一類新的抑制新生血管的小肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類預(yù)防和抑制血管新生的多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述多肽的制法和應(yīng)用以及含所述多肽的藥物組合物。本發(fā)明多肽具有多種優(yōu)點，例如分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度等。
【專利說明】一類新的抑制新生血管的小肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及新的具有抑制新生血管作用的多肽，稱之為UK12多肽。具體地說，本發(fā)明涉及UK12多肽的氨基酸序列和制備方法，以及該多肽抑制體外血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、管腔形成和抑制體內(nèi)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的作用。
【背景技術(shù)】
[0002]新生血管的形成是一個極其復(fù)雜的過程，它包括:現(xiàn)存血管的擴張、血管通透性的增加、血管周圍基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細胞的激活增殖、遷移以及新的毛細血管樣管腔的形成。
[0003]在眼部，約2/3的致盲性疾病均與病理性新生血管有關(guān)，例如:單純皰疹性角膜基質(zhì)炎引起的角膜新生血管，年齡相關(guān)性黃斑變性中的脈絡(luò)膜新生血管，以及糖尿病視網(wǎng)膜病變或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中的視網(wǎng)膜新生血管等。目前臨床上，對于眼部病理性新生血管常規(guī)運用激光光凝、光動力學(xué)療法(Photodynamic therapy, PDT)以及經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?Thermal transpupilIary therapy, TTT)等進行治療。然而，這些治療手段不僅對局部組織易造成破壞，其遠期療效也并不十分令人滿意。因此，近年來人們不斷嘗試開發(fā)治療眼部病理性新生血管更有效的方法。
[0004]在開發(fā)有效的血管新生抑制劑時，應(yīng)充分考慮到眼科用藥的特殊性。
[0005]第一，眼部存在多個解剖性和功能性的屏障。全身給藥常常由于血-房水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障而無 法在眼組織局部達到足夠的藥物濃度；局部給藥，如玻璃體腔注射，大于76.5kDa的大分子在理論上很難穿透視網(wǎng)膜作用于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管。對于眼表給藥，藥物必須要先后穿透親脂性的角膜上皮細胞緊密連接和親水性的角膜基質(zhì)，因此只有具備適當(dāng)脂溶性、低分子量或能與眼表組織內(nèi)的轉(zhuǎn)運體(如:氨基酸轉(zhuǎn)運體、寡肽轉(zhuǎn)運體等)結(jié)合的藥物才能到達前房發(fā)揮作用。
[0006]第二，藥物在親水的淚液、房水、玻璃體液中溶解的程度與其有效性呈正相關(guān)。
[0007]第三，基于上述主要原因，眼科用藥的生物利用度很低；要使之提高，可加大給藥的濃度。用于治療腫瘤新生血管的化合物毒副作用較為明顯，全身和局部均無法高劑量給藥。此外，分子量較大的外源性蛋白質(zhì)也是敏感的異物源，可對眼部組織(如:葡萄膜)造成免疫損傷。
[0008]第四，目前雖然已經(jīng)有一系列相對安全的內(nèi)源性血管新生抑制劑被先后證實，如血管抑素(angiostatin),它由纖溶酶原 Kringle 結(jié)構(gòu)域 1-4(plasminogen Kringlel-4)組成，可明顯抑制血管依賴性腫瘤的生長，但由于其分子量較大且空間構(gòu)象復(fù)雜，故在制備過程中存在重組表達純化工藝繁瑣和內(nèi)毒素殘留等不足。正是由于上述種種條件的限制，目前用于治療眼部新生血管的藥物十分有限，比如重組抗人VEGF單克隆抗體bevacizumab (Avastin)、重組抗人 VEGF 單克隆抗體片段 ranibizumab (Lucentis)等,但它們價格高昂，并且需反復(fù)經(jīng)玻璃體腔給藥，甚至可引起血管栓塞等風(fēng)險。
[0009]由此可見，尋找具有特異生物學(xué)活性和生物相容性的小分子抑制劑，經(jīng)無創(chuàng)或微創(chuàng)的給藥途徑透過各種眼組織屏障，提高眼局部的生物利用度，降低給藥劑量，減少局部和全身的副作用，對新生血管性眼病的臨床防治具有十分重要的意義。
[0010]因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種適于眼球組織的有效安全的小分子新生血管抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一類適于眼球組織的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、類似物和衍生物。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供含所述多肽的制法和應(yīng)用。
[0013]在本發(fā)明的第一方面，提供了在本發(fā)明的第一方面，提供了一種下式I表不的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽
[0014][XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO]-[XaalI]-[Xaal2]-[Xaal3] (I)
[0015]式中，
[0016]XaaO是無，或I~3個氨基酸構(gòu)成肽段；
[0017]Xaal 是選自下組的氨基酸:Tyr ；Trp ；Phe ；Thr ；bJc Ser ；
