一種抗核抗體定量檢測試劑盒和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種定量檢測人血清中抗核抗體的試劑盒和使用方法，所述試劑盒用 于人血清中均質(zhì)型或斑點型抗核抗體的定量檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗核抗體（antinuclear antibody,ANA)又稱抗核酸抗原抗體，是一組將自身真核 細胞的各種成分脫氧核糖核蛋白（DNP)、DNA、可提取的核抗原（ENA)和RNA等作為靶抗原 的自身抗體的總稱，主要存在于血清中?？购丝贵w在多種自身免疫病中均呈不同程度的陽 性率，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE，95%~100% )、類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA，10%~20% )、混合性 結(jié)締組織?。∕CTD，80%~100%)、干燥綜合癥（SjS，10%~40%)、全身性硬皮?。?5%~ 90% )、狼瘡性肝炎（95%~100% )、原發(fā)性膽汁性肝硬化（95%~100% )等。
[0003] 目前，全世界約有6000個實驗室檢測抗核抗體，超過90%的檢測實驗室用經(jīng)典的 間接免疫熒光法（IFA)。通過梯度稀釋檢測血清樣本測定其自身抗體滴度可實現(xiàn)血清中抗 核抗體的定量。但是，作為間接免疫熒光檢測量化指標的細胞核熒光信號以前一直依賴于 檢測人員的肉眼主觀判定，這在很大程度造成了定量結(jié)果缺乏重復性、可信性。并且現(xiàn)有的 間接免疫熒光滴度定量方法需要進行連續(xù)梯度稀釋，操作繁瑣，工作量大，造成了工作效率 降低，檢測樣本數(shù)量受限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測人血清中抗核抗體的試劑盒和其使用方法，通 過本發(fā)明提供的方法使用該試劑盒可以簡化抗核抗體檢測試驗步驟，消除實驗操作者判斷 的主觀因素和檢測儀器差異性帶來的負面影響，從而使人血清抗核抗體定量檢測結(jié)果更加 精確和客觀可信。
[0005] 本發(fā)明提供的抗核抗體檢測試劑盒由以下幾部分構(gòu)成：（l)Hep-2細胞抗原片； (2)熒光標記二抗；(3)熒光強度校準微球；(4)緩沖劑；（5)封片劑；(6)實驗操作與熒光強 度定量分析說明書。
[0006] 本發(fā)明所述的試劑盒中使用Hep-2細胞抗原片可采用市售的預制細胞抗原片，如 德國歐蒙公司醫(yī)學診斷有限公司、美國伯樂公司和北京和杰創(chuàng)新生物生物醫(yī)學科技有限公 司提供的，或可根據(jù)現(xiàn)有的文獻方法制備Hep-2細胞抗原片，例如《細胞培養(yǎng)抗原片的簡易 快速制備與應用》。
[0007] 本發(fā)明中所用的熒光標記二抗是黃綠熒光染料標記的抗人抗體（IgG+H)型，目前 用于抗核抗體間接免疫熒光檢測的熒光標記二抗的熒光染料為異硫氰酸熒光素 FITC(最 大激發(fā)波長：488nm，最大發(fā)射波長：525nm)，但是FITC光漂白效率過高，應用于本發(fā)明中 易導致的圖像采集條件的不一致性，從而造成圖像分析數(shù)據(jù)之間的可比性差，因此不適用 于本發(fā)明的定量檢測方法。本發(fā)明所用的熒光染料的特征性激發(fā)波長490nm左右，發(fā)射 波長為520nm左右，例如Alexa Fluor488 (最大激發(fā)波長：493nm，最大發(fā)射波長：518nm)、 Dylight488(最大激發(fā)波長：493nm，最大發(fā)射波長：518nm)等突光性能穩(wěn)定的突光染料。所 述的熒光染料標記的抗體是哺乳動物抗人（IgG+H)型抗體，優(yōu)選來源于羊的二抗。
