上調il24表達的小分子皂苷化合物的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類小分子皂苷化合物的應用，具體公開了該類小分子皂苷化合物在制備MDA?7/IL24基因治療制劑的應用。所述的小分子皂苷化合物的化學結構式如下(I)、(II)或(III)所示：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了該類小分子皂苷化合物具備上調IL24表達的作用，可望開發(fā)為MDA-7/IL24基因治療制劑，用于新型的抗腫瘤藥物的開發(fā)。
【專利說明】
上調IL24表達的小分子皂昔化合物的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一類小分子皂巧化合物的應用，尤其設及一類具有上調IL24表達作用 的小分子皂巧化合物，可望用于抗腫瘤藥物的開發(fā)，屬于生物醫(yī)藥領域。
【背景技術】
[0002] 皂巧類化合物因其特有的化學結構及理化性質，而具有抗腫瘤[13、增強免疫W、降 低血清膽固醇W、抗氧化W等多種藥理活性;能與細胞膜相互作用的特性使其在腫瘤的治 療中展現(xiàn)出良好的開發(fā)前景和應用價值。皂巧類化合物能通過阻滯細胞周期、誘導細胞調 亡、信號轉導通路、抑制腫瘤血管生成和抑制腫瘤細胞轉移等途徑而發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0003] 白細胞介素24QL24)又稱為黑色素瘤分化相關基因7(MDA-7)，是目前已知的唯一 一種既能抑制腫瘤生長又能刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用的基因，在腫瘤免疫治療中，誘 導各種不同腫瘤細胞調亡、啟動抗腫瘤"旁觀者效應"、增強腫瘤細胞對射線及化療藥物的 敏感性、抑制動物模型體內移植瘤的生長和血管新生W及具有調節(jié)免疫應答能力。2005年， 德國生產(chǎn)的基因治療制劑INGN-241投入臨床試驗，臨床I期試驗期間，于腫瘤局部注射 INGN-241后70%的癌組織中均可檢測到MDA-7/IL24表達增加及明顯的細胞調亡，與之前進 行的p53基因治療相比，MDA-7/IL24基因促腫瘤細胞死亡的作用更顯著[5]，大量MDA-7^L24 基因治療制劑進入臨床試驗階段
[0004] 絞股藍皂巧是絞股藍中主要的藥效成分，前期研究發(fā)現(xiàn)，熱處理絞股藍中存在一 類對A549細胞增殖有明顯抑制作用的小分子皂巧化合物展示出具有開發(fā)抗腫瘤藥物 的前景。
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【發(fā)明內容】

[0016] 本發(fā)明人運用基因芯片技術分析經(jīng)絞股藍中小分子皂骨化合物處理的腫瘤細胞 及空白對照組腫瘤細胞基因表達差異譜，發(fā)現(xiàn)處理組腫瘤細胞IL24比對照組腫瘤細胞IL24 有明顯高表達趨勢，運用RT-PCR及Western Blot法分別從mRNA水平及蛋白水平驗證該類小 分子皂骨化合物具有上調IL24表達的作用，可望用作MDA-7/IL24基因治療制劑，用于抗腫 瘤藥物的開發(fā)，從而完成了本發(fā)明。
[0017] 本發(fā)明中的小分子皂骨化合物的化學結構式如下：
[001 引
[0019] 其中，Ri優(yōu)選為H、Glc或G1嗎G1c;R2、R3優(yōu)選為G1嗎Glc或G1嗎G1噸(OAc)。
[0020] 本發(fā)明中優(yōu)選的腫瘤細胞i為人的非小細胞肺^A549細胞i。
[0021] 本發(fā)明中當小分子皂巧化合物濃度為15-4化g/mL，處理A549細胞12-4化時，基因 表達差異譜中處理組A549細胞IL24基因表達量為對照組A549細胞IL24基因表達量的2.03- 3.78倍;RT-PCR法對A549細胞中IL24在mRNA水平的表達進行驗證實驗中，小分子皂巧的濃 度為15-40yg/mL，處理A549細胞12-4化時，處理組IL24在mRNA水平的表達量為對照組的 2.317-214.183倍;Western Blot法對A549細胞中IL24在蛋白水平的表達進行驗證實驗中， 達木林B的濃度為15-40yg/mL，處理A549細胞12-4化，處理組IL24在蛋白水平的表達量為對 照組的1.32-3.41倍。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1基因忍片技術分析IL24基因表達差異
