)、眼用凝膠或眼藥膏。
[0052]在另一優(yōu)選例 中，所述的組合物為緩釋劑型。
[0053]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明所述多肽或藥學上可接受的鹽的用途，它們被用于制備抑制血管新生或防治與血管新生相關疾病的藥物。
[0054]在另一優(yōu)選例中，所述的與血管新生相關疾病的選自下組:新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動脈硬化、閉塞性動脈硬化、動脈栓塞、動脈血栓、Berger's病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風濕性關節(jié)炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥或肉瘤狀病等。
[0055]在另一優(yōu)選例中，所述的新生血管性眼病包括累及脈絡膜、視網膜、角膜或虹膜，包括老年性黃斑變性、增生性糖尿病視網膜病變、視網膜血管阻斷性疾病、早產兒視網膜病變、角膜感染、新生血管性青光眼等。
[0056]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種抑制哺乳動物血管新生的方法，包括步驟:給需要的對象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學上可接受的鹽。
[0057]在另一優(yōu)選例中，所述的對象是人。
[0058]在另一優(yōu)選例中，所述的血管新生是與新生血管性眼病相關的血管新生。
[0059]應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0061]圖1顯示了小肽ZY7對人臍靜脈血管內皮細胞HUVECs增殖的影響，小肽ZY7具有顯著抑制內皮細胞增殖的效應。相對于VEGF組，VEGF+小肽ZY7組(I μ M~100 μ Μ)具有顯著抑制HUVECs增殖的作用，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，差異具有統計學意義。
[0062]圖2顯示小肽ΖΥ7對人臍靜脈血管內皮細胞HUVECs管腔形成的影響，可見小肽ZY7具有顯著抑制內皮細胞管腔形成的效應。
[0063]圖2a_2c顯示小肽ZY7對HUVECs管腔形成的抑制作用。
[0064]圖2a 為 VEGF 組；圖 2b 為 VEGF+ZY7 (100 μ M)組；圖 2c 為相對于 VEGF 組，VEGF+小肽ZY7組(I μ M~100 μ Μ)具有顯著抑制HUVECs管腔形成的作用，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，差異具有統計學意義。
[0065]圖3顯示小肽ΖΥ7對雞胚尿囊膜上新生血管的影響:小肽ΖΥ7具有顯著抑制新生血管的效應。
[0066]圖3a_3c示濾紙片周2.5mm范圍內3_5級微血管計數。
[0067]圖3a 為 PBS 組；圖 3b 為 ZY7 (10 μ I/ 片)組；圖 3c 為 ZY7 (50 μ I/ 片)組；圖 3d為相對于PBS組，各濃度的小肽ΖΥ7組均明顯抑制雞胚尿囊膜新生血管數，且抑制作用呈濃度依賴性，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01，差異具有統計學意義。
[0068]圖4顯示小肽ΖΥ7對小鼠視網膜新生血管的影響:小肽ΖΥ7具有顯著抑制小鼠視網膜新生血管的效應。
[0069]圖4a為PBS組；圖4b為ZY7 (2 μ g/ μ I)組；圖4c為相對于高氧+PBS組，高氧+小肽ZY7組(lyg/μL~2yg/yl)明顯抑制小鼠視網膜新生血管數，且抑制作用呈濃度依賴性，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01，差異具有統計學意義。
【具體實施方式】
[0070]本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次制備了具有抑制血管新生功能的，分子量小于3kD的小分子多肽。具體而言，本發(fā)明人應用生物信息學的方法，基于同源性分析和生物學特性等分析，設計了數個候選序列，采用固相法將其合成，分離純化獲得高純度的小肽ZY7，并運用HPLC及MS對之進行鑒定，再經雞胚尿囊膜血管模型、氧誘導小鼠視網膜新生血管模型、VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖模型和人臍靜脈內皮細胞管腔模型篩選，獲得了一類新型的、具有預防和治療血管新生相關疾病的小分子多肽。
[0071]本發(fā)明的小肽的分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；安全性高，對生物組織毒副作用??；眼局部用藥生物利用度高，可減少劑量，從而減小全身副作用。在此基礎上完成了本發(fā)明。
[0072]人Neuropilin-l
[0073]Neuropilin是1995年Satoda等人首次報道的一種跨膜糖蛋白。根據neuropil in基因的選擇性拼接，可形成兩個異構體:Neuropilin-l和Neuropilin_2,兩者之間有44%的同源性。與其他Neuropilin家族成員高度保守結構一樣,Neuropilin-1為跨膜蛋白，其胞外有3個不同的結構域，分別稱為al/a2、FV/FV III(bl/b2)和MAM(c)，其跨膜區(qū)及胞漿內區(qū)域歸入d結構域。Neuropilin-1基因在人體組織內廣泛表達,例如:神經系統、內皮細胞、某些腫瘤細胞、心、肺、胎盤等。在新生血管生成過程中，VEGF-165、P1GF_2、VEGF-B、VEGF-E可與Neuropilin-l結合，激活下游的信號轉導通路，發(fā)揮重要的生物學效應。
