1. 一種用于人血清中抗核抗體定量檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：（l)ifep-2細(xì)胞抗原 片；(2)熒光標(biāo)記二抗；（3)熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球；(4)緩沖劑；（5)封片劑；(6)實(shí)驗(yàn)操作與熒 光強(qiáng)度定量分析說明書。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于用于均質(zhì)型或斑點(diǎn)型抗核抗體的定量檢 測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中（l)Hep-2細(xì)胞抗原片為預(yù)制或市售的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中（2)熒光標(biāo)記二抗其特征在于所標(biāo)記熒光染料 為黃綠色熒光染料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光標(biāo)價(jià)二抗，其所標(biāo)記的熒光染料的特征在于最大激發(fā)波 長范圍488nm左右，最大激發(fā)波長范圍520nm左右。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的突光標(biāo)記二抗，其所標(biāo)記的突光染料的特征在于突光穩(wěn)定性 好，光漂白速率低。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5和6所述的熒光染料，優(yōu)選是Dylight488、Alexa Fluor488等。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中（2)熒光標(biāo)記二抗是抗人抗體（IgG+H)型抗體， 優(yōu)選是山羊抗人（IgG+H)型抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中（3)熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球的特征在于其熒光特性 量值應(yīng)符合所選擇熒光二抗的熒光特性范圍。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球，其直徑為5-10 μ m，批內(nèi)變異系數(shù)應(yīng)小 于3%。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球，可以為任意材料制成的，包括有機(jī)材 料，如聚苯乙烯、聚苯乙烯交聯(lián)DVB、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚葡萄糖等；或者無機(jī)材料， 如二氧化硅；優(yōu)選是聚苯乙烯。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中（4)緩沖劑可以是磷酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽 等，優(yōu)選是磷酸鹽緩沖劑；pH值范圍是7. 2~7. 6,優(yōu)選是7. 4。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中（5)封片劑是50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩 沖液pH9. 0~9. 5)甘油封固，也可以是市售的不同的封片劑類型，優(yōu)選含有抗熒光淬滅劑 的封片劑。
14. 一種新型的人血清中抗核抗體定量檢測(cè)方法，其特征在于通過顯微圖像灰度分析 經(jīng)過間接免疫熒光反應(yīng)的Ifep-2細(xì)胞抗原片上的細(xì)胞核熒光強(qiáng)度來表征人血清中均質(zhì)型 或斑點(diǎn)型抗核抗體濃度。具體流程是：根據(jù)試劑盒提供的（6)實(shí)驗(yàn)操作與熒光強(qiáng)度定量分 析說明書在ifep-2細(xì)胞抗原片上進(jìn)行間接免疫反應(yīng)，步驟為： (1) 第一次孵育：在預(yù)制的Hep-2細(xì)胞抗原片上滴加25 μ 1的1 : 100稀釋的檢測(cè)血 清，在室溫進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，細(xì)胞抗原片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。 (2) 第一次洗滌：用緩沖液沖洗掉存留血清液體，將抗原片放入緩沖液中進(jìn)行浸泡，間 或進(jìn)行輕微震蕩。 (3) 第二次孵育：在細(xì)胞抗原片上再次提交經(jīng)稀釋至工作濃度的熒光抗體，在室溫或 37°C染色30分鐘，細(xì)胞抗原片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。 (4) 第二次洗滌：用緩沖液沖洗掉存留的熒光抗體，將抗原片放入緩沖液中進(jìn)行浸泡， 間或進(jìn)行輕微震蕩。 (5) 加入用于突光強(qiáng)度校準(zhǔn)的突光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)微球。 (6) 用封片劑對(duì)封固，待進(jìn)行熒光顯微鏡鏡檢。 本發(fā)明采用的鏡檢系統(tǒng)必須是帶有圖像拍攝系統(tǒng)的熒光顯微鏡系統(tǒng)。通過圖像分析 軟件測(cè)定數(shù)字熒光強(qiáng)度，選測(cè)定面積為S > lOOOPixel，測(cè)定選定對(duì)像內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。 得到的樣本實(shí)測(cè)平均熒光灰度值和熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球的實(shí)測(cè)平均熒光灰度值，根據(jù)試劑盒 提供的熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球的標(biāo)稱熒光強(qiáng)度值，通過下面公式換算得到樣本的實(shí)際熒光灰度 值： 式中，I488-被測(cè)對(duì)象的熒光強(qiáng)度但；
