一種血管生成激動(dòng)劑多肽及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有血管生成激動(dòng)劑多肽，能治療缺血性疾病的多肽。其特征在于，所述多肽的序列為全新序列，具有促進(jìn)血管生成的作用。用于缺血性腦卒中。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的序列為GPR124細(xì)胞膜表面受體序列蛋白中篩選出的具有血管生成活性的新型小分子多肽，該多肽序列能特異性與整合素結(jié)合，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞在血管生成過(guò)程中粘附和遷移，從而起到治療缺血性疾病的作用。具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種血管生成激動(dòng)劑多肽及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及用于治療心腦血管疾病的血管生成激動(dòng)劑多肽藥 物。
【背景技術(shù)】：
[0002] 血管生成(Angiogenesis)是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成 新的血管，主要包括:激活期血管基底膜降解;血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、迀移;重建形成 新的血管和血管網(wǎng)，是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的多種分子的復(fù)雜過(guò)程。血管形成是促血管形成 因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過(guò)程，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破就 會(huì)激活血管系統(tǒng)，使血管生成過(guò)度或抑制血管系統(tǒng)使血管退化。血管生成是從先存血管產(chǎn) 生新血管的過(guò)程，血管生成可發(fā)生在傷口愈合、子宮內(nèi)膜周期性變化、腫瘤、心肌梗塞后和 糖尿病。
[0003] 腦卒中（Stroke)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)血管相關(guān)疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率的 特點(diǎn)。腦卒中分為缺血性腦卒中（ischemic stroke)和出血性腦卒中。缺血性腦卒中，又稱 為腦梗死，是腦血管病中最常見(jiàn)者，約占75%，病死率平均10%~15%，致殘率極高。目前， 臨床上干預(yù)缺血性腦卒中的方法很有限。在急性期時(shí)間窗內(nèi)使用抗凝劑的治療有效率為 5% ;神經(jīng)保護(hù)類藥物在治療腦卒中的研發(fā)期就慘遭失敗。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)，血管生成成可以通過(guò)多種途徑改善缺血性腦卒中引起的腦損傷。首先， 新生血管有利于新的側(cè)支循環(huán)形成，改善缺血區(qū)周圍的組織灌流，促進(jìn)氧和養(yǎng)分進(jìn)入組織； 其次，生長(zhǎng)因子，如纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)因子(FGF2)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子(VEGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，可促進(jìn)腦損傷區(qū)域中 內(nèi)皮細(xì)胞的生存，膠質(zhì)和神經(jīng)細(xì)胞存活，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡;再次，新生的血管參與切除受 損的組織；最后，促血管新生的微環(huán)境可以為神經(jīng)干細(xì)胞重塑和迀移提供"血管小境"。因 此，促進(jìn)血管生成能有效治療缺血性腦卒中，是缺血性腦卒中早期治療的重要途徑。
[0005] G-蛋白偶聯(lián)受體 124(G_protein coupled receptor 124，GPR124)是2003年發(fā)現(xiàn) 的新型細(xì)胞膜表面受體。最初，GPR1 24被確定作為腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)記物（Tumor endothelial marker，TEM)，因此又稱為TEM5APR124因具有較長(zhǎng)的細(xì)胞外區(qū)域與7個(gè)跨膜 區(qū)域的GPCR蛋白水解域GPS(GPCR proteolytic site)，被確認(rèn)為黏附類G-蛋白偶聯(lián)受體。
