一種金屬有機骨架化合物抗腫瘤血管生成劑及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了鐵金屬有機骨架化合物（Fe?MIL?101）新的用途，首次發(fā)現(xiàn)Fe?MIL?101抗血管生成作用，首次發(fā)現(xiàn)Fe?MIL?101可有效抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和小管形成，說明Fe?MIL?101具有抗血管生成活性，可作為血管生成抑制劑使用。并且Fe?MIL?101對正常細胞的毒性弱，可作為選擇性血管生成抑制劑使用。
【專利說明】
一種金屬有機骨架化合物抗腫瘤血管生成劑及其使用方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及金屬有機骨架材料的應用技術領域，具體涉及一種金屬有機骨架化合物在腫瘤血管生成抑制劑中的應用。
【背景技術】
[0002]長久以來，腫瘤依然是世界范圍內主要的死亡之一。盡管已有較為成熟的治療方法，但很多類型的腫瘤缺乏早期癥狀，同時對放療和化療不敏感，尤其是許多化療藥可損傷機體的免疫系統(tǒng)，會對患者產(chǎn)生毒副作用及耐藥性。特別是腫瘤發(fā)展到中晚期，往往出現(xiàn)腫瘤治療的速度遠遠趕不上腫瘤轉移擴散的速度。因此，抗腫瘤治療一直面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。為到達較好的腫瘤治療效果，新型有效的抗腫瘤藥物與聯(lián)合治療策略十分必要。
[0003]抗血管生成被認為是治療惡性腫瘤具有重大醫(yī)學價值的策略之一。當腫瘤體積超過2 mm3時進入血管期，新生血管的生成為腫瘤的生長提供必需的營養(yǎng)供給和代謝產(chǎn)物排泄，從而使腫瘤體積呈指數(shù)倍數(shù)生長，同時新生血管通透性增強，腫瘤細胞可穿透血管轉移至其他部位。因此，血管生成與腫瘤的生長、轉移及復發(fā)密切相關。阻斷腫瘤血管生成、切斷腫瘤組織獲得營養(yǎng)途徑已經(jīng)成為新的抗腫瘤治療靶點，而且也成為抗腫瘤治療中熱門的研究內容。血管生成抑制的出現(xiàn)為抗腫瘤治療提供了一種新手段，但是隨著臨床應用范圍的擴大和應用時間的延長抑制劑的一些毒副作用也逐步顯現(xiàn)出來，貝伐單抗又稱阿瓦斯汀(Bevacizumab, Avastin)是美國第一個獲得批準上市的抑制腫瘤血管生成的藥物，它通過與血管內皮生長因子(VEGF)結合并阻斷其生物活性。目前被廣泛用于臨床治療中，但其效果并不令人滿意，并伴有許多嚴重副作用。癌癥的轉移是多種生長因子共同調控的結果。因此，發(fā)展能夠同時抑制多種生長因子的新型血管生成抑制劑也許能解決這一難題。
[0004]金屬基質蛋白酶(MMP)是鋅離子依賴性的內源性蛋白酶家族，能水解細胞外基質，在腫瘤的侵襲和轉移、血管生成中起著重要作用。腫瘤的轉移也伴隨著蛋白酶水解細胞外基質的過程。因此，在細胞微環(huán)境中下調或降低MMP蛋白酶活性對抑制血管生成以及腫瘤的侵襲和轉移是至關重要的。以MMP-2和MMP-9為標靶的抑制劑已被廣泛用于腫瘤轉移的動物模型以及人類癌癥的臨床研究，例如吡啶酮乙醇胺(PO)負載Fe3O4納米顆粒(Fe3O4OPONPs)具有抑制麗P-2的活性。富勒烯-基納米材料GdOC82(OH)22以及中空介孔碳納米膠囊(HMCNs)作為有效的抗血管生成抑制劑，就是通過下調多種包括MMP-2、MMP-9的抗血管生成因子。