Im-被測(cè)對(duì)象的實(shí)測(cè)值； Ib-背景值的實(shí)測(cè)讀數(shù)； Is-標(biāo)準(zhǔn)微球的實(shí)測(cè)讀數(shù)； Iu-標(biāo)準(zhǔn)微球的熒光強(qiáng)度確定值。 參考試劑盒中提供的（7)熒光強(qiáng)度定量分析說明書中的熒光灰度值和滴度對(duì)應(yīng)表（附 表1)得到檢測(cè)血清中抗核抗體的滴度。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第一次孵育中 滴加稀釋1 : 10-1 : 1000的檢測(cè)血清，優(yōu)選稀釋I : 100的檢測(cè)血清。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述滴加血清量是10-50 μ 1，優(yōu)選是25 μ 1。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第一次孵育反 應(yīng)溫度是20~40°C，優(yōu)選是35°C。
18. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第一次孵育反 應(yīng)時(shí)間是20~50分鐘，優(yōu)選是30分鐘。
19. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第一次洗滌的 浸泡時(shí)間為3~7分鐘，優(yōu)選是5分鐘。
20. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第二次孵育反 應(yīng)使用的熒光抗體被稀釋至染色效價(jià)1 : 4至1 : 32,優(yōu)選1 : 8和1 : 16。
21. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述稀釋的熒光抗體的滴加量是 10-50 μ 1，優(yōu)選是 20 μ 1。
22. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第二次孵育反 應(yīng)溫度是20~40°C，優(yōu)選是35°C。
23. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第二次孵育反 應(yīng)時(shí)間是20~50分鐘，優(yōu)選是30分鐘。
24. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述間接免疫熒光反應(yīng)的第二次洗滌的 浸泡時(shí)間為3~7分鐘，優(yōu)選是5分鐘。
25. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于顯微圖像拍攝的曝光時(shí)間小于1秒，優(yōu)選 是600-800毫秒，更加優(yōu)選是800毫秒。
26. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述（7)熒光強(qiáng)度定量分析說明書提供 了熒光灰度值和滴度對(duì)應(yīng)表（附表1)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于定量檢測(cè)勻質(zhì)型或斑點(diǎn)型抗核抗體的試劑盒和其使用方法。本試劑盒包括：(1)Hep-2細(xì)胞抗原片；(2)熒光標(biāo)記二抗；(3)熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球；(4)緩沖劑；(5)封片劑；(6)實(shí)驗(yàn)操作與熒光強(qiáng)度定量分析說明書。所述試劑盒中提供的(1)Hep-2細(xì)胞抗原片和(2)熒光標(biāo)記二抗與待測(cè)血清樣本進(jìn)行間接免疫熒光反應(yīng)，待測(cè)(1)Hep-2細(xì)胞抗原片中加入(3)熒光強(qiáng)度校準(zhǔn)微球，通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)并進(jìn)行顯微圖像拍攝，利用顯微圖像軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，根據(jù)所述試劑盒提供的(6)實(shí)驗(yàn)操作與熒光強(qiáng)度定量分析說明書將熒光強(qiáng)度值轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的血清抗核抗體滴度值，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)血清樣本中勻質(zhì)型或斑點(diǎn)型抗核抗體的定量檢測(cè)。
【IPC分類】G01N33-533
【公開號(hào)】CN104634962
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310553868
【發(fā)明人】劉瑛穎, 王晶, 隋志偉, 張玲
【申請(qǐng)人】中國計(jì)量科學(xué)研究院
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2013年11月11日