[0006] 近幾年在體研究發(fā)現(xiàn)，GPR124在調(diào)節(jié)CNS血管生成過(guò)程中，起著至關(guān)重要的作用。 首先，GPR124在CNS內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞(Pericyte)特異性表達(dá)，這樣特點(diǎn)說(shuō)明GPR124具有 CNS血管特異性;再次，GPR124通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成發(fā)芽和細(xì)胞迀移的方式，促進(jìn)特異性CNS血 管形成，說(shuō)明GPR124不僅具有血管生成的作用，而且對(duì)血管生成后期，對(duì)成熟血管的形成也 有作用；其次，GPR12促進(jìn)血腦屏障的建立。因此，GPR124是特異性介導(dǎo)CNS血管生成的新型 內(nèi)皮細(xì)胞受體，可以成為治療CNS血管相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)。
[0007] 研究發(fā)現(xiàn)，GPR124可以作用于血管生成:細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)上的蛋白酶，如凝血酶、 基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)能使可溶性TEM5(sTEM5)從GPR124上脫 落下來(lái)，與整合素特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞在血管生成過(guò)程中粘附和迀移；內(nèi)皮細(xì)胞分化 形成小管，sTEM5從GPR124上脫落下來(lái)與整合素 av03特異性結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向周細(xì)胞的 迀移和粘附，形成特異性CNS血管，建立BBB。盡管如此，現(xiàn)階段沒(méi)有關(guān)于STEM5直接用于治療 缺血性疾病，包括腦卒中的研究。而且，GPR124上脫落下來(lái)的可溶性TEM5 (s TEM5)分子量較 大，短期接觸會(huì)誘發(fā)免疫變態(tài)反應(yīng)，長(zhǎng)期接觸則會(huì)引起抗體中和現(xiàn)象，從而出現(xiàn)藥物抵抗。 因此，發(fā)明人希望能找到具有sTEM5功能，且分子量小的多肽，促進(jìn)血管生成。最終，將該小 分子用于開(kāi)發(fā)成缺血性腦卒中的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0008] 本發(fā)明目的是針對(duì)設(shè)計(jì)一種血管生成激動(dòng)劑多肽，具有促進(jìn)血管生成作用，可以 用于治療缺血性腦卒中。分子量小，特異性強(qiáng)。
[0009] 本發(fā)明技術(shù)方案是提供一種血管生成激動(dòng)劑多肽，序列為RGDFRWPR，其序列為全 新的序列。具有促進(jìn)血管生成作用，用于缺血性腦卒中治療。所述的多肽，采用化學(xué)合成法 制備。
[0010] 本發(fā)明的原理是發(fā)明人分析了 GPR124細(xì)胞膜表面受體的不同功能區(qū)；根據(jù)不同功 能區(qū)，從GPR124序列蛋白截取出多條多肽序列，并加以修飾;經(jīng)過(guò)初步篩選出能與功能性整 合素受體特異性結(jié)合的多肽序列;然后進(jìn)行血管生成的試驗(yàn)，并確定具有血管生成活性的 新型小分子多肽;最后，采用在體動(dòng)物疾病模型試驗(yàn)，驗(yàn)證本發(fā)明多肽促進(jìn)血管生成和治療 缺血性疾病的藥用價(jià)值。
[0011] 有益結(jié)果：
[0012]本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的序列RGDFRWPR為血管生成激動(dòng)劑多肽，是從 GPR124細(xì)胞膜表面受體序列蛋白中篩選出的具有血管生成活性的新型小分子多肽。發(fā)明人 經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)獲知本發(fā)明的血管生成激動(dòng)劑多肽能夠特異性與整合素結(jié)合，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞 在血管生成過(guò)程中粘附和迀移，從而起到治療缺血性疾病，包括缺血性腦卒中的作用。具有 潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1血管生成激動(dòng)劑多肽質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果。
[0014] 圖2血管生成激動(dòng)劑多肽的高效液相色譜色譜圖。
[0015] 圖3血管生成激動(dòng)劑多肽分子對(duì)接模擬圖。（A)分子對(duì)接圖，其中白色框內(nèi)為血管 生成激動(dòng)劑多肽；（B)分子對(duì)接活性位點(diǎn)圖，標(biāo)出受體分子與血管生成激動(dòng)劑多肽結(jié)合的的 氨基酸殘基：1. Arg精氨酸；2. Gly甘氨酸；3 . Asp天冬氨酸;4. Phe苯丙氨酸；5 . Trp色氨酸； 6. Pro脯氨酸。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1
[0017]多肽的化學(xué)合成方法