[0018]Xaa2 是選自下組的氨基酸:Val ；Ile ；Leu ；Met ；Phe -Mkla ；
[0019]Xaa3是選自下組的氨基酸:Gln ;或Asn ;
[0020]Xaa4 是選自下組的氨基酸:Val ；Ile ；Leu ；Met ；Phe ^Ala ；
[0021]Xaa5是選自下組的氨基酸:Gly ；Pro ;*Ala ；
[0022]Xaa6 是選自下組的氨基酸 Leu ；Ile ；Val ；Met ；Ala ^Phe ；
[0023]Xaa7 是選自下組的氨基酸:Lys ；Arg ；Gln ;*Asn ；
[0024]Xaa8是選自下組的氨基酸:Pro ;*Ala ；
[0025]Xaa9 是選自下組的氨基酸:Leu ；Ile ；Val ；Met ；Ala ;或 Phe ；
[0026]XaalO 是選自下組的氨基酸:Val ；Ile ；Leu ；Met ；Phe jAla;
[0027]Xaall是選自下組的氨基酸:Gln ;*Asn ；
[0028]Xaa12是選自下組的氨基酸:Glu ;*Asp ；
[0029]Xaa13是無，或I~3個氨基酸構(gòu)成肽段；
[0030]并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為12~18個氨基酸。 [0031]更佳地，所述的多肽中:
[0032]XaaO 是無；
[0033]Xaal是選自下組的氨基酸:Tyr ;或Phe ;
[0034]Xaa2是選自下組的氨基酸:Val ;或Leu ；
[0035]Xaa3是選自下組的氨基酸:Gln ;*Asn ；
[0036]Xaa4是選自下組的氨基酸:Val ;或Leu ；
[0037]Xaa5是選自下組的氨基酸:Gly ;或Ala ;
[0038]Xaa6是選自下組的氨基酸:Leu ;或Ile ;
[0039]Xaa7是選自下組的氨基酸:Lys ;*Arg ;
[0040]Xaa8是選自下組的氨基酸:Pro ;*Ala ；[0041]Xaa9是選自下組的氨基酸:Leu ;或lie ;
[0042]XaalO是選自下組的氨基酸Val ;或Leu ；
[0043]Xaall是選自下組的氨基酸:Gln ;Asn ;
[0044]Xaa12是選自下組的氨基酸:Glu ；Asp ；
[0045]Xaa 13 是無。
[0046]在另一優(yōu)選例中，所述多肽的長度為12~16個氨基酸；
[0047]在另一優(yōu)選例中，所述多肽的長度為11~14個氨基酸。
[0048]在另一優(yōu)選例中，所述多肽選自下組:
[0049](a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；
[0050](b)將SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列經(jīng)過1_5個(較佳地1_4，更佳地1_3個，最佳地，1-2個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID N0:2的所示多肽的抑制血管新生活性。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽與SEQ ID N0:2的相同性≥80%，較佳地≥90% ；更佳地> 95%。
[0053]本發(fā)明還提供了具有抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚體和多聚體形式。
[0054]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發(fā)明上述的多肽。
[0055]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有:
[0056](a)本發(fā)明上述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；和
[0057](b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0058]在另一優(yōu)選例中，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑(如眼周和眼內(nèi)注射液)、眼用凝膠或眼藥膏。
[0059]在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為緩釋劑型。
[0060]在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明所述多肽或藥學(xué)上可接受的鹽的用途，它們被用于制備抑制血管新生或防治與血管新生相關(guān)疾病的藥物。
[0061]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種抑制哺乳動物血管新生的方法，包括步驟:給需要的對象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0062]在另一優(yōu)選例中，所述的對象是人。
[0063]在另一優(yōu)選例中，所述的血管新生是與新生血管性眼病相關(guān)的血管新生。
[0064]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0066]圖1顯示了小肽UK12對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVECs增殖的影響。小VEGFlOng/ml能夠顯著誘導(dǎo)HUVECs增殖，與無VEGF對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(# #與NoVEGF組相比，P〈0.01)。UK12在濃度為ΙΟΟηΜ、I μ M、10 μ M時能夠有效抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖，并且隨著UK12濃度的增加，抑制作用逐漸增強。(**與VEGF組相比，Ρ〈0.01)。UK12S多肽不具有抑制VEGF誘導(dǎo)HUVECs增殖的作用。