[0005]鐵是所有生物體中一個至關重要的微量元素。鐵配合物是有效的細胞毒性藥物。鐵活性化合物在作用機理，生物分布和細胞毒性方面不同于當前使用的鉑類藥物，而且它們對抗那些化療敏感性差或傳統(tǒng)鉑類藥物產(chǎn)生了抗藥性的癌癥是有效的，至少大體是有效的。但至今未發(fā)現(xiàn)有關鐵基配合物作為抗腫瘤藥物，靶向作用于血管生成，血管內皮細胞和腫瘤細胞，強大抗腫瘤效果的報道。
[0006]金屬有機骨架化合物(Metal-Organic Frameworks , MOFs)是利用含氧的多齒有機配體與金屬離子通過自由組裝形成的具有周期性網(wǎng)絡結構的配體化合物。近年來，由于MOFs能展示可調控的多孔性和異常的高比表面，可被廣泛應用于生物醫(yī)學的多個領域，如藥物的封裝，傳遞，運輸和釋放，甚至利用MOFs實現(xiàn)基因治療疾病。研究表明，RNA干擾沉默VEGF的表達被證實了抑制了腫瘤血管生成以及阻礙了腫瘤的生長。因此，利用含鐵離子的金屬有機骨架化合物制備新型抗腫瘤血管生成抑制劑以增強抗腫瘤治療的效果。但是，相對于大量的合成及應用研究，目前關于MOFs材料作為抗癌藥物載體及其細胞毒性研究都還非常有限，更無關于其自身抗血管生成、抑制基質金屬蛋白酶MMPs的研究報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中存在的金屬有機骨架化合物合成復雜、成本高、效果不好等缺點，提供一種合成簡單、成本低、特異性強的金屬有機骨架化合物。
[0008]所述的血管生成抑制劑的Langmuir和BET比表面積分別為5400 m2 g—1和3710 m2g—、
[0009]所述的血管生成抑制劑的有效濃度為6.25-25pg mL一、
[0010]所述的血管生成為腫瘤病變組織的血管新生和腫瘤導致的血管新生。
[0011]所述的腫瘤為人非小細胞肺癌(A549)和人卵巢癌(SK0V3);血管生成所用的的血管內皮細胞為人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC);用于對比的正常細胞為小鼠胚胎成纖細胞(BABL-3T3)。
[0012]所述的血管生成抑制劑具有選擇性抑制癌細胞和血管內皮細胞增殖但對正常細胞毒性較弱的作用。
[0013]所述的血管生成抑制劑具有抑制癌細胞和血管內皮細胞迀移的作用，具有抑制體外血管生成的作用以及下調細胞微環(huán)境中基質金屬蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的表達的作用。
[0014]所述的血管生成抑制劑具有抑制體外VEGF和人卵巢癌細胞(SK0V3)分泌液(CM)誘導的人靜脈血管內皮細胞管形形成，其效果強于傳統(tǒng)的酪氨酸激酶抑制劑(SU5416)。
[0015]本發(fā)明的有益效果:材料合成方法簡單、成本低以及特異性強;能夠選擇性抑制卵巢癌SK0V3細胞以及人血管內皮HUVEC細胞的增殖與迀移，對于正常細胞(小鼠胚胎成纖細胞BABL-3T3)的毒性較弱;抑制VEGF和SK0V3細胞分泌液(CM)刺激的人靜脈血管內皮細胞小管形成;抑制基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明Fe-MIL-1Ol材料XRD圖。
[0017]圖2為本發(fā)明Fe-MIL-1Ol材料N2吸附脫附以及孔徑分布圖。
[0018]圖3為本發(fā)明Fe-MIL-1Ol材料SEM圖。
[0019]圖4為本發(fā)明Fe-MIL-1Ol對A549、SK0V3、HUVEC和BABL-3T3細胞的抑制率圖。
[0020]圖5為本發(fā)明Fe-MIL-1Ol抑制SK0V3和HUVEC細胞迀移圖。
[0021 ] 圖6為本發(fā)明Fe-MIL-1Ol對HUVEC細胞血管生成實驗圖。
[0022]圖7為本發(fā)明Fe-MIL-1Ol對HUVEC細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達實驗圖。