[0018]多肽采用固相化學(xué)合成法合成（由Karebay Biochem公司合成），采用高效液相色 譜儀純化，得到多肽。采用質(zhì)譜測(cè)定如圖1，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。用RP-HPLC法測(cè)定 多肽純度，結(jié)果顯示，實(shí)施例1得到的多肽度為97.95%，符合設(shè)計(jì)要求。色譜圖如圖2。
[0019] 實(shí)施例2
[0020] 多肽與受體分子對(duì)接的結(jié)果
[0021]采用分子對(duì)接軟件的分子對(duì)接函數(shù)模塊，評(píng)價(jià)多肽與受體分子對(duì)接的程度。方法： (1)受體準(zhǔn)備:從Brookheaven蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www? rcsb ? org/pdb/)，檢索到 相應(yīng)蛋白受體的PDB號(hào)；（2)配體準(zhǔn)備:分析了GPR124細(xì)胞膜表面受體的不同功能區(qū)；根據(jù)不 同功能區(qū)，從GPR124序列蛋白截取出SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，以此為配體結(jié)構(gòu)；（3)分子 對(duì)接:把C-score選項(xiàng)選中，運(yùn)行docking，進(jìn)行函數(shù)打分。
[0022] 評(píng)價(jià)打分結(jié)果顯示，實(shí)施例1的多肽與特異性受體結(jié)合的total-score值為 11.2391。符合軟件規(guī)定的特異性結(jié)合要求大于4。因此，實(shí)施例1多肽能特異性和靶點(diǎn)受體 有特異性結(jié)合。對(duì)接模擬圖如圖3所示。
[0023] 實(shí)施例3
[0024]采用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)多肽對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞迀移的影響。先用marker筆在24孔板背 后，用直尺比著，均勻得劃?rùn)M線，大約每隔0.5cm-道，橫穿過(guò)孔。每孔穿過(guò)3條線;將成對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞，以2.0X10 5個(gè)/孔加入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。第二天用10yl槍頭比著 直尺，垂直于背后的橫線劃痕，以劃痕和背后橫線的交叉點(diǎn)為固定觀察位點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性 藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物血管生成激動(dòng)劑多肽和陽(yáng)性對(duì)照多肽sTEM5;空 白組加入相同體積的溶劑，每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔;放入37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，12，24小 時(shí)，拍照;測(cè)量〇，12，24劃痕寬度。以不同的時(shí)間點(diǎn)，記錄每孔三個(gè)固定位置處劃痕寬度的變 化，即為細(xì)胞迀移距離。按照公式計(jì)算迀移率(migration rate，MR):迀移率=實(shí)驗(yàn)第0小時(shí) 的劃痕寬度-實(shí)驗(yàn)第n小時(shí)的劃痕寬度，迀移促進(jìn)率％ =(實(shí)驗(yàn)組的迀移率-空白組的迀移 率）X 100%/空白組的迀移率。
[0025]表1實(shí)施例1多肽對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞迀移的作用
[0027] *p<〇.〇5,林p<0.01與空白組相比
[0028] 結(jié)果如表1所示，血管生成激動(dòng)劑多肽能夠促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞迀移，以10μg/ml 的12h的迀移促進(jìn)率最高，為125.55%。
[0029] 實(shí)施例4
[0030] 血管生成激動(dòng)劑多肽對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。采用MTT比色法評(píng)價(jià)多肽人 血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞，以8.0 X 104個(gè)/孔加入96孔培養(yǎng)板中， 培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物血管生成激動(dòng)劑多肽和陽(yáng) 性對(duì)照多肽sTEM5;空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入 MTT，作用4h后，加入DMS0，孵育lOmin，在酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定吸光度A值，按公式腫瘤細(xì)胞生 長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值）X 100%。結(jié)果顯示，血管生成激動(dòng)劑多肽對(duì) HUVEC細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞增殖作用，即沒(méi)有細(xì)胞毒性。