[0067]圖2顯示了 UK12多肽對VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞遷移的抑制作用VEGF25ng/ml能夠顯著誘導(dǎo)HUVECs遷移，與無VEGF對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(# #與No VEGF組相比，Ρ〈0.01)。UK12在濃度為I μ MUO μ M時能夠有效抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs遷移，并且隨著UK12濃度的增加，抑制作用明顯增強(林與VEGF組相比，Ρ〈0.01)。UK12S多肽不具有抑制VEGF誘導(dǎo)HUVECs遷移的作用。
[0068]圖3顯示了 UK12多肽對VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞管腔形成的抑制作用。
[0069]A圖為No VEGF組管腔樣結(jié)構(gòu)形成少，B圖為VEGF組管腔樣結(jié)構(gòu)形成明顯增多，彼此交錯呈網(wǎng)狀。C圖UK12多肽10 μ M濃度時管腔樣結(jié)構(gòu)形成與VEGF組相比明顯減少。D圖UK12S多肽10 μ M濃度時管腔樣結(jié)構(gòu)形成與VEGF組相比無明顯減少。E圖UK12多肽在濃度為ΙΟΟηΜ、I μ Μ、10 μ M時能夠有效抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs管腔形成，并且隨著濃度的增加，抑制作用明顯增強(林與VEGF組相比，P < 0.01)。UK12S多肽不能抑制VEGF誘導(dǎo)HUVECs管腔形成。
[0070]圖4顯示了視網(wǎng)膜Isolectin染色后，UK12多肽抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管。
[0071 ] 空氣+PBS組及空氣+UK12多肽組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)正常，無視網(wǎng)膜血管擴張迂曲等改變；氧氣+PBS組小鼠視網(wǎng)膜中央可見大片無灌注區(qū)，視網(wǎng)膜血管擴張迂曲，在中央無灌注區(qū)和周邊灌注區(qū)交界處可見大量異常新生血管；與氧氣+PBS組相比，氧氣+UK12多肽組小鼠視網(wǎng)膜中央無灌注區(qū)面積明顯縮小，中央視網(wǎng)膜血管擴張迂曲情況好轉(zhuǎn)，視網(wǎng)膜異常新生血管減少；氧氣+UK12S多肽組小鼠視網(wǎng)膜中央也可見大片無灌注區(qū)，視網(wǎng)膜血管擴張迂曲明顯，在中央無灌注區(qū)和周邊灌注區(qū)交界處可見大量異常新生血管。(圓圈顯示新生血管叢，星號顯示無灌注區(qū)，箭頭顯示突出于視網(wǎng)膜表面的新生血管)
[0072]圖5顯示了視網(wǎng)膜組織切片HE染色后，UK12多肽抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管。
[0073]空氣+PBS組和空氣+UK12多肽組突出于視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的有核細胞數(shù)相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ>0.05)。高氧+PBS組和高氧+UK12S組可見大量突出于內(nèi)界膜長入玻璃體腔的有核細胞，組成管腔樣結(jié)構(gòu)，兩者相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(ρ>0.05)。高氧+UK12組僅見少量突出于內(nèi)界膜長入玻璃體腔的有核細胞，與空氣+PBS組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(ρ〈ο.οι) ο
【具體實施方式】
[0074]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次制備了一類具有抑制血管新生功能的，分子量小于3kD的小分子多肽。具體而言，本發(fā)明人應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，基于同源性分析和生物學(xué)特性等分析，對源自人體的各種蛋白的不同區(qū)域進行了大量的篩選，從中鑒別并合成了一類小分子多肽(如UK12)，并運用HPLC及MS對之進行鑒定，再經(jīng)氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型、VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖模型和人臍靜脈內(nèi)皮細胞管腔模型篩選，獲得了一類新型的、具有預(yù)防和治療血管新生相關(guān)疾病的小分子多肽。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0075]本發(fā)明的小肽的分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；安全性高，對生物組織毒副作用??；眼局部用藥生物利用度高，可減少劑量，從而減小全身副作用。
[0076]尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-typeplasminogen activator, uPA)
[0077]uPA是一種高度特異的絲氨酸蛋白酶，基因位于第10號染色體，分子質(zhì)量55ku，以低活性的前體分泌(pro_uPA)。uPA由一個羧基端蛋白酶區(qū)域、一個生長因子樣的區(qū)域和一個kringle結(jié)構(gòu)域組成,其中uPA的kringle結(jié)構(gòu)域為一種大分子蛋白類新生血管抑制劑，能夠抑制堿性成纖維生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和上皮細胞生長因子(EGF)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增生，并且能夠有效的抑制體內(nèi)新生血管形成。