[0023] 小分子皂巧化合物達木林B(R2 = G1c馬Glc)的濃度為20yg/mL，處理A549細胞16h， 收集懸浮和貼壁的細胞，經(jīng)洗涂后，加入預冷的EP管中，每管加入ImL Trizol，用槍輕輕吹 打后至干冰中，基因忍片技術分析發(fā)現(xiàn)達木林B處理組A549細胞IL24基因表達量為對照組 的2.534倍。
[0024] 實施例2RT-PCR法分析IL24在mRNA水平的表達 [00巧]① A549細胞藥物處理及收集
[0026]將對數(shù)生長期A549細胞X 106的數(shù)量接種于25T細胞培養(yǎng)板中，待細胞匯合率 達80 %時，實驗組加8mL 20yg/mL達木林B ( R2 = G1 c聲1 c)，對照組加相同體積的DMEM培養(yǎng) 基，37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中分別解育16h，24h。收集懸浮和貼壁的細胞，經(jīng)洗涂后，加入預冷 的EP管中，每管加入ImL Trizol，用槍吹打數(shù)次，室溫放置5min。
[0027] ②總RNA提取
[002引 W0.2血樣本/mL Trizol的比例加入氯仿，蓋緊離屯、管，用手劇烈搖蕩離屯、管15s， 待充分乳化溶液呈乳白狀，室溫放置2-3min; 4 °C 12000xg離屯、15min;取上層水相于一新的 離屯、管，按0.5mL/mL Trizol的比例加入異丙醇，室溫放置20min;4°C 12000xg離屯、lOmin;棄 上清，按1 mL/mL Tr i zο 1液加入7 5 %乙醇（DEPC水配制）；輕輕上下翻轉，4 °C 7 500Xg離屯、 5min;小屯、棄上清，室溫干燥3min;將RNA溶于30-5化L DEPC水中；核酸紫外分光光度計測定 經(jīng)稀釋的RNA提取物的0D值和濃度，計算RNA濃度。
[0029] ③RNA的體外反轉錄
[0030] 反轉錄體系：扣L RNA，化L 01igo(dT)，4.扣L dd 出0(DEPC處理），7(TC解育5min， 然后迅速放在冰上。向反轉錄體系中加入5μΙ 5XBuffer，2化dNTP(10mM)，0.5yL Ribonuclease inhibitorawL M-MLV RT，42°C解育60min，然后70°C10min。得到cDNA。
[0031] ④引物設計
[0032]
[0033] ⑤ Real-Time PCR
[0034] Real-Time PCR體系：2化 cDNA，0.5化引物 1(10口111〇1/41^，0.5化引物2(10口111〇1/4 υ,ΙΟμΙ SYBR π?χ，7^ dd 出〇DReal-Time PCR程序設置：
[0035] 94。(：預變性1〇111111。94。(：變性153,60。(：退火6〇3，如此變性、退火循環(huán)45次。72。(：延 伸lOmin。
[0036] W上各步驟平行實驗Ξ次。
[0037] ⑥統(tǒng)計分析方法
[0038] 根據(jù)Real-time原始檢測結果，用相對定量2-Δ Δ CT法分析結果，mqookoop用各個 樣本的目的基因的Ct值-各個樣本的看家基因(GAPDH)的Ct值，得到Δ Ct;用Δ Ct-對照組的 大概均值，得到A ACT。用2-Δ ACT計算各個樣本目的基因的表達變化。
[0039] ⑦實驗結果
[0040]
[0041 ]注:+表示有效;-表示無效。
[0042] 該實驗表明小分子皂巧化合物達木林B能從mRNA水平上調IL24的表達。
[0043] 實施例3Western Blot法分析IL24在蛋白水平的表達
[0044] A549細胞藥物處理及蛋白樣品的收集