[0031] 實(shí)施例5
[0032] 血管生成激動(dòng)劑多肽對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。采用血管內(nèi)皮細(xì)胞小 管形成試驗(yàn)評(píng)價(jià)多肽對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。將l〇mg/ml Matrigel基質(zhì)膠加 入96孔板內(nèi)，每孔40yl，于37°C培養(yǎng)箱中聚合lh。再將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞，以4000個(gè)/100 yl/孔加入培養(yǎng)板中，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入培養(yǎng)基、不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物 血管生成激動(dòng)劑多肽和陽(yáng)性對(duì)照藥物多肽sTEM5;空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)三個(gè) 復(fù)孔，在37°C，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于藥物作用6h、9h、12h在顯微鏡下觀察各組管狀結(jié) 構(gòu)的形成情況，拍照、記錄小管形成的數(shù)量。
[0033] 表2實(shí)施例1多肽對(duì)小管形成試驗(yàn)的影響
[0035] *p<0.05,林p<0.01與空白組相比
[0036] 結(jié)果如表2所示:血管生成激動(dòng)劑多肽能夠促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成，以5iig/ ml的12h的小管形成的數(shù)量最多，在6、9、12h的小管形成數(shù)量分別為318.0±13.0、190.0土 4.0(p<0.05)、152.3±1.5(p<0.01)。
[0037] 實(shí)施例6
[0038]血管生成激動(dòng)劑多肽對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)血管新生的影響。取6-8W的SD雄性大鼠4只，斷 頸椎處死，取動(dòng)脈，放入含高抗PBS液中清洗，用眼科手術(shù)剪及鑷子去除脈管外纖維和脂肪 組織;切取0.5~1_長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán)，用含高抗的PBS液清洗數(shù)遍;在預(yù)冷的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔加入預(yù)先融化的5mg/ml Matrigel基質(zhì)膠60yl(提前12h將10mg/ml Matrigel放入4°C 冰箱中融化，使用前用培養(yǎng)基稀釋2倍），將胸主動(dòng)脈環(huán)平行放入膠中包埋，每孔2個(gè)動(dòng)脈環(huán)； 37 °C聚合15min，使膠凝固；每孔加入用的DMEM培養(yǎng)液(含10 % FBS，VEGF 5ng/ml)配制的藥 液lOOyl，分別為實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入培養(yǎng)基、不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物血管生成 激動(dòng)劑多肽和陽(yáng)性對(duì)照藥物多肽sTEM5;空白組加入相同體積的溶劑，每個(gè)濃度至少3個(gè)復(fù) 孔，隔天更換新鮮培養(yǎng)基并加藥;第5、7日倒置顯微鏡下觀察動(dòng)脈環(huán)附近內(nèi)皮細(xì)胞和新生血 管的生成情況，記錄每個(gè)動(dòng)脈環(huán)一圈的微血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)。試驗(yàn)得到的結(jié)果計(jì)算mean±SD，并 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)T檢驗(yàn)，*P<0.05為顯著性差異，**P<0.01為極顯著性差異。
[0039]表3實(shí)施例1多肽對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)血管生成的影響
[0041 ] *p<0.05，#p<0.01 與空白組相比
[0042]結(jié)果如表3所示:實(shí)施例1多肽能夠促進(jìn)大鼠動(dòng)脈環(huán)血管生成，在劑量在l-10iig/ml 時(shí)呈劑量依賴性，在lOμg/ml時(shí)作用最強(qiáng)，與空白組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<〇.〇5)。