[0074]活性多肽
[0075]在本發(fā)明 中，術語“本發(fā)明多肽”、“ZY7多肽”、“ZY7小肽”、“短肽ZY7”或“肽ZY7”可互換使用，都指具有血管新生抑制活性的肽ZY7氨基酸序列(CSQYSTNWC，如SEQ ID NO:1所示)的蛋白或多肽。此外，所述術語還包括具有抑制血管新生功能的、SEQ IDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):1-2個(更佳地為I個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個(通常為2個以內，較佳地為I個)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的結構和功能。此外，所述術語還包括單體和多聚體形式本發(fā)明多肽。該術語還包括線性以及非線性的多肽(如環(huán)肽)。一種典型的多肽為C末端和/或N末端缺失一個氨基酸，即構成8個氨基酸的多肽。
[0076]本發(fā)明還包括ZY7多肽的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或
(iii)ZY7多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導序列、分泌序列或6His等標簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
[0077]—類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多3個，較佳地至多I個，更佳地至多I個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
[0078]表1
[0079]
【權利要求】
1.一種下式I表示的多肽，或其藥學上可接受的鹽
[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO] (I) 式中， XaaO是無，或I~2個氨基酸構成肽段； Xaal是選自下組的氨基酸:Cys ;或Ser ； Xaa2是選自下組的氨基酸:Ser Thr ； Xaa3是選自下組的氨基酸:Gln ；Asn ； Xaa4是選自下組的氨基酸:Tyr ；Trp ；Phe ；Thr ;或Ser ； Xaa5是選自下組的氨基酸:Ser Thr ； Xaa6是選自下組的氨基酸:Thr ;或Ser ； Xaa7是選自下組的氨基酸:Asn ；Gln ；His ；Lys ;*Arg ； Xaa8是選自下組的氨基酸:Trp ；Tyr ;*Phe ； Xaa9是選自下組的氨基酸:Cys ;或Ser ； XaalO是無，或I~2個氨基酸構成肽段； 并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為9-13個氨基酸。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO為I~2個氨基酸的肽段。
3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，XaalO為I~2個氨基酸的肽段。
4.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自下組: (a)具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽； (b)將SEQID NO:2所示氨基酸序列經過1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權利要求1所述的多肽。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有: (a)權利要求1所述多肽或其藥學上可接受的鹽；和 (b)藥學上可接受的載體或賦形劑。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為針劑、眼藥水、眼用凝膠或眼藥膏。
8.如權利要求1所述的多肽或藥學上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備抑制血管新生或防治與血管新生相關疾病的藥物。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的與血管新生相關疾病的選自下組:新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動脈硬化、閉塞性動脈硬化、動脈栓塞、動脈血栓、Berger's病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風濕性關節(jié)炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥和肉瘤狀病。
10.一種抑制哺乳動物血管新生的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學上可接受的鹽。
【文檔編號】A61P7/02GK103992377SQ201310052864
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年2月18日 優(yōu)先權日:2013年2月18日
【發(fā)明者】鄭穎, 許迅 申請人:上海市第一人民醫(yī)院