[0078]活性多肽
[0079]在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明多肽”、“UK12多肽”、“UK12小肽”、“短肽UK12”或“肽UK12”可互換使用，都指具有血管新生抑制活性的肽UK12氨基酸序列(如SEQ ID N0:2所示)的蛋白或多肽。此外，所述術(shù)語還包括具有抑制血管新生功能的、SEQ ID N0:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):1-5個(較佳地1-4個，更佳地1-3個，最佳地1-2個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個(通常為4個以內(nèi)，較佳地為3個以內(nèi)，更佳地為2個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，所述術(shù)語還包括單體和多聚體形式本發(fā)明多肽。該術(shù)語還包括線性以及非線性的多肽(如環(huán)肽)。一種典型的多肽為C末端和/或N末端缺失一個氨基酸，即構(gòu)成12個氨基酸的多肽。 [0080]本發(fā)明還包括UK12多肽的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或
(iii)UK12多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導(dǎo)序列、分泌序列或6His等標(biāo)簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0081]一類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多5個，較佳地至多4個，更佳地至多3個，最佳地1-2個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0082]表1
[0083]
【權(quán)利要求】
1.一種下式I表示的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽
[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO]-[XaalI]-[Xaal2]-[Xaal3](I) 式中， XaaO是無，或I~3個氨基酸構(gòu)成肽段； Xaal是選自下組的氨基酸:Tyr ；Trp ；Phe ；Thr ;或Ser ； Xaa2是選自下組的氨基酸:Val ；Ile ；Leu ；Met ；Phe ;或八1已； Xaa3是選自下組的氨基酸:Gln ;*Asn ； Xaa4是選自下組的氨基酸:Val ；Ile ；Leu ；Met ；Phe ;或Ala ； Xaa5是選自下組的氨基酸:Gly ；Pro ;*Ala ； Xaa6是選自下組的氨基酸:Leu ；Ile ；Val ；Met ；Ala ;或Phe ； Xaa7是選自下組的氨基酸:Lys ；Arg ；Gln ^Asn ； Xaa8是選自下組的氨基酸:Pro ;*Ala ； Xaa9是選自下組的氨基酸:Leu ；Ile ；Val ；Met ；Ala ;或Phe ； XaalO是選自下組的氨基酸:Val ；Ile ；Leu ；Met ；Phe ;或Ala ； Xaall是選自下組的氨基酸:Gln ;*Asn ； Xaa12是選自下組的氨基酸:Glu ;*Asp ； Xaa13是無，或I~3個氨基酸構(gòu)成肽段； 并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為12~18個氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO是I~3個氨基酸構(gòu)成的肽段。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaal3是I~3個氨基酸構(gòu)成的肽段。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自下組: (a)具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽； (b)將SEQID NO:2所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有: (a)權(quán)利要求1所述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；和 (b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為針劑、眼藥水、眼用凝膠或眼藥膏。
8.如權(quán)利要求1所述的多肽或藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備抑制血管新生或防治與血管新生相關(guān)的疾病的藥物。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的與血管新生相關(guān)的疾病的選自下組:新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動脈硬化、閉塞性動脈硬化、動脈栓塞、動脈血栓、Berger's病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥和肉瘤狀病。
10.一種抑制哺乳動物血管新生的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。
【文檔編號】A61P9/00GK104004057SQ201310058978
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月25日
【發(fā)明者】蘇莉 申請人:上海市第一人民醫(yī)院