[0045] 將對數(shù)生長期A549細胞W1 X 107的數(shù)量接種于75T細胞培養(yǎng)板中，待細胞匯合率 達80%時，實驗組1:加16mL 20yg/mL達木林B(R2 = G1嗎Glc)，實驗組2:加16mL 30yg/mL gypenoside LI (化= Glc單Ic，C20為R構型），對照組加相同體積的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5%C〇2 培養(yǎng)箱中分別解育1211，2地，36}1。收集懸浮和貼壁的細胞，經(jīng)洗涂于預冷6口管中置于冰上， 加入10化L裂解液(每ImL細胞裂解液加入10化PMSF，PMSF終濃度為lmmol/L，PMSF需現(xiàn)用現(xiàn) 配），冰上裂解lOmin，使裂解液和細胞充分接觸。裂解后樣品4°C10,000g離屯、5min，取上清， 于-80°C保存。
[0046] ②BCA法檢測蛋白含量
[0047] 蛋白標準曲線按BCA蛋白質定量試劑盒操作說明完成。2扣L的標準品和待測樣品， 加到20化L的BCA工作液（工作液由試劑A和試劑B按體積比為50:1的比例配置），徹底混勻 后，加到96孔板中，37°C解育30min后冷卻至室溫，用酶標儀在562nm處檢測吸光度。
[004引③PVDF膜的轉印
[0049] 將裂解液進行SDS-PAGE電泳，80V，30min，120V，90min; PVDF膜在甲醇中浸泡約30 s 左右和濾紙浸泡在轉印緩沖液預濕；半干法轉染到PVDF膜上，1 ον，150min ;氨基黑染色 5min，甲醇稱去背景色，觀察條帶。
[0050] ④膜的準備
[0051] 將需要的轉印后的PVD刊莫浸在甲醇中活化，，室溫條件下在搖床上搖Imin，去除甲 醇用純水洗兩遍和TBST洗Ξ遍，清洗后，5 %脫脂奶粉室溫封閉化。
[0052] ⑤抗體檢測
[0化3] 將適當濃度的一抗(Anti-IL24ant化ody)加入10血封閉液中，加入封閉好的膜條， 4°C解育過夜；用洗涂液洗涂3次，每次5min;用封閉液來稀釋二抗:HRP標記的羊抗鼠 IgG (Sigma: 1:5000)，HRP標記的羊抗兔IgG(Thermo: 1:10000)，室溫下解育2h;洗涂液洗涂3次， 每次5min;ECL法檢測。
[0054] W上各步驟平行實驗Ξ次。
[0055] ⑥數(shù)據(jù)分析
[0056] 目的蛋白的灰度值除W內參β-Actin的灰度值W校正誤差，所得結果代表某樣品 的目的蛋白相對含量。用Prizm4統(tǒng)計分析軟件進行分析。
[0057] ⑦實驗結果
[0化引
[0059]注:+表示有效;-表示無效。
[0060]
[0061 ]注:+表示有效;-表示無效。
[0062] 實驗結果表明：小分子皂巧化合物達木林B和gypenoside LI均能從蛋白質水平上 調IL24的表達。
【主權項】
1. 一類小分子皂苷化合物在制備MDA-7/IL24基因治療制劑的應用，其特征在于所述小 分子皂苷化合物具有下式(I )、（I I)或（I II)的化學結構：該類小分子皂苷化合物具有上調腫瘤細胞中IL24表達的作用。2. 根據(jù)權利要求1所述的小分子皂苷化合物的應用，其特征在于R1優(yōu)選為H、Glc或 GlcgGlc; RlR3 優(yōu)選為 Glc^Glc 或 GlcgGlcgOAc)。3. 根據(jù)權利要求1所述的小分子皂苷化合物的應用，其特征在于，該類小分子皂苷化合 物既能從mRNA水平上調腫瘤細胞中IL24的表達，又能從蛋白質水平上調腫瘤細胞中IL24的 表達。4. 根據(jù)權利要求1所述的小分子皂苷化合物的應用，其特征在于，該小分子皂苷化合物 作用的腫瘤細胞，優(yōu)選為人的非小細胞肺癌A549細胞。5. 根據(jù)權利要求3所述的小分子皂苷化合物的應用，其特征在于，該小分子皂苷化合物 的作用濃度為20-40yg/mL，作用時間為12-48h。
【文檔編號】A61P35/00GK105998034SQ201610327957
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】樸香蘭, 邢韶芳, 王玉榮, 楊康
【申請人】中央民族大學