[0008] 本發(fā)明的試劑盒提供了熒光強度校準微球，用于校準實際測量中不同儀器或不同 條件下獲得的顯微圖像的熒光強度值。本發(fā)明提供的熒光強度校準微球的特征在于其熒光 特性量值應符合所選擇熒光二抗的熒光特性范圍，即其激發(fā)波長范圍應為490nm左右，發(fā) 射波長520nm左右。所述熒光校準微球的熒光強度值和微球直徑的批內(nèi)變異系數(shù)均應小于 3%，突光標準微球的直徑為3-5 μ m。該突光校準微球可以由合適的任意材料制成，包括有 機材料，如聚苯乙烯、聚苯乙烯交聯(lián)DVB、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚葡萄糖等；或者無機材 料，如二氧化娃。本發(fā)明的試劑盒提供的突光強度校準微球為具有一系列突光強度值的微 球，本發(fā)明提供的熒光強度校準微球的熒光強度值為通過多臺熒光顯微鏡標定的灰度值。
[0009] 本發(fā)明提供的緩沖劑為磷酸鹽緩沖劑，此外也可以選擇其它緩沖鹽類，如檸檬酸 鹽、Tris-鹽酸等；pH值范圍是7. 2~7. 6,優(yōu)選是7. 4 ;濃度優(yōu)選是0. 01M。優(yōu)選洗滌過程 中加入1￥661120來減少抗原抗體的非特異性結(jié)合，1￥661120濃度是0.01%-0.1%(￥/￥)， 優(yōu)選是 0. 05% (w / V)。
[0010] 本發(fā)明提供的封片劑為50%緩沖液（0.5mol / L碳酸鹽緩沖液PH9.0~ 9. 5) +50 %甘油，此外也可以選擇其它類型也可以是市售的不同的封片劑類型，優(yōu)選含有抗 熒光淬滅劑，如P-苯二胺、η-丙基沒食子酸鹽、1，4-二偶氮雙環(huán)[2, 2, 2)-辛烷等，其中優(yōu) 選P-苯二胺。
[0011] 本發(fā)明的另一特征在于提供了一種新型的人血清抗核抗體定量檢測方法，其特征 在于通過顯微圖像灰度分析經(jīng)過間接免疫熒光反應的ifep-2細胞核熒光強度來表征人血 清中均質(zhì)型或斑點型抗核抗體濃度。本方法仍然是以抗核抗體檢測"金標準間接免疫反 應為基礎，但是采用了顯微圖像對檢測抗原片上ifep-2細胞核的熒光染色強度進行了分析 和定量，通過熒光強度的顯微圖像灰度值對應了不同濃度的血清抗核抗體。本發(fā)明提供的 方法具體流程是：根據(jù)試劑盒提供的（6)實驗操作與熒光強度定量分析說明書在Hep-2細 胞抗原片上進行間接免疫反應，步驟為：
[0012] 1.第一次孵育：在預制的H印-2細胞抗原片上滴加25 μ 1的I :100稀釋的檢測血 清，在室溫進行反應30分鐘，細胞抗原片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。
[0013] 2.用PBS+Tween20緩沖液沖洗掉存留血清液體，將抗原片放入ρΗ7· 4的 PBS+Tween緩沖液中浸泡5min，間或進行輕微震蕩。
[0014] 3.第二次孵育：在細胞抗原片上再次提交經(jīng)稀釋至染色效價如1 :8或1 :16的熒 光抗體，在室溫或37°C染色30分鐘，細胞抗原片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。
[0015] 4.用PBS+Tween20緩沖液沖洗掉存留的熒光抗體，將抗原片放入ρΗ7· 4的 PBS+Tween緩沖液中浸泡5min，間或進行輕微震蕩。
[0016] 5.加入用于突光強度校準的突光強度標準微球。
[0017] 6.用封片劑對封固，待進行熒光顯微鏡鏡檢。
[0018] 本發(fā)明使用的顯微鏡檢系統(tǒng)的特征在于帶有圖像拍攝系統(tǒng)的熒光顯微鏡系統(tǒng)。顯 微圖像拍攝的曝光時間設定為小于Is,優(yōu)選為600ms-800ms，更加優(yōu)選是800ms。在本發(fā)明 中，采用計算機分析軟件測定數(shù)字熒光強度，選測定面積為S>1000Pi Xel，測定選定對像內(nèi) 的平均灰度值來代表熒光強度。得到的樣本實測平均熒光灰度值和熒光強度校準微球的實 測平均熒光灰度值，根據(jù)試劑盒提供的熒光強度校準微球的標稱熒光強度值，通過下面公 式換算得到樣本的實際熒光灰度值：
【主權(quán)項】