[0043] 實(shí)施例7
[0044]血管生成激動(dòng)劑多肽對(duì)大鼠腦梗塞模型的影響。取8-12W的SD雄性大鼠，建立大鼠 腦梗塞模型，觀察血管生成激動(dòng)劑多肽對(duì)大鼠腦梗塞模型的影響。大鼠麻醉，取頸部右側(cè)旁 切口，分離右側(cè)頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA)，分離ECA主干，在其遠(yuǎn)端1.5cm處結(jié)扎、切 斷。不打開(kāi)頸動(dòng)脈鞘，不分離和結(jié)扎翼腭動(dòng)脈(PPA)。提拉ECA殘端的結(jié)扎線，用微型血管夾 在CCA分出ECA處，將ECA臨時(shí)夾閉，在血管夾與ECA殘端之間結(jié)扎一道縫合線，不打緊。使用 0.2-0.3mm尼龍線硅膠線支持導(dǎo)管栓子，由ECA殘端附近進(jìn)線，扎緊縫合線，松開(kāi)血管夾，推 動(dòng)尼龍線進(jìn)人ICA，進(jìn)人距ICA和ECA分叉處。約1.8-1.9cm時(shí)，有阻擋感，表明栓線已越過(guò)大 腦中動(dòng)脈(MCA)，到達(dá)大腦前動(dòng)脈(ACA)的起始部。記錄栓塞開(kāi)始時(shí)間，將ECA上縫合線扎緊。 栓塞后2h，將尼龍線拔出。以神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為評(píng)價(jià)腦功能缺損程度指標(biāo)，描述為:0分-無(wú) 神經(jīng)功能缺損癥狀，大鼠被提尾懸空時(shí)兩前肢向地面伸直;1分-輕微的神經(jīng)功能缺損，大鼠 被提尾懸空時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢呈屈曲、抬高、肩內(nèi)收、肘關(guān)節(jié)伸直;2分-中度局灶性神經(jīng)功能 缺損，有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)征象;3分-重度局灶性神經(jīng)功能缺損，有向病灶對(duì)側(cè)跌倒征象;4分-無(wú)自發(fā)活動(dòng)及認(rèn)知水平下降。1-3級(jí)為模型制作成功。模型建立后將60只模型大鼠機(jī)分為6 組，治療組和對(duì)照組。各組均于當(dāng)天(第一天)尼龍線拔出時(shí)給予皮下注射相應(yīng)藥物，隨后，2 次/d，共10d;治療組皮下注射實(shí)施例1多肽，劑量分別為20、10、5、2.5mg/Kg，對(duì)照組尿激酶， 劑量為5000U/Kg。造模后第14d觀察神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，同時(shí)，取腦組織，切片、2 % TTC染色、孵 育、固定后，拍照并使用Image ProPlUS6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腦片梗死面積及腦片面積，按 照公式計(jì)算腦梗塞面積百分比，腦梗塞面積百分比=(腦片梗死面積/腦片面積）X 100%。
[0045]表4實(shí)施例1多肽對(duì)大鼠腦梗塞模型的影響
[0047] 邙<0.05，*邙<0.01與模型組相比
[0048]實(shí)施例1多肽對(duì)大鼠腦梗塞模型結(jié)果如表4顯示:實(shí)施例1多肽能夠改善腦梗塞模 型大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，在劑量在2.5-20mg/Kg時(shí)呈劑量依賴性，與模型組相比，具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異。另外，實(shí)施例1多肽能夠減少大鼠腦梗塞面積，與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0049]結(jié)論:實(shí)施例1多肽對(duì)大鼠腦梗塞模型腦梗塞模型療效明顯，可作為臨床大鼠腦梗 塞模型腦梗塞有效的候選治療方法。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種血管生成激動(dòng)劑多肽，其特征在于，所述多肽的序列為SEQ ID NO: 1。2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的多肽，其特征在于，具有促進(jìn)血管生成的功能。3. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的多肽，其特征在于，用于治療缺血性疾病的作用。4. 根據(jù)權(quán)利要求書3所述的多肽，其特征在于，所述的缺血性疾病為缺血性腦卒中。5. 根據(jù)權(quán)利要求書1-4任一所述的多肽，其特征在于，可采用重組表達(dá)體或化學(xué)合成的 方法制備。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK105968187SQ201610407048
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】肖紅, 沈鴻, 李 瑞
【申請(qǐng)人】南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院