具體實施例
[0023]實施例1 Fe-MIL-1Ol體外細胞毒性實驗。
[0024]MTT法:取對數(shù)生長期的人非小細胞肺癌A549、人卵巢癌SK0V3、血管內皮HUVEC細胞以及正常BABL-3T3細胞，按I X 14個/孔接種于96孔板中，當細胞生長達到80%融合后，分別加入3.12、6.25、12.5、25 pg mL_1的Fe-MIL-101，設3個復孔。作用72小時后，每孔中加入5Hg mL—1 MTT繼續(xù)培養(yǎng)4小時，吸取上清，每孔加入150 pL DMS0，水平震蕩10分鐘，然后使用酶標儀于490 nm波長測定每孔的吸光度(0D值)，每組實驗重復三次。
[0025]按如下公式計算細胞抑制率:細胞抑制率％ = [ 1- ( [ OD ] test/ [ OD ] control) ] X 100% ,其中，[0D]test為實驗組OD值，[0D]ccintrcii為對照組OD值。IC5Q值即為細胞抑制率達到50%時藥物的濃度。
[0026]結果與結論:請參照附圖4，附圖4是Fe-MIL-1Ol對A549、SK0V3、HUVEC和BABL-3T3細胞的抑制率圖。如圖4所示，F(xiàn)e-MIL-1Ol對細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴關系，特別是對SK0V3和HUVEC細胞的抑制作用最強。當Fe-MIL-1Ol的濃度為12.5 pg mL_4t，對腫瘤細胞(A549和SK0V3)的抑制率超過30%，對HUVEC的抑制率接近80%;當Fe-MIL-1Ol的濃度為25 pgmL_1時，對SK0V3和HUVEC細胞的抑制率分別大于50%和90%。通過計算Fe-MIL-1Ol對A549、SK0V3、HUVEC和BABL-3T3細胞四種細胞的IC5Q值分別為54.3^67.8^23.6^9.9和78.3 pg mL一、以上數(shù)據(jù)說明Fe-MIL-1Ol的濃度為12.5?25^^ mL4濃度范圍內對癌細胞和血管內皮細胞具有抑制作用。并且還發(fā)現(xiàn)Fe-MIL-1Ol對SK0V3和HUVEC具有選擇性抑制作用，而對正常細胞的毒性較弱。
[0027]實施例2 Fe-MIL-1Ol對卵巢癌和血管內皮細胞迀移實驗。
[0028]采用劃痕法檢測Fe-MIL-1Ol對卵巢癌SK0V3細胞和血管內皮HUVEC細胞的迀移能力。SK0V3和HUVEC細胞分別接種于6孔板中(2X 15細胞/孔)，培養(yǎng)24小時后。用200 的槍頭劃痕，PBS沖洗三次，去除漂浮的細胞，加入25 Hg mL-1的Fe-MIL-1Ol與SK0V3細胞和HUVEC細胞作用O、6、12、24小時，顯微鏡觀察向劃痕處迀移的細胞數(shù)量。
[0029]結果與結論:請參照附圖5，附圖5是Fe -MIL-101抑制SK0V3和HUVEC細胞迀移圖。如圖2所示，F(xiàn)e-MIL-1Ol作用后，SK0V3和HUVEC細胞向劃痕處迀移的細胞數(shù)明顯少于對照組向劃痕處迀移的細胞數(shù)，說明Fe-MIL-1Ol對兩種細胞的迀移具有抑制作用。
[0030]實施例3 Fe-MIL-1Ol抑制HUVEC細胞血管生成實驗。
[0031]先將50 uL Matrigel鋪于96孔板中，37°C放置30 min讓其凝固，輕輕向其中加入100 uL HUVEC細胞懸液(2 X 15細胞/mL)，分別加入12.5、25 pg mL_1 的Fe-MIL-101、VEGF(10 ng mL_1)和SK0V3分泌刺激液(CM)以及血管生成抑制劑SU5416(20 μΜ)，培養(yǎng)12小時，每隔6小時于顯微鏡觀察并拍照。每組實驗重復三次。
[0032]結果與結論:請參照附圖6，附圖6是Fe-MIL-1Ol對HUVEC細胞小管生成實驗圖。如圖6所示，在VEGF和SK0V3分泌刺激液(CM)實驗組中，細胞形成良好的網(wǎng)狀結構;在加入Fe-MIL-101的實驗組中，小管的數(shù)量和長度隨著Fe-MIL-1Ol濃度的增加而急劇減少，并且Fe-MIL-101 的抑制效果優(yōu)于傳統(tǒng)的酪氨酸激酶抑制劑SU5416(20 UMhFe-MIL-1Ol能抑制住腫瘤分泌液所刺激的血管生成，從而證實Fe-MIL-101是更具潛力的抑制劑。
[0033]實施4 Fe-MIL-101調節(jié)細胞中基質金屬蛋白酶的表達實驗。
[0034]蛋白免疫印跡法(SDS-PAGEA電泳):提取的蛋白樣品進行SDS-PAGEA凝膠電泳(濃縮膠4%，分離膠12%)分離，電泳條件:U=I 50 V，1=50 mA；隨后進行濕法轉膜，電泳條件:U=10V，I=50mA，將蛋白轉移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉膜上的非特異結合位點后，加入一抗]\^03-2(1:200)、]\?03-9(1:200)、6厶?0!1(1:3000)、0-&(^111(1:500)4°(:孵育過夜。次日PBST洗三次，加入1: 1000稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育I小時，PBST洗三次，顯影曝光。
[0035]結果與結論:請參照附圖7，附圖7是Fe -MIL-101對HUVEC細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達實驗圖。如圖7所示，F(xiàn)e-MI L-101抑制了 MMP-2和MMP-9蛋白的表達。實驗結果提示Fe-MIL-101靶向性針對MMP-2和MMP-9酶。
【主權項】
1.一種金屬有機骨架化合物在抗腫瘤血管生成抑制劑中的應用，其特征在于:所述的金屬有機骨架化合物為Fe-MIL-1Ol，其Langmuir和BET比表面積分別為5400 m2 g—1和3710m2 g—S有效濃度為12.5-25 pg mL—、2.根據(jù)權利要求1所述的金屬有機骨架化合物在抗腫瘤血管生成抑制劑中的應用，其特征在于，所述的血管生成為腫瘤病變組織的血管新生和腫瘤導致的血管新生。3.根據(jù)權利要求1所述的金屬有機骨架化合物在抗腫瘤血管生成抑制劑中的應用，其特征在于，所述的腫瘤為人非小細胞肺癌(A549)和人卵巢癌(SKOV3);血管生成所用的血管內皮細胞為人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC);用于對比的正常細胞為小鼠胚胎成纖細胞(BABL-3T3)。4.根據(jù)權利要求1所述的金屬有機骨架化合物在抗腫瘤血管生成抑制劑中的應用，其特征在于，所述的血管生成抑制劑具有選擇性抑制癌細胞和血管內皮細胞增殖但對正常細胞毒性較弱的作用。5.根據(jù)權利要求1所述的金屬有機骨架化合物在抗腫瘤血管生成抑制劑中的應用，其特征在于，所述的血管生成抑制劑具有抑制癌細胞和血管內皮細胞迀移的作用；具有抑制體外小管形成以及下調細胞微環(huán)境中基質金屬蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的表達的作用。
【文檔編號】A61P35/00GK105997978SQ201610299834
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】李斌, 陳道梅, 王家強, 聶敏芳
【申請人】云南大學